CN120683043A - 一种干细胞增殖促进剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种干细胞增殖促进剂及其制备方法和应用

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Abstract

本发明公开了一种干细胞增殖促进剂及其制备方法和应用，属于细胞培养技术领域。本发明的干细胞增殖促进剂为由氯化钙、磷酸氢二钾、磷酸氢钾、碳酸氢钠、氯化镁、氯化钠、硫酸钙、三羟甲基氨基甲烷、生物活性玻璃浸出液和水组成的溶液，含有生物活性玻璃中的生物活性成分，可显著提高间充质干细胞的增殖效率。本发明的干细胞增殖促进剂中无动物源成分且化学成分明确，仅含多种无机离子，不含有氨基酸、血清、激素、生长因子等有机成份，是一种纯无机成分的干细胞增殖促进剂。

Description

一种干细胞增殖促进剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及干细胞培养技术领域，具体涉及的是一种干细胞增殖促进剂及其制备方法和应用。
背景技术
干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体，主要来源于脐带、骨髓、外周血、胚胎及牙髓等，具有自我更新复制的潜能、多向分化潜能、旁分泌作用和归巢效应。利用干细胞替代因生理性衰亡而失去功能的细胞，可修复受损的组织和器官，并通过分泌细胞因子来调节免疫反应。
干细胞治疗是继小分子化学药、大分子蛋白药后的第三次药物革命。干细胞治疗依赖自体或异体来源的干细胞，经体外分离、培养再回输人体，以替代或修复受损的组织和器官，实现对多种疾病的治疗。
与工程细胞无限繁殖不同，干细胞会随着培养代数的增加，多能性逐渐降低，临床应用的最佳代数为4-6代之间。干细胞治疗最重要的指标是回输细胞数量，回输细胞数量越多治疗效果越好。人们一直在探索有限培养代数中收获到更多数量的高质量细胞。
用于干细胞治疗的间充质干细胞按GMP标准生产需要使用无动物源成份且化学成分明确、低内毒素的培养基成分。由化学法合成的无机盐类培养基添加剂完全符合上述要求。
间充质干细胞旁分泌产生的外泌体是一种直径30-150nm的纳米级囊泡，携带蛋白质、核酸(如miRNA、mRNA)、脂质等生物活性分子，具有低免疫原性、高生物相容性和肿瘤归巢能力，在疾病治疗中的应用潜力备受关注，尤其在组织修复和免疫调节等领域展现出独特优势，如骨关节炎、神经退行性疾病和糖尿病并发症。间充质干细胞外泌体对培养基有特殊要求，因外泌体内含有细胞因子、生长因子等蛋白大分子，培养基成分应尽可能避免使用其他来源的蛋白质大分子，以减轻分离纯化难度。所以化学法合成的无机盐类培养基添加剂促生长是最佳选择。
目前，暂时没有一款纯无机盐培养基添加剂在已有间充质干细胞培养基的基础上补充添加，仍可以有效促进干细胞生长。
发明内容
本发明的目的是一种干细胞增殖促进剂及其制备方法和应用，本发明的促进剂可促进干细胞增殖，提高每代干细胞增殖倍数，在现有培养技术的基础上进一步提高干细胞培养效率。
本发明提供的基于生物活性玻璃的间充质干细胞培养基添加剂，完全由无机盐组成，化学成分明确，安全可靠地提升间充质干细胞的扩增倍数。
本发明首先提供了一种干细胞增殖促进剂，其是由氯化钙、磷酸氢二钾、磷酸氢钾、碳酸氢钠、氯化镁、氯化钠、硫酸钙、三羟甲基氨基甲烷、生物活性玻璃浸出液和水组成的溶液。
上述的干细胞增殖促进剂中，以水的总体积计，所述氯化钙的浓度为0.1-0.2g/L；所述磷酸氢二钾的浓度为0.3-0.45g/L；所述磷酸氢钾的浓度为0.2-0.3g/L；所述碳酸氢钠的浓度为0.3-0.4g/L；所述氯化镁的浓度为0.1-0.2g/L；所述氯化钠的浓度为6.0-8.0g/L；所述硫酸钙的浓度为0.32-0.45g/L；所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为6.0-7.0g/L；
所述生物活性玻璃为45S5生物活性玻璃和/或pH中性生物活性玻璃；
所述干细胞增殖促进剂的pH值为7.2-7.4。
本发明进一步提供了一种干细胞增殖促进剂，其由氯化钙、磷酸氢二钾、磷酸氢钾、碳酸氢钠、氯化镁、氯化钠、硫酸钙、三羟甲基氨基甲烷、生物活性玻璃颗粒和水制备而成。
上述的干细胞增殖促进剂中，以水中的总体积计，所述氯化钙的用量为0.1-0.2g/L；所述磷酸氢二钾的用量为0.3-0.45g/L；所述磷酸氢钾的用量为0.2-0.3g/L；所述碳酸氢钠的用量为0.3-0.4g/L；所述氯化镁的用量为0.1-0.2g/L；所述氯化钠的用量为6.0-8.0g/L；所述硫酸钙的用量为0.32-0.45g/L；所述三羟甲基氨基甲烷的用量为6.0-7.0g/L；所述生物活性玻璃颗粒的用量为10-100g/L。
具体的的，以水中的总体积计，所述氯化钙的用量为0.1-0.2g/L；所述磷酸氢二钾的用量为0.3-0.45g/L；所述磷酸氢钾的用量为0.2-0.3g/L；所述碳酸氢钠的用量为0.4g/L；所述氯化镁的用量为0.1-0.2g/L；所述氯化钠的用量为6.0-8.0g/L；所述硫酸钙的用量为0.32-0.45g/L；所述三羟甲基氨基甲烷的用量为6.0-7.0g/L；所述生物活性玻璃颗粒的用量为100g/L。
上述的干细胞增殖促进剂中，所述生物活性玻璃颗粒为45S5生物活性玻璃颗粒和/或pH中性生物活性玻璃颗粒；
所述生物活性玻璃颗粒的粒径为4-75微米。
本发明还提供了上述干细胞增殖促进剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将所述氯化钙、磷酸氢二钾、磷酸氢钾、碳酸氢钠、氯化镁、氯化钠、硫酸钙、三羟甲基氨基甲烷溶于水中，调节溶液pH值为6.0-7.0；
(2)在步骤(1)得到的溶液中加入所述生物活性玻璃颗粒，加热搅拌，然后除去未溶解的生物活性玻璃颗粒，调节pH值为7.2-7.4，得到所述干细胞增殖促进剂。
上述的制备方法，步骤(1)中，所述水的温度为35-40℃；
采用盐酸溶液调节pH值。
上述的制备方法，步骤(2)中，所述加热搅拌的温度为35-40℃；
所述加热搅拌的时间为12-24小时，具体可为24小时；
步骤(2)中采用NaOH溶液调节pH值。
上述干细胞增殖促进剂在促进干细胞增殖中的应用也属于本发明的保护范围；
具体的，所述干细胞为间充质干细胞；所述促进干细胞增殖具体指的是提高干细胞培养一代的收获细胞数量。
所述促进干细胞增殖具体指的是提高了干细胞培养一代的收获细胞数量，按照培养基的标准细胞接种数量培养，收获细胞的数量显著提高。
最后，本发明提供了一种培养干细胞的方法，包括如下步骤：将所述干细胞增殖促进剂以干细胞增殖促进剂和干细胞培养基体积比1/20-1/100加入干细胞培养基中培养干细胞。
具体的，所述干细胞增殖促进剂和干细胞培养基的体积比为1/20-1/150，更具体可为1/20-1/100或1/50。
实验证明，本发明按20～100倍稀释度添加到商品培养基中可显著增加培养效率。
本发明的干细胞增殖促进剂的成分均为无机盐，不含任何有机成分，化学组成明确，安全可靠；其对干细胞有很好的增殖促进作用。
附图说明
图1为干细胞增殖促进剂对小鼠骨髓间充质干细胞的增殖促进作用。
图2为干细胞增殖促进剂对人源脐带间充质干细胞的增殖促进作用。
图3为实施例3中添加或不添加干细胞增殖促进剂对人源脐带间充质干细胞培养形态的照片。
图4为对比例1的无生物活性玻璃成份的干细胞增殖促进剂对人源脐带间充质干细胞的增殖促进作用。
图5为对比例2的以PBS溶液浸提生物活性玻璃制备的干细胞增殖促进剂对人源脐带间充质干细胞的增殖促进作用。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
以下实施例中的定量试验，如无特殊说明均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例所用45S5生物活性玻璃颗粒购自德国肖特(SCHOTT)；货号1137402，粒径4.0微米，组成为45.0wt％SiO2、24.5wt％Na2O、24.5wt％CaO、6.0wt％P2O5；pH中性生物活性玻璃购自华魁科技泰州有限公司，货号1101045075，粒径45-75微米，组成29.1wt％CaO，48.2wt％SiO2和22.7wt％P2O5。
实施例1、干细胞增殖促进剂的制备
本实施例的干细胞增殖促进剂的制备方法如下：
(1)去离子水加热至37℃，按照下表1比例依次在去离子水中加入氯化钙、磷酸氢二钾、磷酸氢钾、碳酸氢钠、氯化镁、氯化钠、硫酸钙和三羟甲基氨基甲烷，搅拌至全部溶解；
(2)用1mol/L的盐酸调节步骤(1)混合溶液pH至6.0，获得弱酸性溶液；
(3)在步骤(2)得到的弱酸性溶液中加入生物活性玻璃颗粒37℃搅拌24h；
(4)用400目滤网过滤去除生物活性玻璃颗粒；
(5)以1mol/L的NaOH调整pH至7.2-7.4；
(6)用0.22微米孔径的无菌滤膜过滤除菌，制得干细胞增殖促进剂。
表1、干细胞增殖促进剂配方表
配方1：生物活性玻璃为pH中性生物活性玻璃
配方2：生物活性玻璃为45S5，因含Na离子，相应减少氯化钠的浓度。
表1中各物质的用量为各物质的质量和水的体积比。
实施例2、促进小鼠骨髓间充质干细胞增殖
在小鼠骨髓间充质干细胞全合成无血清培养基(华龛3D间充质干细胞无血清基础培养基)中先加入配套的培养基添加剂(3D间充质干细胞无血清培养基添加剂)，再以1/50稀释比例(体积比)加入实施例1制备的干细胞增殖促进剂配方1和配方2。
以8000个/cm2初始接种密度将P2代小鼠骨髓间充质干细胞(赛百慷(上海)生物技术股份有限公司，MIC-iCell-s018)接种至培养瓶面积为75cm2的细胞培养瓶，在37℃、5％二氧化碳浓度中培养48h至P3代，将贴壁干细胞消化成悬浮细胞液，全部收集，统计收获的干细胞总数量，按如下公式计算干细胞增殖倍数。
比较P2-P3代干细胞增殖倍数的区别，数据结果如图1所示。未加干细胞促进剂的3个实验组做空白对照组，P2-P3代增殖倍数平均为9.47；加入干细胞增殖促进剂配方1的8个实验组的细胞增殖倍数平均为13.17，是对照组的1.39倍；加入干细胞增殖促进剂配方2的8个实验组的细胞增殖倍数平均为11.09，是对照组的1.17倍。实验结果表明，本发明提供的干细胞增殖促进剂可显著提高小鼠骨髓间充质干细胞的增殖活性。
实施例3、促进人源脐带间充质干细胞增殖
人源脐带间充质干细胞全合成无血清培养基(友康GMP级间充质干细胞无血清培养基基础NC0106)中先加入配套的培养基添加剂(GMP级间充质干细胞无血清培养基添加剂NC0106.S)，再以1/50稀释比例(干细胞增殖促进剂和培养基的体积比)加入实施例1配方2制备的干细胞增殖促进剂。
以8000个/cm2密度接种P3代人源脐带间充质干细胞(来源于国家干细胞资源库hUC-MSC-22005)至75cm2细胞培养瓶，其他步骤与实施例2一致，数据结果如图2所示，干细胞培养状态如图3所示。未加干细胞促进剂的3个空白对照组，P3-P4代增殖倍数为6.67；加入干细胞增殖促进剂的实验组的细胞增殖倍数为8.74，是对照组的1.31倍。加入干细胞增殖促进剂培养的干细胞与空白对照组的细胞形态一致。实验结果表明，本发明提供的干细胞增殖促进剂可显著提高人源脐带间充质干细胞的增殖活性。
实施例4
以1/10、1/20、1/50、1/100、1/200稀释比例(促进剂和培养基的体积比)加入实施例1配方1，其他实验条件同实施例3，平行三组实验，结果如下表2所示。
表2不同稀释倍数细胞增殖数据
序号 实验组(稀释度梯度) 细胞增殖倍数均值 标准差
1 1/10 4.63 0.451
2 1/20 7.92 0.278
3 1/50 8.74 0.119
4 1/100 7.33 0.082
5 1/200 6.67 0.127
6 空白对照组 6.67 0.106
本实施例表明，本发明按1/50稀释比例添加对人源脐带间充质干细胞促增殖作用最显著，1/100稀释比例添加也有较为显著的效果，但按1/200稀释度添加时的增殖倍数和空白对照组一致，说明低浓度对干细胞没有显著促进作用。当以1/10的稀释度添加时，因添加比例高，改变了培养基其他成分的浓度，对细胞增殖不利。因此，本发明的使用浓度是1/20-1/100稀释度加入间充质干细胞培养基中，可对细胞增殖起显著促进作用。
对比例1、不含生物活性玻璃的干细胞增殖促进剂
按实施例1所述配方1和制备方法制备不含生物活性玻璃的干细胞增殖促进剂，按实施例3的方法试验进行促进人源脐带间充质干细胞增殖，结果如图4所示。实验组细胞增殖倍数为6.37和对照组的6.41差别不显著。
本对比例说明含生物活性玻璃的干细胞增殖促进剂对干细胞增殖起促进作用。
对比例2、以PBS缓冲液提取生物活性玻璃
以PBS缓冲液加入pH中性生物活性玻璃颗粒，生物活性玻璃颗粒的质量和PBS缓冲液的体积比为100g/L，37℃搅拌24h；
(4)用400目滤网过滤去除生物活性玻璃颗粒；
(5)以1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH调整pH至7.30；
(5)用0.22微米孔径的无菌滤膜过滤除菌，制得干细胞增殖促进剂。
按实施例3测试促细胞增殖的效果，实验结果如图5所示。由图5可知，实验组细胞增殖倍数和对照组差别不显著。这说明本发明所提出的弱酸性溶液提取生物活性玻璃及其配套提取工艺才能制备出促进干细胞增殖的促进剂。

Claims (10)

1.一种干细胞增殖促进剂，其是由氯化钙、磷酸氢二钾、磷酸氢钾、碳酸氢钠、氯化镁、氯化钠、硫酸钙、三羟甲基氨基甲烷、生物活性玻璃浸出液和水组成的溶液。
2.根据权利要求1所述的干细胞增殖促进剂，其特征在于：以水的总体积计，所述氯化钙的浓度为0.1-0.2g/L；所述磷酸氢二钾的浓度为0.3-0.45g/L；所述磷酸氢钾的浓度为0.2-0.3g/L；所述碳酸氢钠的浓度为0.3-0.4g/L；所述氯化镁的浓度为0.1-0.2g/L；所述氯化钠的浓度为6.0-8.0g/L；所述硫酸钙的浓度为0.32-0.45g/L；所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为6.0-7.0g/L；
所述生物活性玻璃为45S5生物活性玻璃和/或pH中性生物活性玻璃；
所述干细胞增殖促进剂的pH值为7.2-7.4。
3.一种干细胞增殖促进剂，其由氯化钙、磷酸氢二钾、磷酸氢钾、碳酸氢钠、氯化镁、氯化钠、硫酸钙、三羟甲基氨基甲烷、生物活性玻璃颗粒和水制备而成。
4.根据权利要求3所述的干细胞增殖促进剂，其特征在于：以水中的总体积计，所述氯化钙的用量为0.1-0.2g/L；所述磷酸氢二钾的用量为0.3-0.45g/L；所述磷酸氢钾的用量为0.2-0.3g/L；所述碳酸氢钠的用量为0.3-0.4g/L；所述氯化镁的用量为0.1-0.2g/L；所述氯化钠的用量为6.0-8.0g/L；所述硫酸钙的用量为0.32-0.45g/L；所述三羟甲基氨基甲烷的用量为6.0-7.0g/L；所述生物活性玻璃颗粒的用量为10-100g/L。
5.根据权利要求3或4所述的干细胞增殖促进剂，其特征在于：所述生物活性玻璃颗粒为45S5生物活性玻璃颗粒和/或pH中性生物活性玻璃颗粒；
所述生物活性玻璃颗粒的粒径为4-75微米。
6.权利要求3-5中任一项所述干细胞增殖促进剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将所述氯化钙、磷酸氢二钾、磷酸氢钾、碳酸氢钠、氯化镁、氯化钠、硫酸钙、三羟甲基氨基甲烷溶于水中，调节溶液pH值为6.0-7.0；
(2)在步骤(1)得到的溶液中加入所述生物活性玻璃颗粒，加热搅拌，然后除去未溶解的生物活性玻璃颗粒，调节pH值为7.2-7.4，得到所述干细胞增殖促进剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述水的温度为35-40℃；
采用盐酸溶液调节pH值。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述加热搅拌的温度为35-40℃；
所述加热搅拌的时间为12-24小时；
步骤(2)中采用NaOH溶液调节pH值。
9.权利要求1-5中任一项所述干细胞增殖促进剂在促进干细胞增殖中的应用；
具体的，所述干细胞为间充质干细胞。
10.一种培养干细胞的方法，包括如下步骤：将权利要求1-5中任一项所述的干细胞增殖促进剂以体积比1/20-1/100稀释加入干细胞培养基中培养干细胞。
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