CN121287601A - 透皮肽重组人源化ⅲ型胶原蛋白水凝胶及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本申请属于药剂领域，具体地，提供了一种透皮肽重组人源化Ⅲ型胶原蛋白水凝胶，其特征在于，所述水凝胶包含透皮肽重组人源化Ⅲ型胶原蛋白、海藻糖、丙二醇、卡波姆、三乙醇胺和去离子水。与传统胶原蛋白敷料相比，本发明的水凝胶不仅生物活性高，且具备较好的热稳定性和抗降解性能，能够长期稳定地作用于创伤部位，促进组织再生及功能恢复。

Description

透皮肽重组人源化Ⅲ型胶原蛋白水凝胶及其制备和应用

技术领域

本申请属于药剂领域，具体地，本申请提供了一种透皮肽重组人源化Ⅲ型胶原蛋白水凝胶及其制备和应用。

背景技术

皮肤作为人体面积最大的器官，承担着重要的屏障、防护等功能。皮肤损伤或创伤不仅影响美观，还可能引发感染或其他并发症。皮肤创伤的治疗一直是医学领域中的重大挑战，如何加速创伤的愈合过程，促进皮肤细胞的增殖和组织再生，一直是临床医学研究的核心问题。目前，常用的创伤敷料包括纱布、海绵、传统凝胶敷料等。这些常规敷料虽然能在一定程度上提供物理保护，防止外界细菌入侵，但其生物活性较低，缺乏促进创伤愈合的活性成分，无法有效加速创伤部位细胞增殖和组织修复，导致创伤愈合时间较长，且创伤愈合过程中可能伴随并发症。

尤其是传统胶原蛋白敷料，常常来源于动物组织（如牛、猪等），这些胶原蛋白的提取过程通常需要复杂的工艺，并且可能存在批次差异较大、潜在致敏、病原污染等风险。此外，动物来源的胶原蛋白材料的生物相容性较差，降解速度过快或过慢都可能影响其在创伤修复中的效果，这些问题限制了传统胶原蛋白在临床中的广泛应用。

近年来，基因工程技术的快速发展为胶原蛋白的生产提供了新的解决方案。以基因工程技术来制备的重组胶原蛋白具有较高的纯度、更好的生物相容性，并且能够有效避免来自动物的病原污染和过敏反应，在临床应用中具有更多的空间，更适合用于医疗、创伤修复等领域。

然而，现有的重组胶原蛋白材料虽然在生物相容性和安全性方面取得了显著进展，但其在创伤治疗中的应用仍面临一些挑战。例如，重组胶原蛋白原料易降解，现有重组胶原蛋白材料通常存在凝胶结构不稳定的问题，尤其在体温（37 ℃）下，容易发生物理降解或流动，导致水凝胶在创伤部位的作用时间较短，从而影响治疗效果。这大大降低了其在临床应用中的效果。

因此，开发一种具有帮助创伤恢复，有效提高现有胶原蛋白原料缺陷的重组胶原蛋白水凝胶显得尤为重要。本发明正是针对现有技术的不足，结合基因工程技术、材料科学及生物医学领域的最新进展，通过优化水凝胶的成分和制备工艺，成功研发出一种具有高热稳定性和生物活性的透皮肽重组人源化Ⅲ型胶原蛋白水凝胶。该水凝胶能够显著促进创伤部位的细胞增殖，帮助加速创伤的愈合。与传统胶原蛋白敷料相比，本发明所提供的重组胶原蛋白水凝胶不仅具有更高的稳定性和生物相容性，还能在皮肤表面长期稳定作用于创伤部位。

发明内容

针对上述情况，一方面，本申请提供了一种透皮肽重组人源化Ⅲ型胶原蛋白水凝胶，所述水凝胶包含透皮肽重组人源化Ⅲ型胶原蛋白、海藻糖、丙二醇、卡波姆、三乙醇胺和去离子水。

进一步地，所述水凝胶包含透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白0.01-0.4 mg/mL、海藻糖4-6wt %、丙二醇0.5-1.5 wt %、卡波姆0.3-0.5 wt %、三乙醇胺0.15-0.3 wt %。

进一步地，所述水凝胶由0.02-0.2 mg/mL的透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白、5wt %的海藻糖、1 wt %的丙二醇、0.4 wt %的卡波姆、0.25 wt %的三乙醇胺以及余量的去离子水组成。

进一步地，所述水凝胶 的制备方法包括：

将透皮肽重组人源化Ⅲ型胶原蛋白、海藻糖溶于适量的去离子水中，搅拌至完全溶解，形成溶液A；

将丙二醇、卡波姆混合后加入适量的去离子水，搅拌均匀形成溶液B；

将溶液A缓慢加入溶液B中，充分搅拌后，缓慢滴加三乙醇胺，调节混合溶液的pH值至7.0-7.3；

将上述混合液室温静置，最终形成稳定的水凝胶。

进一步地，所述透皮肽重组人源化Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

另一方面，本申请提供了上述水凝胶的制备方法。

另一方面，本申请提供了上述水凝胶在制备治疗皮肤创伤的药物中的应用。

另一方面，本申请提供了上述水凝胶在制备皮肤护理的药物中的应用。

进一步地，所述药物为外用药物。

进一步地，所述药物中上述水凝胶含量为10v/v%以上。

进一步地，所述药物中还包含药学上可接受的赋形剂和/或基质。

上述药学上可接受的赋形剂选自但不限于溶剂、助溶剂、抗氧化剂、pH调节剂、渗透压调节剂等，所述基质选自但不限于无纺布、膜基质、硅胶基质、明胶基质等。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）利用基因重组技术获得的透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白，生物活性高、安全性好，避免了传统胶原蛋白可能的病原污染风险；

（2）辅以海藻糖、丙二醇、卡波姆等辅料，本发明制备的水凝胶在42 ℃条件下具有明显的热稳定性，结构稳定、不易降解，确保水凝胶在皮肤表面长期能有效作用于创伤部位；

（3）细胞增殖实验和动物创伤模型实验证实，本发明的水凝胶能够显著提高创伤部位细胞的增殖活性，第7天及第11天时创伤面积显著减小，创伤修复效果明显；

（4）制备过程简单高效，易于工业化生产，具有广阔的临床应用前景，适用于各类皮肤创伤等创面修复。

附图说明

图1为透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白分子量鉴定及纯度分析图，其中A部分：透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白SDS-PAGE分析图；M：蛋白标准分子量，X5：稀释5倍上样，X10：稀释10倍上样，BSA：市售牛血清白蛋白；B部分：透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白分子量检测图；单电荷离子（[M+H]⁺）时 m/z ≈ 分子量 (Da)即21,477 Da，m/z 值减半时为 [M+2H]²⁺ 双电荷峰；C部分：透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白高效液相色谱分析图。

图2为透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白圆二色谱图，其中A部分：透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白浓度为10 μmol/L，pH为6.2时圆二色谱图，其中poly (L-proline) type II helix为胶原蛋白左手螺旋结构特征；B部分：透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白浓度为10 μmol/L，pH为7.2时圆二色谱图。

图3为扫描电镜分析透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白微观结构图，其中a部分为放大200倍微观结构；b部分为放大400倍微观结构。

图4为皮肤过敏性反应检测结果。

图5为细胞增殖实验（透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白与市售重组Ⅲ型胶原蛋白及实验室自表达重组Ⅲ型胶原蛋白比较）结果，其中a部分：市售蛋白与透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白对HaCaT细胞增殖的影响；b部分：重组Ⅲ型胶原蛋白与透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白对HaCaT细胞增殖的影响。

图6为透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶42 ℃高温实验结果。

图7为溶血实验（定性）结果图。

图8为溶血实验（定量）结果图。

图9为细胞增殖实验（透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶与透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白比较）结果图。

图10为细胞增殖实验（透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶与水凝胶基质比较）结果图。T-test 显著性分析其具体星级对应关系为：*差异达到显著水平（p<0.05)，**差异达到非常显著水平（p<0.01)，***差异达到极显著水平（p<0.001).

图11为以水凝胶基质为对照的小鼠创伤恢复实验（雌鼠）结果图。

图12为以水凝胶基质为对照的小鼠创伤恢复实验（雄鼠）结果图。

图13为以有效浓度为0.2 mg/mL的透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶为对照的小鼠创伤恢复实验结果图。

具体实施方式

实施例1：透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白的分子量及纯度分析

透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白的制备方法参见2025年1月19日申请的ZL202510036285.2中的实施例1，简言之：

透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白氨基酸序列为（SEQ ID NO.1）：

FEGPASRPGFPGMKGHRGFDGRNGEKGETGAPGLKGENGLPGENGAPGPMGPRGAPGERGRPGLPGAAGARGNDGARGSDGQPGPPGPPGTAGFPGSPGAKGEVGPAGSPGSNGAPGQRGEPGPQGHAGAQGPPGPPGINGSPGGKGEMGPAGIPGAPGLMGARGPPGPAGANGAPGLRGGAGEPGKNGAKGEPGPRGERGEAGIPGVPGAKGEDGKDGSPGEPGANG

透皮肽氨基酸序列（SEQ ID NO.2）：

FEGPASR

胶原蛋白氨基酸序列（SEQ ID NO.3）：

PGFPGMKGHRGFDGRNGEKGETGAPGLKGENGLPGENGAPGPMGPRGAPGERGRPGLPGAAGARGNDGARGSDGQPGPPGPPGTAGFPGSPGAKGEVGPAGSPGSNGAPGQRGEPGPQGHAGAQGPPGPPGINGSPGGKGEMGPAGIPGAPGLMGARGPPGPAGANGAPGLRGGAGEPGKNGAKGEPGPRGERGEAGIPGVPGAKGEDGKDGSPGEPGANG

将含有SEQ ID NO.1序列的重组质粒通过化学转化法转化至毕赤酵母GS115菌株中并筛选可表达工程菌，使用可表达工程菌株表达透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白，收集发酵液以备后续纯化。

将经过Q与SP离子交换柱纯化后的透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白，透析至25 mmol/LNaCl，10 mmol/L Tris pH 7.2，通过10 kDa超滤浓缩管将样品浓缩至2-2.5 mg/mL，进行冷冻干燥。冷冻干燥的透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白送至科研狗仪器测试平台（委托天津希达里检测科技有限公司）进行检测，用1 μL样品，自然风干，再加1 μL基质，自然风干；仪器为基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱（MALDI-TOF），型号为Ultraflextreme；基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA），测试模式为正谱，激光能量为100 %，测试分子量范围为10-100kDa。另将经过离子交换柱纯化后经冷冻干燥的透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白使用dd H2O溶解，于13,000 rpm 4 ℃冷冻离心后使用高效液相色谱分析，仪器型号为岛津LC-2030 Plus；流动相A：超纯水：三氟乙酸(TFA) = 99.9 %：0.1 %，流动相B：甲醇：超纯水：TFA = 80 %：19.9%：0.1 %，透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白上样10 μL进行梯度洗脱；使用岛津LC-2030 Plus数据处理软件分析。

如图1所示，SDS-PAGE胶图条带透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白大小表观分子量为25kDa，条带单一；经过MALDI-TOF测试透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白的分子量为21,477 Da。使用岛津LC-2030 Plus数据处理软件分析透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白纯度，根据面积归一化法，显示纯度为95 %。

实施例2：透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白的圆二色谱扫描实验

将经过离子交换柱纯化后经冷冻干燥的透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白分别使用Buffer A（135 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L PBS pH 7.2）和Buffer B（135mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L PBS pH 6.2）进行溶解，使用7 kDa透析袋将透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白分别透析至Buffer A和Buffer B中，4 ℃过夜透析后于13,000 rpm4 ℃离心1 h，取上清液使用10 kDa超滤浓缩管进行浓缩，通过SDS-PAGE进行定量，制备浓度为10 μM的样品。以Buffer A和Buffer B为对照，将pH 6.2和pH 7.2下的透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白使用型号为Chirascan qCD的圆二色CD(circular dichroism) 光谱仪进行圆二色光谱扫描，波长范围为190 ~ 240 nm，每个样品扫描3次，通过数据处理软件将Buffer值扣除，得到透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白CD图谱。

图2展示了透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白的圆二色图谱，在pH 6.2和pH 7.2的buffer中，透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白在197 nm处有一个负吸收峰，具有左手螺旋[poly (L-proline) type II helix]特征，此符合胶原蛋白的圆二谱图特征。生理条件pH为7.2，而在pH为6.2时，其二级结构并未发生明显改变，仍具有胶原蛋白的典型特征，说明在一定pH变化时，透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白具有稳定性，能够在添加辅料时维持胶原蛋白原有的结构，从而维持胶原蛋白特定的功能，使制备的产品如水凝胶带有胶原蛋白特性。

实施例3：透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白原料表面微观形貌分析

准备硅台，将表面使用无水乙醇擦拭干净，将硅台贴上导电胶，取冻干透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白均匀铺在导电胶上，并将多余冻干蛋白使用吸眼球吹走，然后进行镀金，使用日立冷场发射式扫描电镜对透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白进行成像，观察其表面微观形貌。

使用扫描电镜在200、400的放大倍数下观察透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白的结构。 图3展示了透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白原料的表面微观结构，本发明所使用的透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白原料冻干样品中以片层网状结构形态存在，片状结构面积大，表面较粗糙，并有大量孔隙，网状结构维持了足够的力学支撑，表明其在生物医疗方面具有结构支撑功能的潜力。

实施例4：透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白体外变态皮肤反应

豚鼠备皮：

测试所用豚鼠为健康、初成年的豚鼠，试验开始时体重应为300 g~500 g，雌雄不限，如雌鼠应未产并无孕。实验前使用市售动物剃毛刀将豚鼠背部左侧皮肤处毛发提前一天剃除，裸露皮肤范围约为 4 cm × 4 cm 以备24 h 后进行首次激发给药。

给药：

将冻干后的透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白用 PBS 进行溶解并使用 0.22 μm 滤头过滤除菌。在豚鼠背部左侧剃毛处进行给药：涂抹1 mL浓度为0.2 mg/mL 的透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白，待蛋白溶液晾干后，使用无菌纱布对给药处进行固定，时间为6 h，期间观察豚鼠状态。给药24±2 h及48±2 h后分别对给药处进行皮肤状态记录。

以初次给药48 h 后的两周时间为首次激发结束，并对豚鼠进行再次激发，同步骤一一样，选用豚鼠背部右侧区域进行备皮给药，再次激发给药时将透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白浓度提高至1 mg/mL，同样给药1 mL，蛋白溶液晾干后用无菌纱布固定6 h，并于第24±2h及48±2 h时对豚鼠背部右侧给药处进行观察记录并总结评分等级。

表1：化妆品安全技术规范——体外变态皮肤反应评分表

依照化妆品安全技术规范——体外变态皮肤反应评分表，对豚鼠皮肤进行评分。无论在给药激发的48±2 h内还是在再次给药激发的48±2 h内，豚鼠皮肤表面均未出现红斑及水肿的现象，符合安全标准。

图4展示了通过皮肤过敏性反应实验来评估透皮肽重组人源化Ⅲ型胶原蛋白的过敏性。实验使用豚鼠模型，进行首次和二次给药刺激，首次给药时，所使用的透皮肽重组人源化Ⅲ型胶原蛋白的浓度为0.2 mg/mL，二次给药时，透皮肽重组人源化Ⅲ型胶原蛋白的浓度提升至1 mg/mL。每次给药后观察豚鼠的皮肤反应，包括红斑和水肿的发生情况，并记录在24小时和48小时后的反应。实验结果表明，在首次给药（0.2 mg/mL）后未观察到明显的红斑或水肿反应，而在二次给药（1 mg/mL）后，皮肤反应无显著变化，说明该透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白未能引发过敏反应，具有较好的皮肤耐受性。

实施例5：细胞增殖实验（透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白与市售重组Ⅲ型胶原蛋白及实验室自表达重组Ⅲ型胶原蛋白比较）

HaCaT细胞准备

使用含有10 %胎牛血清及1 %青链霉素双抗的完全培养基对HaCaT进行复苏并传代，每代生长时间约为3天。待细胞稳定（约3代）后进行细胞计数，计数后的细胞使用培养基进行稀释至细胞浓度为1×10⁵个/mL于96孔板中进行铺板每孔铺入100 μL细胞悬液，并在37℃细胞培养箱中培养24 h以备后续实验使用。

药物刺激及CCK-8检测

定量透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白、市售重组Ⅲ型胶原蛋白及实验室自表达重组Ⅲ型胶原蛋白后，在生物安全柜中对蛋白使用0.22 μm滤头进行过滤除菌。选用浓度梯度为0、0.025 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL及0.2 mg/mL的蛋白对96孔板中的细胞进行给药，每个浓度设置6组重复。

实验时先将96孔板中的培养基吸出，再重新向96孔板中加入稀释好的实验样品及对照样品100 μL并重新放入37 ℃细胞培养箱中培养24 h后进行CCK-8检测。

配置CCK-8反应试剂：每95 μL培养基中加入5 μLCCK-8试剂，混匀后以备用。将96孔板中的PBS及实验组中的培养基吸出后向其中每孔中加入100 μL反应试剂，于37 ℃细胞培养箱中反应30 min后取出，使用酶标仪检测450 nm处的吸光度。获得数据后进行细胞活力计算。

图5显示了透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白与市售重组Ⅲ型胶原蛋白及实验室自表达重组Ⅲ型胶原蛋白在细胞增殖实验中的对比效果。实验中，使用不同来源的重组胶原蛋白对HaCaT细胞进行刺激，观察其在24小时内的细胞增殖情况。通过CCK-8检测细胞活性，结果表明，透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白对细胞增殖的促进效果优于市售重组Ⅲ型胶原蛋白和自表达重组Ⅲ型胶原蛋白，表明其在创伤修复和细胞生长促进方面具有显著优势。

实施例6 透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶的制备

参考奥硝唑凝胶这一药物的制备材料，选用其中最主要的成分：卡波姆（增稠）、丙二醇（保湿）、三乙醇胺（pH调节）及海藻糖（稳定蛋白结构）制备凝胶基质后添加胶原蛋白，进行透皮肽重组人源化Ⅲ型胶原蛋白水凝胶的初步尝试配置。

制备过程中发现pH偏高，而皮肤的正常pH值通常在4.5至5.5之间，试剂中三乙醇胺为碱性pH值为10.5-11.5 (25 ℃, 0.1 mol/L水溶液)，卡波姆为酸性pH值为2.8-3.2，因此选择在低卡波姆浓度条件下探究三乙醇胺浓度，尝试找出在pH合适条件下三乙醇胺的浓度。

因此进行以下配比优化：

表2：各组分配比优化表（wt%计算）

在pH检测过程中发现使用0.25 %三乙醇胺、0.4 %卡波姆、1 %丙二醇及5 %海藻糖时，基质的pH值为7.28处于中性状态，较为适合人体皮肤，因此选用以上配比。

确定透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）将透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白、海藻糖溶于适量去离子水，搅拌至完全溶解，获得均匀溶液A；

（2）将丙二醇、卡波姆混合后加入适量去离子水，室温条件下搅拌均匀获得溶液B；

（3）将溶液A缓慢加入溶液B中，充分搅拌后缓慢滴加三乙醇胺，调节混合溶液pH至7.0-7.3；

（4）将上述混合液室温静置，最终形成均匀稳定的水凝胶。

上述制备方法中，各成分的优选配比为：透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白0.02-0.2 mg/mL、海藻糖5wt %、丙二醇1 wt %、卡波姆0.4 wt %、三乙醇胺0.25 wt %，余量为去离子水。

实施例7：透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶的高温稳定性试验

选用有效浓度为0.2 mg/mL透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白进行水凝胶制备，将配置好的透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶放入42 ℃的恒温箱中进行静置。对处于42 ℃恒温培养箱中的透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶进行取样：按照统一重量（0.4 g）每24 h对水凝胶进行取样并加入100 μL Loading Buffer混匀并进行SDS-PAGE。

图6展示了透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶在42℃恒温环境下的高温稳定性测试结果。在实际应用中，创伤敷料需要具备良好的热稳定性，能够承受体温及外界温度变化的影响，保证其在使用过程中不发生降解。实验中，将透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶置于42℃恒温箱中，按一定时间间隔取样并进行SDS-PAGE分析，观案其结构条带是否保持稳定。实验结果表明，透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶在42 ℃下维持了良好的结构稳定性条带大小一致，未发生明显的降解或变形，说明该水凝胶具备较强的热稳定性，适合用于临床创伤治疗。

实施例8：透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶的溶血实验

4 % (v/v)红细胞混悬液的制备

取购自南京森贝伽生物科技有限公司的无菌脱纤维兔血，加入0.9 %氯化钠溶液约10倍量，摇匀，每分钟1000～1500转离心15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用0.9 %氯化钠溶液按上述方法洗涤2～3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用0.9 %氯化钠溶液制成4 % (v/v)的混悬液，供试验用。

溶血实验

定性

将配置好有效浓度为0.2 mg/mL的透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶使用PBS进行稀释至水凝胶含量分别为5 %、10 %、20 %、30 %及50 %（对应的透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白浓度分别为0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL及0.1 mg/mL），以 PBS 作为阴性对照（无溶血），10 % Triton X-100 作为阳性对照（完全溶血）。在1.5 mL EP管中分别加入200 μL 4% (v/v)的红细胞混悬液，并在每管中分别加入200 μL稀释后的透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶、PBS及10 % (v/v) Triton X-100。将EP管中血液及样品进行混匀后使用低温低速离心机于4 ℃ 1000 rpm进行离心3 min。肉眼观察溶血现象，若孔中溶液呈澄明红色，管底无细胞残留或有少量红细胞残留，表明有溶血发生；若红细胞全部下沉，上清液无色澄明，表明没有溶血发生。实验结果显示，当水凝胶含量 ≤10 % 时（胶原蛋白浓度≤0.02 mg/mL），样品未引起红细胞裂解；而当水凝胶含量>10 % 时（胶原蛋白浓度>0.02mg/mL），溶血程度随水凝胶含量的增加而升高。

定量

在定性溶血实验的基础上，我们对透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶的溶血程度进行了定量实验。

同样使用有效浓度为0.2 mg/mL的透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶，在水凝胶含量上我们选择使用PBS进行稀释至5 %、10 %、20 %及30 %（对应的透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白浓度分别为0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL及0.06 mg/mL）。以 PBS 作为阴性对照（无溶血），10 % (v/v) Triton X-100 作为阳性对照（完全溶血），且每个浓度设置三组重复。

在1.5 mL EP管中分别加入100 μL 4% (v/v)的红细胞混悬液后将以上对照组及实验组分别取100 μL 加入EP管中，混匀后将EP管置于恒温箱中孵育1 h，培养条件设置为37 ℃。1 h后取出EP 管使用低温高速离心机设置温度为4 ℃，于12000 rpm进行离心，时间约为5 min。离心结束后小心吸取100 μL上清液至新96孔板中，使用酶标仪检测OD540 nm处的吸光度，并对数据进行处理。

依据《中国药典》中规定药物溶血率应小于5 %，结合实验结果表明透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶完全符合要求。

图7展示了通过定性溶血实验评估透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶的血液相容性。在不同浓度(5 %、10 %、20 %、30 %、50 %)的透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶与红细胞混合后，观察红细胞是否发生溶解。此实验的目的是评估该水凝胶在临床应用中的安全性，确保其不会引发溶血反应，避免对血液系统造成不良影响。图中通过目测溶液的澄清度来判断溶血情况。实验结果显示，当水凝胶浓度为10 %及以下时，未观察到溶血现象;而当水凝胶浓度高于10 %时，溶血程度逐渐增加。该结果表明，透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶在较低浓度下对红细胞没有溶血作用，符合体外血液相容性的安全要求。

图8展示了溶血实验的定量分析结果。通过测量不同浓度透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶与红细胞悬浮液混合后的上清液吸光度(OD540 nm)，定量分析溶血的程度。根据《中国药典》规定，药物的溶血率应低于5 %。实验结果表明，水凝胶浓度为10 %以下时，溶血率几乎为零，未观察到显著的溶血现象。随着水凝胶浓度的增加，溶血率呈现上升趋势，但即使在30 %的水凝胶浓度下，其溶血率仍低于5 %，符合药物溶血性要求。该结果进一步确认了透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶在体外环境中的良好血液相容性。

实施例9：细胞增殖实验（透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶与透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白比较）

参照前述实施例中HaCaT细胞前期的培养准备工作，在细胞铺板并培养24后，对细胞药物刺激及后续进行CCK-8检测。

在进行透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶与透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白对细胞增殖促进差异的比较实验时，须保持实验中透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白的浓度一致，选用透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶含量分别为5 %、10 %、20 %、30 %及50 %（对应的透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白浓度分别为0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL）同时保证透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白原料浓度也为0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL进行实验，以上实验组溶液在配置完成后使用0.22 μm滤头进行过滤除菌，同时实验组及对照组均设置6组重复。

实验时先将96孔板中的培养基吸出，再重新向96孔板中加入稀释好的实验样品及对照样品100 μL并重新放入37 ℃细胞培养箱中培养24 h后进行CCK-8检测。

配置CCK-8反应试剂：每95 μL培养基中加入5 μLCCK-8试剂，混匀后以备用。将96孔板中的PBS及实验组中的培养基吸出后向其中每孔中加入100 μL反应试剂，于37 ℃细胞培养箱中反应30 min后取出，使用酶标仪检测450 nm处的吸光度。获得数据后进行细胞活力计算。

图9展示了透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶与纯透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白在细胞增殖实验中的对比效果。实验通过不同浓度的水凝胶与纯透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白对HaCaT细胞进行处理，使用CCK-8法检测细胞增殖。实验结果表明，在相同有效浓度下，水凝胶形式的透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白对细胞增殖的促进效果与纯透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白相当，但水凝胶的形式能够保持更长时间的稳定性，并能持续提供生物活性。水凝胶中除透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白外的其他组分不会对细胞产生不利影响

实施例10：细胞增殖实验（透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶与水凝胶基质比较）

参照前述实施例中HaCaT细胞前期的培养准备工作，在细胞铺板并培养24后，对细胞药物刺激及后续进行CCK-8检测。

使用含透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶作为实验组、不含蛋白的水凝胶基质作为阴性对照，培养基则为空白对照。先使用培养基对透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶及不含蛋白的水凝胶基质（空白载体）进行稀释使其含量达到 50 %时使用0.22 μm 无菌滤头进行抽滤。

在无菌的 50 % 含量的水凝胶基础上使用培养基对其进行再次稀释，使水凝胶最终含量分别为5 %、10 %、20 %及30 %（对应的透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白浓度分别为0.01mg/mL、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL及0.06 mg/mL）。以上实验组及对照组均设置6组重复。

实验时先将96孔板中的培养基吸出，再重新向96孔板中加入稀释好的实验样品及对照样品100 μL并重新放入37℃细胞培养箱中培养24 h后进行CCK-8检测。

配置CCK-8反应试剂：每95 μL培养基中加入5 μLCCK-8试剂，混匀后以备用。将96孔板中的PBS及实验组中的培养基吸出后向其中每孔中加入100 μL反应试剂，于37 ℃细胞培养箱中反应30 min后取出，使用酶标仪检测450 nm处的吸光度。获得数据后进行细胞活力计算。

图10展示了使用透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶对HaCaT细胞进行细胞增殖实验的结果。该实验旨在评估水凝胶对皮肤细胞生长的促进作用，为其在创伤治疗中的应用提供理论依据。不同浓度的透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶(5 %、10 %、20 %、30 %)与不含蛋白的水凝胶基质(作为阴性对照)共同培养HaCaT细胞，并通过CCK-8检测细胞活力。实验结果表明，以上浓度的透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶均显著促进了细胞增殖，通过t-test显著性分析，在10 %及20 %的使用浓度时其细胞活性达到了三颗星级别（p<0.001），说明其在促进细胞增殖方面具有极显著的效果。而在5 %和30 %浓度时细胞增殖效果通过t-test显著性分析为一颗星（p<0.05)达到显著促进增殖水平。这一结果表明，该水凝胶在一定浓度范围内能够显著增强细胞增殖，为创伤修复提供支持。

实施例11：透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶的体外创伤恢复实验

创伤制造

本实验使用的是6~8周的昆明鼠，实验时在通风处使用浸有适量乙醚的棉球，置于倒扣的烧杯（或专用麻醉罐）底部，对小鼠进行吸入麻醉，以丧失翻正反射作为麻醉终点。

确认小鼠麻醉后将小鼠脊背部分毛发做剃除处理，备皮结束后对小鼠四肢进行固定，使用提前用75 %乙醇进行行消毒后的打孔器（孔径为5 mm）对小鼠裸漏处的皮肤进行创伤制造，需准备两个大小相近的伤口以备进行对照实验。

创口处给药及监测创口恢复情况

实验组采用含透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白（有效浓度 0.2 mg/mL）的水凝胶，阴性对照组采用不含蛋白的水凝胶基质（空白载体）对小鼠创伤部位进行给药。给药时，将小鼠四肢仰卧位固定，分别于两处创伤部位涂抹等量（0.05 g）的上述实验组水凝胶或对照组基质，并记录每次给药时的创伤愈合情况。

图11展示了透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶在雌性小鼠创伤恢复中的应用效果。通过在小鼠背部制造创伤，分别涂抹含透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶和不含蛋白的空白载体，对创伤愈合过程进行观察。结果显示，使用透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶的小鼠创伤愈合速度显著快于对照组，创伤面积在治疗7天及11天时明显减小，证明该水凝胶能够加速创伤的愈合过程。图中清晰对比了实验组和对照组创伤愈合的差异，进一步验证了透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶在皮肤创伤修复中的有效性。

图12展示了透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶在雄性小鼠创伤恢复中的效果。通过对比实验组和对照组的创伤愈合情况，结果表明，透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶同样显著促进了雄性小鼠创伤的愈合，创伤面积在治疗6天和8天时明显减小。与雌性小鼠的实验结果相似，该水凝胶对雄性小鼠创伤愈合的促进作用同样显著，表明该水凝胶具有广泛的性别适应性，能够在不同性别的小鼠中有效促进创伤恢复。

实施例12：0.2 mg/mL透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶与1 mg/mL透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶的创伤恢复对比实验

准备工作与实例11一致，对创口处给药并监测创口恢复情况，实验组采用含有效浓度为 1 mg/mL的透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白的水凝胶，对照组采用含有效浓度为 0.2 mg/mL的蛋白的水凝胶基质对小鼠创伤部位进行给药。给药时，将小鼠四肢仰卧位固定，分别于两处创伤部位涂抹等量（0.05 g）的上述实验组水凝胶，并记录每次给药时的创伤愈合情况。

图13展示了不同浓度的透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶在雄性小鼠创伤恢复中的效果。通过对比实验组和对照组的创伤愈合情况，结果表明，透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白水凝胶在有效浓度为0.2 mg/mL时与有效浓度为1 mg/mL对促进小鼠创伤的愈合并无太大差异，创伤面积在治疗6天和8天时都明显减小。表明该水凝胶在配比过程中使用较低有效浓度的0.2 mg/mL时就具备促进皮肤创伤修复的能力。

Claims (10)

1.一种透皮肽重组人源化Ⅲ型胶原蛋白水凝胶，其特征在于，所述水凝胶包含透皮肽重组人源化Ⅲ型胶原蛋白、海藻糖、丙二醇、卡波姆、三乙醇胺和去离子水。

2.根据权利要求1所述的水凝胶，所述水凝胶包含透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白0.01-0.4mg/mL、海藻糖4-6wt %、丙二醇0.5-1.5 wt %、卡波姆0.3-0.5 wt %、三乙醇胺0.15-0.3 wt%。

3.根据权利要求2所述的水凝胶，所述水凝胶由0.02-0.2 mg/mL的透皮肽重组Ⅲ型胶原蛋白、5wt %的海藻糖、1 wt %的丙二醇、0.4 wt %的卡波姆、0.25 wt %的三乙醇胺以及余量的去离子水组成。

4.根据权利要求1-3任一项所述的水凝胶，所述水凝胶的制备方法包括：

将透皮肽重组人源化Ⅲ型胶原蛋白、海藻糖溶于适量的去离子水中，搅拌至完全溶解，形成溶液A；将丙二醇、卡波姆混合后加入适量的去离子水，搅拌均匀形成溶液B；将溶液A缓慢加入溶液B中，充分搅拌后，缓慢滴加三乙醇胺，调节混合溶液的pH值至7.0-7.3；将混合液室温静置，最终形成稳定的水凝胶。

5.根据权利要求1-4任一项所述的水凝胶，所述透皮肽重组人源化Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

6.根据权利要求1-5任一项所述的水凝胶在制备治疗皮肤创伤的药物中的应用。

7.根据权利要求1-5任一项所述的水凝胶在制备皮肤护理的药物中的应用。

8.根据权利要求6或7所述的应用，所述药物为外用药物。

9.根据权利要求8所述的应用，所述药物中根据权利要求1-5任一项所述的水凝胶含量为10v/v%以上。

10.根据权利要求6-9任一项所述的应用，所述药物中还包含药学上可接受的赋形剂和/或基质。