CN122017232A - 一种用于检测人甲状旁腺激素的胶体金试纸条、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种用于检测人甲状旁腺激素的胶体金试纸条、试剂盒及其应用。所述胶体金试纸条可按照常规胶体金试纸条设置，所述胶体金试纸条至少包含捕获抗体和检测抗体。本发明的试纸条可实现甲状腺手术中疑似甲状旁腺组织的即时检测，无需样本预处理，检测结果不受血液中低浓度PTH干扰，且操作简便、结果可靠，为外科医生提供术中决策辅助工具，降低甲状旁腺误切率及术后功能减退的发生率，具有良好的实际应用价值。

Description

一种用于检测人甲状旁腺激素的胶体金试纸条、试剂盒及其 应用

技术领域

本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种用于检测人甲状旁腺激素的胶体金试纸条、试剂盒及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

甲状旁腺是位于甲状腺背侧的内分泌腺体，主要分泌甲状旁腺激素（PTH），调控体内钙磷代谢稳态，其体积小、颜色与周围组织相近且下位腺体位置不固定，易在甲状腺手术中被误切。甲状旁腺误切或损伤会导致PTH缺乏，引发短暂性或永久性低钙血症，表现为口周/手足麻木、痉挛抽搐甚至心律失常，目前无有效治疗手段，是甲状腺外科医患纠纷的主要诱因之一。

临床现行的甲状旁腺鉴定方法为术中冰冻病理检查，该方法耗时超30分钟，延长手术时间，且甲状旁腺组织体外常温保存易失活，送检造成的组织损耗也降低了自体移植成功率。短暂性甲状旁腺功能减退的临床发生率为5.6%至57.1%，永久性为0%至12.8%，因此亟需开发一种快速、准确、无组织损耗的术中甲状旁腺鉴定技术。

然而，发明人发现，现有免疫层析检测试纸虽可实现生物标志物快速检测，但针对术中甲状旁腺组织检测的试纸仍存在不足：常规试纸无法直接处理组织破碎液，需经过离心、稀释或者与特定缓冲液预混等预处理步骤，操作繁琐，不便于术中实施；抗体对易受血液中低浓度PTH干扰，特异性和灵敏度难以兼顾；缺乏适配术中快速检测的质控体系，检测结果可靠性不足。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种用于直接检测人甲状旁腺组织渗出液的胶体金试纸条、试剂盒及其应用。具体的，本发明实际提供一种用于术中快速确认人甲状旁腺的胶体金试纸条，实现甲状腺手术中疑似甲状旁腺组织的即时检测，无需样本预处理，检测结果不受血液中低浓度PTH干扰，且操作简便、结果可靠，为外科医生提供术中决策辅助工具，降低甲状旁腺误切率及术后功能减退的发生率。基于上述研究成果，从而完成本发明。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种用于检测人甲状旁腺激素的胶体金试纸条，所述胶体金试纸条可按照常规胶体金试纸条设置，所述胶体金试纸条至少包含捕获抗体和检测抗体；

其中，所述捕获抗体AB1其重链可变区的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2-4所示；其轻链可变区的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6-8所示；

所述检测抗体AB2其重链可变区的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10-12所示；其轻链可变区的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQID NO.14-16所示；

具体的，所述捕获抗体AB1其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者，具有与SEQ ID NO.1相比至少80％的同源性；更优选地，具有至少90％的同源性；最优选地，具有至少95％的同源性；如具有至少96％、97％、98％、99％的同源性；

所述捕获抗体AB1其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，或者，具有与SEQ ID NO.5相比至少80％的同源性；更优选地，具有至少90％的同源性；最优选地，具有至少95％的同源性；如具有至少96％、97％、98％、99％的同源性；

所述检测抗体AB2其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，或者，具有与SEQ ID NO.9相比至少80％的同源性；更优选地，具有至少90％的同源性；最优选地，具有至少95％的同源性；如具有至少96％、97％、98％、99％的同源性；

所述检测抗体AB2其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，或者，具有与SEQ ID NO.13相比至少80％的同源性；更优选地，具有至少90％的同源性；最优选地，具有至少95％的同源性；如具有至少96％、97％、98％、99％的同源性。

所述捕获抗体与检测抗体为配对兔源单克隆抗体，兔源单克隆抗体相较于传统鼠源抗体，在稳定性、批间一致性和规模化生产方面更具优势，有助于降低生产成本并保障试剂性能的可靠性。其分别特异性识别PTH分子的N端和中段抗原表位，二者结合互不干扰，可形成稳定的“AB1-PTH-AB2-胶体金”双抗夹心复合物；该抗体对经亲和力筛选优化，不受血液中低浓度PTH干扰，仅在检测到甲状旁腺组织渗出液高浓度PTH时显示阳性。从而便于术中快速确认人甲状旁腺。

本发明的又一具体实施方式中，所述胶体金试纸条包括：底板，所述底板上依次设置有样品垫、胶体金结合垫、检测垫和吸水垫，相邻各垫在连接处交叠连接。

其中，所述底板可以为纸板或PVC板，在此不做具体限定，起到保障结构稳定的作用。

所述样品垫为采用经处理液浸泡处理的玻璃纤维膜，所述处理液为含有1-5% BSA及表面活性剂的磷酸盐缓冲液，用于优化样本流速并减少非特异性吸附。其中，所述表面活性剂可以为Tween-20，其浓度可以为0.1-1%。

所述胶体金结合垫以玻璃纤维膜为基垫，其上包被有胶体金偶联的检测抗体AB2。

所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上依次设置质控线和检测线，所述检测线上包被有捕获抗体AB1，所述质控线上包被有羊抗兔IgG。

所述吸水垫可以为吸水板或吸水棉垫，在此不做具体限定。

进一步的，为满足术中直接组织破碎渗出液检测的需求，在样品垫与胶体金结合垫的交界处设置滤膜，所述滤膜用于有效分离组织碎屑和血细胞，从而使组织液成分顺利通过，从而减少干扰。所述滤膜可以为纤维素滤膜，孔径控制为4-10μm，如5、6、7、8或9μm。

所述胶体金试纸条的检测原理如下：检测时，样本滴加于样品垫。若样本中含有高浓度PTH（如＞500 pg/mL），其在层析过程中首先与胶体金结合垫上的AB2抗体结合，形成“PTH-AB2-胶体金”复合物。该复合物继续层析至硝酸纤维素膜的检测线（T线），被线上固定的捕获抗体AB1捕获，形成“AB1-PTH-AB2-胶体金”双抗夹心复合物，胶体金聚集显色，颜色深度与PTH浓度正相关。未结合的AB2-胶体金复合物则继续前行至质控线（C线），被羊抗兔IgG捕获并显色，表明层析过程完成。

本发明的第二个方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒至少包含上述用于检测人甲状旁腺激素的胶体金试纸条。进一步的，所述试剂盒中，所述胶体金试纸条还具有外壳。

本发明的第三个方面，提供上述胶体金试纸条或试剂盒在如下任意一种或多种中的应用：

（a）检测甲状旁腺激素或制备检测甲状旁腺激素的产品；

（b）确认甲状旁腺组织或制备确认甲状旁腺组织的产品。

以上一个或多个技术方案的有益技术效果：

（1）上述技术方案采用优化的免疫层析体系，样本层析仅需5-10分钟即可出结果，相较于传统冰冻病理检查大幅缩短检测时间，避免手术时长延长及甲状旁腺组织体外失活；

（2）增设组织碎屑和红细胞过滤膜，可直接检测甲状旁腺疑似组织的破碎渗出液/悬液上清液，无需离心、提纯等预处理步骤，适配术中紧急检测场景；

（3）采用经序列优化的兔源单克隆抗体对，分别识别PTH不同抗原表位，仅对甲状旁腺组织渗出液中高浓度PTH显色，不受血液中低浓度PTH干扰，血液样本和其他组织渗出液检测均为阴性，最低可检出浓度为500 pg/mL，重复检测阳性检出率100%；

（4）设置质控线验证层析过程，避免因操作、试纸失效等导致的假阴性结果，为术中诊断提供可靠依据；

（5）检测仅需少量组织渗出液/悬液，无需切取组织样本送检，保留完整的甲状旁腺组织用于自体移植，提升移植成功率；

（6）采用兔源单克隆抗体，相较于传统鼠源抗体，在稳定性、批间一致性和规模化生产方面更具优势，降低生产成本，保障试剂性能稳定；

总之，上述技术方案可实现术中甲状旁腺的快速精准鉴定，帮助医生即时判断疑似组织是否为甲状旁腺，最大程度避免误切，从根本上降低甲状腺术后短暂性和永久性甲状旁腺功能减退的发生率，具有显著的临床应用价值和社会价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明中用于定量检测甲状旁腺激素浓度的ELISA标准曲线图。

图2为本发明中试纸条1、1:10、1:100、1:1000、1:10000、阴性对照五个浓度梯度结果图。

图3为本发明血液和淋巴结渗出液测试结果图；图中左侧试纸条待测样品为血液，右侧试纸条待测样品为淋巴结渗出液。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如 Sambrook 等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1 特异性兔源单克隆抗体对的制备与表征

1.动物免疫

以人全段甲状旁腺激素（PTH）全长蛋白为免疫原，对新西兰大白兔进行系统免疫：初次免疫将200-300μg抗原与等体积佐剂乳化，于兔背部多点皮下注射；初次免疫后3-4周进行首次加强免疫，后续每隔2-3周加强免疫一次，共4次；末次免疫一周后采血检测，抗血清效价达1×10⁶以上，成功诱导高滴度特异性体液免疫应答。

2.淋巴细胞制备与单克隆化

末次免疫后3-4天，无菌分离兔脾脏并制备淋巴细胞悬液，采用流式细胞分选技术富集抗原特异性B淋巴细胞，经永生化处理后，获得能稳定分泌目标抗体的单克隆细胞株。

3.单克隆抗体的筛选与配对

采用间接ELISA法对单克隆细胞株上清进行筛选，筛选出与PTH特异性结合且无交叉反应的单克隆抗体，经多轮筛选，获得2株高特异性、适亲和力的单克隆抗体AB1、AB2，其中AB1适于作为捕获抗体固定于检测线，AB2适于作为检测抗体标记胶体金颗粒。

4.抗体序列与表位分析

对AB1、AB2进行序列测定，结果显示：

捕获抗体AB1

重链可变区 (VH)完整序列：

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGTITAKAYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREGHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTV（SEQ ID NO.1）

CDR-H1: GGTITAKAYY（SEQ ID NO.2）

CDR-H2 : IYYSGST（SEQ ID NO.3）

CDR-H3 : EGHYYGSSHWYF（SEQ ID NO.4）

轻链可变区 (VL)完整序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPLTFGAGTKLELK（SEQ ID NO.5）

CDR-L1 : ASQDVSIA（SEQ ID NO.6）

CDR-L2: ASYRYT（SEQ ID NO.7）

CDR-L3 : QQYYSTPLT（SEQ ID NO.8）

检测抗体AB2

重链可变区 (VH)完整序列：

EVKLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFDDYAISWVRQAPGKGLEWVSTISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCSRWGGYFGYWGQVTA（SEQ ID NO.9）

CDR-H1 : GFTFDDYA（SEQ ID NO.10）

CDR-H2 : ISYDGSNKY（SEQ ID NO.11）

CDR-H3: SRWGGYFGY（SEQ ID NO.12）

轻链可变区(VL)完整序列：

SYELTQPPSVSVAPGQTARITCTGDKLGDKYASWYQQKPGQAPVLVVYDDNQRPSGIPERFSGNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQSYDNSNLVFGGGTK（SEQ ID NO.13）

CDR-L1: KLGDKYA（SEQ ID NO.14）

CDR-L2: YDDNQRP（SEQ ID NO.15）

CDR-L3: QSYDNSNLV（SEQ ID NO.16）

5.抗体规模化生产

将阳性单克隆细胞株进行大规模体外无血清悬浮培养，采用Protein A/G亲和层析法纯化，获得高纯度兔源单克隆抗体 AB1、AB2，用于后续试纸条制备。

实施例2 甲状旁腺检测胶体金试纸条的制备

1.试纸条组件制备

底板：采用PVC板，保证试纸条结构稳定；

样品垫：取玻璃纤维膜，浸泡于含3%BSA和0.5%Tween-20的磷酸盐缓冲液中，室温浸泡2小时后，于37℃烘箱干燥12小时，制得样品垫，从而用于优化样本流速并减少非特异性吸附；

滤膜：选取5μm孔径的纤维素滤膜，裁剪后备用，用于分离组织碎屑和血细胞；

胶体金结合垫：①采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，调节pH至8.0；②将纯化的检测抗体AB2与胶体金颗粒共价偶联，标记后经洗涤、重悬于保存液中；③将AB2-胶体金复合物以1μL/cm的速度定量喷涂于玻璃纤维膜上，37℃干燥6小时，制得胶体金结合垫；

检测垫：①将硝酸纤维素膜浸泡于封闭液（含1% BSA、0.1% Tween-20的0.01MPBS，pH7.0）中60分钟，37℃干燥；②采用点膜仪，将捕获抗体AB1（2.5μg/mL）和山羊抗兔IgG（1.5μg/mL）分别以2μL/cm的线速度喷涂于膜上，形成间隔5mm的检测线（T线）和质控线（C线），点膜稀释液为含0.15M NaCl、10mM EDTA、1g/L NaN₃及25g/L甲醇的0.01M PBS（pH7.4）；③喷涂后于37℃干燥12小时，制得硝酸纤维素膜；

吸水垫：采用吸水棉垫，保证层析液的快速吸附。

2.试纸条组装

将上述制备的样品垫、滤膜、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次层叠搭接在PVC底板上，确保层析液顺利流动；组装后用切割机裁剪成试纸条，试纸条正向放入卡壳中，压壳封装，即得具有壳体保护的检测卡，密封保存于含干燥剂的包装袋中。

实施例3 抗体有效性验证实验

采用酶联免疫吸附测定（ELISA）验证抗体对AB1、AB2对PTH的特异性和灵敏度：

1.包被：将捕获抗体AB1用PBS缓冲液稀释至 2μg/mL，每孔 50μL 加入 96 孔酶标板，4℃孵育过夜；

2.洗涤：弃去包被液，用PBS缓冲液洗涤3次，每次5分钟；

3.封闭：每孔加入150μL含3%BSA的PBS溶液，37℃孵育1.5小时，洗涤 3 次；

4.加样：加入50、250、500、1000、1500、3000 pg/mL的人PTH标准品，每孔50μL，37℃孵育1小时，洗涤3次；

5.检测：加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体AB2，37℃孵育1小时，洗涤3次；

6.显色与读数：加入显色液，室温避光显色15分钟，加入终止液，用酶标仪读取吸光度值。

该抗体对在 50-3000 pg/mL浓度范围内呈现良好的剂量-效应关系，线性相关系数R²>0.998，表明抗体对具有高灵敏度和高特异性，适用于 PTH 的定量检测。

实施例 4 胶体金试纸条性能测试

1.灵敏度与线性范围测试

取准确定量为50000 pg/mL 的甲状旁腺回植组织渗出液，梯度稀释为原液（1×）、1:10、1:100、1:1000、1:10000，设置阴性对照（生理盐水）；各取50μL样本滴加于试纸条样品垫，室温反应15分钟，观察检测线和质控线显色情况。

试纸条在50000 pg/mL（1×）至500 pg/mL（1:100）浓度范围内，检测线显色深度与PTH浓度呈良好线性相关；最低可检出浓度为500 pg/mL，该浓度远高于血液中PTH浓度（15-65 pg/mL），且该浓度下重复检测10次，阳性检出率100%。血液样品和其他组织渗出液标本均显示阴性，提示试纸具有较高的灵敏度和稳定性。

2. 甲状旁腺组织实际检测方法

定性检测时，取50μL疑似组织渗出液或者待回植组织悬液上清液样品加入到检测试纸条的样品垫的加样区，于20-30℃下进行层析5min。通过观察检测线和质控线即可确定疑似组织是否为甲状旁腺。具体来讲，当检测线和质控线都显色时，样品中含有高浓度PTH，表明疑似组织为甲状旁腺；当检测线不显色，质控线显色时，样品中不含高浓度的 PTH，表明疑似组织是其他组织。

当本试纸配合定量扫表装置时，可对样品中PTH浓度进行定量检测。将层析反应后的试纸条放置在扫描装置下进行扫描，扫描后的图像灰度数值与相应试纸批次的标准曲线对比后，可得出PTH的浓度。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测人甲状旁腺激素的胶体金试纸条，其特征在于，所述胶体金试纸条至少包含捕获抗体和检测抗体；

其中，所述捕获抗体AB1其重链可变区的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2-4所示；其轻链可变区的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.6-8所示；

所述检测抗体AB2其重链可变区的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列分别如SEQID NO.10-12所示；其轻链可变区的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.14-16所示。

2.如权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述捕获抗体AB1其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述捕获抗体AB1其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示。

3.如权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述检测抗体AB2其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述检测抗体AB2其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.13所示。

4.如权利要求1-3任一项所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述胶体金试纸条包括：底板，所述底板上依次设置有样品垫、胶体金结合垫、检测垫和吸水垫，相邻各垫在连接处交叠连接。

5.如权利要求4所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述底板为纸板或PVC板。

6.如权利要求4所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述样品垫为采用经处理液浸泡处理的玻璃纤维膜，所述处理液为含有1-5% BSA及表面活性剂的磷酸盐缓冲液；进一步的，所述表面活性剂为Tween-20，其浓度为0.1-1%。

7.如权利要求4所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述胶体金结合垫以玻璃纤维膜为基垫，其上包被有胶体金偶联的检测抗体AB2；

所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上依次设置质控线和检测线，所述检测线上包被有捕获抗体AB1，所述质控线上包被有羊抗兔IgG；

所述吸水垫为吸水板或吸水棉垫。

8.如权利要求4所述的胶体金试纸条，其特征在于，在样品垫与胶体金结合垫的交界处设置滤膜。

9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包含权利要求1-8任一项所述的用于检测人甲状旁腺激素的胶体金试纸条；进一步的，所述试剂盒中，所述胶体金试纸条还具有外壳。

10.权利要求1-9任一项所述的胶体金试纸条或权利要求9所述的试剂盒在如下任意一种或多种中的应用：

（a）检测甲状旁腺激素或制备检测甲状旁腺激素的产品；

（b）确认甲状旁腺组织或制备确认甲状旁腺组织的产品。