DK160108C - Fremgangsmåde og udstyr til direkte eller indirekte påvisning af reaktion mellem et specifikt bindingsmiddel og den tilsvarende acceptorsubstans - Google Patents

Description

i

DK 160108 C

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til påvisning og/eller bestemmelse af et agglomerat dannet af et bindingsmiddel og den tilsvarende acceptorsubstans ved såkaldt "blot overlay assay", i det 5 følgende kaldet blot-overlejringsanalyse. Sidstnævnte substans er sædvanligvis indeholdt i en vandig testprøve og bliver på et senere trin af analysen adsorberet på og/eller bundet kovalent til en immobil i serings-matrix. Eksempler på immobiliseringsmatrixer er nitrocellulose- (NC)-film (tynde plader af salpetersyreforestret cellulose med kendt porøsi-10 tet), diazobenzyloxymethyl- (DBM)- og diazophenylthioether- (DPT)-modi-ficeret cellulosepapir, papir eller celluloseacetat aktiveret med cyano-genbromid og nylonbaserede membraner såsom "Gene Screen" og "Zetabind". Sidstnævnte er en nylonmatrix (en polyhexamethylenadipamin betegnet "Nylon 66"), der er modificeret ved indføring af talrige tertiære amino-15 grupper under fremstillingen. Disse immobiliseringsmatrixer omtales i almindelighed som "blotting media", i det følgende betegnet blottingme-dier. (Se for eksempel J.M Gershoni og G.E. Pallade, Analytical Bio-chemistry 131, 1-15 (1983)).

Blot-overlejringsanalysemetoder kan generelt opdeles i to forskel-20 lige teknikker: A. Ved sandwichoverlejringsanalysen knyttes det rensede eller berigede specifikke bindingsmiddel til immobiliseringmatrixen i henhold til B (se nedenfor), fortrinsvis som en lille plet, og acceptorsubstansen gives lejlighed til at binde til det, hvilket resulterer i, at der på 25 matrixen sker immobilisering af acceptorsubstansen, som derefter kan påvises. På grund af det specifikke bindingsmiddels specificitet er det muligt at isolere acceptorsubstansen fra en kompleks testprøve såsom urin, plasma, serum, andre legemsfluider, cellefri translationssystemer, celle- og vævslysater, etc., og at anvende denne metode til semikvanti-30 tative og/eller kvalitative (diagnostiske) analyser: den såkaldte "sandwich blot overlay assay" (SBOA). Hidtil har den praktiske værdi af SBOA været ubetydelig, fordi man kun har haft forholdsvis komplekse påvisningsmetoder til rådighed. Den foreliggende opfindelse gør påvisningen meget enkel, og interessen i at anvende et SBOA til diagnotisk brug kan 35 øges.

B. Ved den direkte blot-overlejringsanalyse knyttes acceptorsubstansen direkte til et aftryksmedium ved en procedure, der er kendt som "transferring", i det følgende kaldet overførsel, eller blotting. For- 2

DK 160108 C

skellige metoder dertil er velkendte fra litteraturen. For eksempel anbringes små dråber indeholdende en kendt eller ukendt mængde acceptor-substans (renset eller ikke) i en vandig opløsning af størrelsesordenen 1 μΐ (men andre volumener kan også anvendes) som pletter på blottingme-diet for at give acceptorsubstansen mulighed for at blive knyttet til blottingmediet. Sådanne pletaftryk har potentiel anvendelighed til diagnostisk påvisning af tilstedeværelsen af specifikke bindingsmidler for den immobil iserede acceptorsubstans i forskellige legemsfluider. Hvis acceptorsubstansen indgår i en kompleks blanding, kan blandingen først adskilles ved forskellige kromatografiske teknikker såsom tyndtlagskro-matografi eller elektroforeseteknikker, for eksempel i polyacrylamidgeler såsom natriumdodecylsul fat- (SDS)-elektroforese, i soelektrisk fokusering, 2-D-gel-elektroforese, gradient gel- og syre-urinstofgelelek-troforese og ikke-denaturerende gelelektroforese for at lette identifikation af acceptorsubstansen. I nogle tilfælde som for eksempel til nukleinsyrer kan agargeler også anvendes. De elektroforetisk opløste komponenter (såsom proteiner, peptider og nukleinsyrer) overføres derefter til immobiliseringsmatrixen ved procedurer kendt som kapillar-, vakuum- eller elektrooverførsel (eller -aftrykning). Komponenterne immobil iseres derefter på aftryksmediet under vidtgående bibeholdelse af det oprindelige elektroforetiske mønster. Dette færdige mønster kan gøres synligt ved kendte farvningsteknikker såsom ved hjælp af "amido black" og "coomassie blue" og komponenten, som er under undersøgelse (acceptorsubstansen), kan påvises (se senere) og dens placering sammenlignes med hele det elektroforetiske mønster.

Hidtil har de fleste af de anvendte specifikke bindingsmidler været proteiner, som bindes til veldefinerede områder i acceptorsubstansen. Lectiner anvendes til påvisning af glycoproteiner. Polyklonale og mono-klonale antistoffer til påvisning af de tilsvarende antigener eller hap-tener (for eksempel biotin eller biotinylerede DNA-prober med antibio-tin, DNP på dinitrophenylerede proteiner med anti-DNP). Blot-overlejringsanalyser anvendes allerede i vid udstrækning til påvisning af antistoffers specificitet og til screening af produktionen af monoklonale antistoffer. Ud over disse i vid udstrækning anvendte systemer kan mange andre indbyrdes protein-protein (for eksempel calmodulin- eller actin-bindingsproteiner) eller protein-ligand (for eksempel avidin-biotin) reaktioner, hvor den ene af komponenterne immobiliseres, analyseres. Blandt disse er DNA-protein- og RNA-proteinreaktioner, receptor-ligand- 3

DK 160108 C

reaktioner og i almindelighed vilkårlige andre indbyrdes makromolekyle-makromolekylereaktioner af tilstrækkelig specificitet og affinitet.

En væsentlig del af blot-overlejringsanalyserne er den metode, der anvendes til synliggørelse af den immobil i serede acceptorsubstans. Der eksisterer både direkte og indirekte teknikker. Ved synliggøreisen benyttes markører: radioaktive isotoper (^H, ^C, ^P, eller efterfulgt af autoradiografi sk fremkaldelse, enzymer som kan danne uopløselige farvede produkter eller fluorochromer. Ved direkte metoder bindes markøren til det specifikke bindingsmiddel. Ved indirekte metoder bindes det til et makromolekyle, som specifikt kan bindes til det første specifikke bindingsmiddel. Hvis sidstnævnte er et antistof, kan makromoleky-let være protein A eller et sekundært antistof. Flertrinsteknikker, som avidinbiotinyleret peberrodsperoxidasekompleks- (ABC)-metoden og umærket peroxidase-antiperoxidase-(PAP)-metoden kan også anvendes til antistoffer.

Det væsentlige punkt ved den foreliggende opfindelse er anvendelsen af en dispersion af et metal eller en metalforbindelse eller en kerne, som er belagt med et metal eller en metalforbindelse til synliggørelse og/eller påvisning ved aftryksanalyseteknikker. Som udtrykket "kolloida-le metal parti kl er" anvendes i den foreliggende sammenhæng, indbefatter det dispersioner af partikler, eventuelt en sol, bestående af et metal, en metalforbindelse eller en kerne belagt med et metal eller en metalforbindelse.

Kolloidale metal parti kl er kan fremstilles ved hjælp af fremgangsmåder, som er kendte inden for området, for eksempel til fremstilling af kolloidalt guld, sølv eller jernoxid og lignende. Kolloidale metalpartikler kan knyttes direkte eller indirekte til det specifikke bindingsprotein eller acceptorsubstansen eller til et makromolekyle, som bindes specifikt til det første specifikke bindingsmiddel, for eksempel protein A, sekundært antistof (når der er tale om et primært antistof) eller streptavidin og avidin (når der er tale om, at en af komponenterne er biotinyleret) under bibeholdelse af størsteparten af den oprindelige bindingsaktivitet ved at følge fremgangsmåder, som er kendte inden for området. Ved knytning forstås enhver kemisk eller fysisk binding såsom binding via kovalente bindinger, via hydrogenbroer, polær tiltrækning og adsorption.

Det har nu vist sig, at når et blottingmedium, hvortil der enten indirekte (se A) eller direkte (se B) er knyttet en acceptorsubstans, 4

DK 160108 C

inkuberes med en passende koncentration af et specifikt bindingsmiddel mærket med kolloidale metal parti kl er (direkte påvisningsmetode) eller først med et umærket specifikt bindingsmiddel og derefter med et makro-molekyle mærket med kolloidale metal parti kl er (indirekte påvisningsmeto-5 de), vil akkumuleres kolloidale metal parti kl er på de specifikke bindingssteder, som overraskende bliver synlige som den karakteriske farve for de anvendte kolloidale metal parti kler. For eksempel opnås der en lyserød til mørkerød farve, når et metal som guld anvendes, og en gul til brun/sort farve, når sølv anvendes. Denne farve udgør et signal, som kan 10 aflæses kvalitativt med det blotte øje eller eventuelt måles ved kendte spektrofotometriske metoder, såsom densitometri.

Partikelstørrelsen af de kolloidale metal parti kl er er fortrinsvis mellem 3 nm og 100 nm og mere foretrukket mellem 5 nm og 50 nm.

Som eksempler på kolloidale metal parti kl er, der kan knyttes til 15 specifikke bindingsmidler, er metallerne platin, guld, sølv og kobber og metalforbindelserne sølviodid, sølvbromid, hydratiseret kobberoxid, jernoxid, jernhydroxid eller hydratiseret jernoxid, aluminiumhydroxid eller hydratiseret aluminiumoxid, chromhydroxid eller hydratiseret chromoxid, vanadinoxid, arsensulfid, manganhydroxid, blysulfid, kvik-20 sølvsulfid, bariumsulfat og titandioxid blevet beskrevet. Det er også kendt, at kolloider bestående af kerner belagt med ovennævnte metaller eller metalforbindelser kan anvendes. Disse partikler har lignende egenskaber som metal- eller metalforbindelsekolloiderne, men størrelse, densitet og metalindhold kan kombineres optimalt. I almindelighed kan alle 25 kolloidale metalpartikl er eller metalforbindelser, som kan bindes til specifikke bindingsmidler uden ødelæggelse af deres bindingsaktivitet, og som vil give en farveintensitet ved aftryksanalyse, som er tilstrækkelig til at kunne ses med det blotte øje, anvendes. Sensitiviteten er fortrinsvis lig med eller bedre end den, der opnås med guld eller sølv. 30 Anvendelsen af kolloidale metalpartikler, specielt guldsoler, som er dækket på overfladen med specifikke bindingsmidler såsom antistoffer, lectiner, protein A, avidin og mange andre, eller selv acceptorproteiner såsom antigener er nu veletableret ved mange cytokemiske mærkningsteknikker inden for transmissions- og scanningelektronmikroskopi. Et eksem-35 pel på anvendelse af en kolloidal metal partikel bestående af en polymer belagt med et metal er dextran belagt med jern, som, når det knyttes til antistoffer, frembringer en meget værdifuld markør til transmissionselektronmikroskopi. Disse anvendelser udnytter imidlertid disse markø- 5

DK 160108 C

rers typiske elektronopacitet (transmissions EM) eller deres kapacitet til at emittere sekundære elektroner eller give tilbagekastning af primære elektroner (scanning EM).

Kolloidale metal parti kl er, navnlig partikler fremstillet af guld og 5 sølv, anvendes også som markører ved cytokemiske mærkningsteknikker i forbindelse med lysmikroskopi, efter at det har vist sig, at akkumulering af sådanne kolloidale metal parti kl er på bindingssteder i vævspræparater eller på celleoverflader kan ses, forudsat at præparatet betragtes gennem et lysmikroskop.

10 Kolloidale metalparti kl er anvendes også til visse kvalitative og kvantitative in vitro bestemmelser af immunologiske komponenter såsom haptener, antigener og antistoffer i vandigt medium. Disse teknikker er blevet kaldt solparti kelimmunoanalyser og passiv guldagglutinering ("Geoghegan").

15 Den passive guldagglutineringsteknik er baseret på agglutinering af et guldmærket antigen (guldpartikler 18 til 20 nm) med umærket antistof og indbefatter anvendelse af et standardmi krotitersæt, hvori ikke-aggre-geret guld flyder ned langs fordybningernes sider og danner en rød stribe. Denne teknik er analog med klassisk passiv hæmagglutinering og er 20 ligeså følsom og er blevet hævdet muligvis at kunne anvendes til omvendt agglutinering, hvor det er antistoffet, som mærkes med guld.

Sol parti kelimmunoanalyser ligger inden for to kategorier. Den første kaldes homogen sol parti kelimmunoanalyse og er baseret på agglutinering af antistofmærkede kolloidale partikler med immunokemisk di- eller 25 miiltivalente antigener eller med haptener koblet til et bærerprotein. Agglutineringen resulterer i en farvereduktion målt kolorimetrisk med puffer som blindprøve. Agglutineringen af de kolloidale metalparti kl er kan derefter inhiberes af frie haptenmolekyler fra prøven. Sådanne metoder beskrives i europæisk patentskrift nr. 0007654.

30 Den anden type solparti kelimmunoanalyse er baseret på bundet/fri kolloidal metal parti kelkonjugatadski11el sesmetoder, som er analoge med radioimmunoanalyse og enzymimmunoanalyse. Sådanne metoder beskrives i europæisk patentskrift nr. 0007654. En sådan metode kaldes "Sandwich Sol Particle Immunoassay” (SSPIA) og er analog med en sandwich ELISA eller 35 fastfasesandwichradioimmunoanalyse. Ved en typisk SSPIA adsorberes et antistof mod antigenet, som skal bestemmes, først på overfladen af en mi krotitreringsplade (for eksempel fremstillet af polystyren). En prøve (antigenstandard eller blindprøve) opløst i et passende puffersystem af- 6

DK 160108 C

pipetteres i fordybningerne, som er belagt med antistof, og inkuberes på passende måde. Guldmærket antistof tilsættes, og reaktionsblandingen inkuberes yderligere. Fordybningerne suges tomme og vaskes for at fjerne ubundet konjugat. Endelig frigøres det bundne immunkompleks sammen med de homogeniserede kolloidale metal parti kl er. Enten inspiceres farvein-tensiteten af den opnåede dispersion visuelt, eller metal koncentrationen måles ved hjælp af et kolorimeter. Den visuelle inspektionsmetode (for eksempel farven af det dispergerede guld) har kun kunnet anvendes ved højere antigenkoncentrationer.

Det bør bemærkes, at solparti kel analyser også er blevet beskrevet som værende værdifulde til ikke-immunologiske analyser, i almindelighed "til påvisning og/eller bestemmelse af én eller flere komponenter fra reaktionen mellem et specifikt bindingsprotein og den tilsvarende substans, som kan bindes, i en vandig testprøve under anvendelse af sådanne komponenters kendte bindingsaffinitet for hinanden, hvorved der anvendes én eller flere mærkede komponenter, som er opnået ved direkte eller indirekte kobling af den ønskede komponent fra reaktionen til partikler af en vandig dispersion af et metal, en metalforbindelse eller en polymer kerne, som er belagt med et metal eller en metalforbindelse med en partikelstørrelse på mindst 5 nm, og der under reaktionen eller efter en passende reaktionstid eventuelt efter adskillelse af bundne og fri mærkede komponenter foretages en bestemmelse af de fysiske egenskaber og/-eller af mængden af metallet og/eller af det dannede metalholdige agglo-merat i testprøven eller én af de opnåede fraktioner på kendt måde, hvilken bestemmelse giver en kvalitativ og/eller kvantitativ indikation for komponenten eller komponenterne, som skal påvises og/eller bestemmes.

Den foreliggende opfindelse angår anvendelsen af kolloidale metal-partikler som markører ved blot-overlejringsanalysemetoder. Denne anvendelse er helt ny og har overraskende vist sig at være mulig.

Som udtrykket kolloidale metalparti kler anvendes, Indbefatter det en dispersion af et metal, en metalforbindelse eller en kerne belagt med et metal eller en metalforbindelse.

Anvendelsen af kolloidale metal parti kl er som markører gælder alle former for aftryksanalyser og giver den fordel, at kolloidale metalpartikler, som akkumuleres på bindingsstederne ved aftryksmediets overflade, bliver direkte synlige for det blotte øje med en følsomhed, som i det mindste er sammenlignelig med den meget høje følsomhed af eksiste- 7

DK 160108 C

rende teknikker, såsom enzymbaserede aftryksanalyser. Det understreges, at opfindelsen ikke ville have nogen praktisk værdi uden sidstnævnte punkt. Det har den vigtige fordel, at analysen kan aflæses uden behov for en sekundær enzymatisk reaktion, autoradiografi eller et betragt-5 ningssystem for fluorescerende farver eller for en frigørelse af de bundne kolloidale metal parti kl er for efterfølgende måling med det blotte øje (lav følsomhed), ved kolorimetri eller CRAAS (højere følsomhed) som ved sandwichsol parti kelimmunoanalyse. Den væsentligste fordel ved metoden er, at den er så enkel i kraft af, at farven fremkaldes under reak-10 tionen. Dette gør det muligt at afbryde reaktionen, når det ønskede signal er frembragt, eller at kalibrere systemet for at opnå et forudbestemt resultat inden for en fastsat tidsgrænse.

Anvendelsen af guldmærkede antistoffer er meget enklere end og ligeså følsom som en efter den almindelige opfattelse meget følsomme im-15 munoperoxidasemetode. Denne simple analyse kan anvendes til et testudstyr til indirekte påvisning af tilstedeværelsen af specifikke bindingsmidler for en acceptorsubstans, som er knyttet til blottingmediet, og et med kolloidale metal parti kl er mærket specifikt bindingsmiddel for det første specifikke bindingsmiddel. Hvis det specifikke bindingsmiddel er 20 et antistof, kan det være et med kolloidale metalparti kler mærket sekundært antistof eller protein A. Den vil i praksis kunne anvendes som en meget simpel dyppepindsprøve, for eksempel en Spot-blot-overlejringsana-lyse til hurtig screening for tilstedeværelsen af antistoffer for et udvalgt antigen i en vandig testprøve, såsom serum.

25 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del angivne.

Omhandlede fremgangsmåde omfatter således, at man i på hinanden følgende trin i. immobil i serer acceptorsubstansen på en immobiliseringsmatrix 30 kendt som blottingmedium i.i. enten ved direkte adsorption og/eller kovalent binding, i almindelighed kaldet blotting, eventuelt efter anvendelse af en procedure til elektroforetisk adskillelse og anvendelse af en procedure til overførsel eller blotting fra det 35 elektroforetiske medium til blottingmediet og efterfølgende undertrykkelse af tilbageværende proteinbindingssteder på kendt måde såsom ved anvendelse af BSA, gelatine, PEG eller Tween 20, 8

DK 160108 C

1.11. eller ved at lade acceptorsubstansen blive bundet af et specifikt bindingsmiddel, som er blevet immobil i seret på blottingmediet ved, at aftryksmediet bringes i kontakt med en vandig opløsning, der indeholder acceptorsubstansen, ii. i et givet tidsrum bringer blottingmediet fra i) i kontakt med ii.i. enten med kolloidale metal parti kler mærkede specifikke bindingsmidler i en passende koncentation eller 11.11. først umærket specifikt bindingsmiddel i en passende koncentration og derefter et med kolloidalt metal mærket protein, som er specifikt for det umærkede specifikke bindingsmiddel, hvorefter aftryksmediet vaskes og lufttørres, og iii. aflæser det farvede signal, som er frembragt af og karak-terisk for de bundne kolloidale metalparti kler ved overfladen af blottingmediet med det blotte øje eller ved anvendelse af kendte spektrofo-tometriske teknikker såsom densitometri.

Opfindelsen angår også testudstyr til anvendelse til den direkte eller indirekte bestemmelse af én af komponenterne 1 reaktionen mellem et specifikt bindingsmiddel og den tilsvarende acceptorsubstans ved en blot-overlejringsanalyse, hvilket udstyr omfatter en med kolloidale metalpartikler mærket komponent, som er opnået ved at koble en komponent i reaktionen eller en komponent, som kan anvendes til indirekte at påvise denne reaktion, til kolloidale metalparti kler, som defineret ovenfor, samt andre reagenser. Hvis reaktionen er af den immunologiske type, kan testudstyret anvendes til sandwich-blot-overlejringsanalyser (se eksempel III) og til påvisning af tilstedeværelsen i serum af antistoffer for udvalgte antigener (se eksempel I).

I en udførelsesform af opfindelsen gøres der brug af den kendsgerning, at påvisningen af de kolloidale metal parti kler, som er bundet til overfladen af blottingmediet, som resultat af en blot-overlejringsanalyse også kan synliggøres indirekte og/eller forbedres ved anvendelse af en fysisk fremkalder, som kan reduceres til de tilsvarende metaller. Egnede fysiske fremkaldere er for eksempel sølvlactat, sølvnitrat og lignende. Når for eksempel sølv anvendes som fysisk fremkalder, finder reaktionen fra start sted ved overfladen af metal partikierne, som katalyserer reduktionen, og bliver derefter autokatalytisk på disse podekorn. Det resulterer i dannelse af et sort, stærkt kontrastgivende sig- 9

DK 160108 C

nal, som er tilvejebragt ved akkumulering af metallisk sølv. Dette giver en betragtelig forøgelse af følsomheden. For at opnå lysufølsomme sølv-præcipitater har man også fundet ud af, at aftrykkene må fikseres med et fiksativ, som anvendes til mi krograftryk.

5 Fysiske fremkaldere har været anvendt i mange år til synliggørelse af vanduopløselige metaller, navnlig metalsulfider i væv (se Danscher, Histochemistry 71, 1-16, 1981). Metal sulfiderne og metallisk sølv har en katalytisk virkning på reduktionen af sølvioner. Kolloidalt guldmetal i væv kan også vises med en fysisk fremkalder, og dette er blevet udnyttet 10 af Holgate et al. (J. Histochem. Cytochem. 31, 938-944, 1983)) til indføring af immunoguld/sølvfarvningsmetoden, som resulterer i en følsomhed, som er langt bedre end den oprindelige immunoguldfarvningsmetodes.

Hovedfordelen ved denne udførelsesform ligger i den meget store følsomhed, som overstiger følsomheden af alle andre eksisterende påvis-15 ningsmetoder til blot-overlejringsanalyse. Den kan også benyttes, når brugeren ønsker at økonomisere med mængden af reagenser, som anvendes, eller når der er ekstremt små mængder acceptorsubstans og/eller specifikt bindingsmiddel til rådighed.

I en yderligere udførelsesform anvendes et fotografisk fiksativ, 20 hvorved baggrunden mindskes, og stabiliteten af reaktionsproduktet af den fysiske fremkalder forbedres.

Opfindelsen belyses nærmere i de følgende eksempler.

Eksempel I

25 En simpel Spot-blot-overlejringsimmunoanalyse til indirekte påvisning af antistoffer mod hundehjernetubulin og -calmodulin med guldmærkede sekundære antistoffer i serum fra immuniserede kaniner.

1.1 Fremstilling af antisera 30 1.1 Fremkaldelse af antisera 1 mg hundehjernetubulin (ekstraheret fra SDS-polyacrylamidgel er) i 1,0 ml puffer (0,1M PIPES, pH 6,9) eller 1 mg elektroforetisk rent hun-dehjernecalmodul in (i H^O) blandedes med 1,0 ml komplet Freunds adjuvans 35 (DIFCO). Efter homogenisering injiceredes antigenet intradermalt 5 steder langs rygsøjlen på hvide kaniner. Boosterinjektioner blev givet hver 4. uge. Antigen fremstilledes på sairane måde, bortset fra at der anvendtes ukomplet Freunds adjuvans. 1 uge efter hver booster, tappedes 10

DK 160108 C

der blod fra kaninerne (±60 ml blod), og serum fremstilledes og opbevaredes i portioner ved -20°C indtil brug.

1.2 Kolloidalt guldmærkede sekundære antistoffer

Disse blev leveret fra Janssen Life Sciences Products, 2340 Beerse, Belgien. Kode: GAR G20. Der er tale om affinitetsrensede gedeantistoffer mod kanin IgG, som er mærket med 20 nm kolloidale guldpartikler.

Fremstilling af nitrocellulosepapirstrimler med antigenholdige pletter Ti 10 μΐ dråber af 4-fold seriefortyndinger (begyndende med 250 ng//il) af ren tubulin i 0,1M PIPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, pH 6,75 eller ren calmodulin i HgO anbragtes som pletter i en række på tørre nitro-cellulosestriml er (6 cm x 0,6 cm). Når pletterne var tørret (ca. 5 minutter) undertryktes tilbageværende proteinbindingssteder på strimlerne ved inkubation med en opløsning af 5% okseserumalbumin (BSA) i 20 mM Tris-pufret saltvand, pH 8,2 i 30 minutter ved 37°C.

1.3 Testprotokol for påvisning af tubulin- og calmodul inantistoffer. Sammenligning af anvendelsen af guldmærkede antistoffer med ABC-peroxidasepåvisningsmetoden

Den under hele proceduren anvendte puffer var 0,1% BSA-Tris (0,1% BSA i 20 mH Tris-HCl, 0,9% NaCl pH 8,2, 20 mM NaN^), med mindre andet er anført.

a. Inkubation med primært antiserum 2 strimler inkuberedes med 1 ml kaninantitubulinserum, 1:1000 fortyndet i 0,1% BSA-Tris, i tilproppede 5 ml plastreagensglas ved stuetemperatur i 2 timer.

2 strimler inkuberedes som ovenfor med samme antiserum absorberet på tubulin bundet kovalent til Sepharose-4B for at tjene som kontrol for antigenspecificitet.

2 strimler inkuberedes som ovenfor med 1 ml kaninantical-modulinserum, 1:1000 fortyndet i 0,1% BSA-Tris, ved stuetemperatur i 2 timer.

2 strimler inkuberedes som ovenfor med samme absorberet på calmodulin bundet kovalent til Sepharose-4B.

Efter inkubation med de absorberede og ikke-absorberede primære an-tisera vaskedes strimlerne 3 x 10 minutter i 0,1% BSA-Tris. 1 strimmel 11

DK 160108 C

fra hvert par inkuberedes yderligere med GAR G20 (se 1.3.b).

Den anden inkuberedes med det meget følsomme Vectastain ABC immuno-peroxidaseudstyr fra Vector Laboratories anvendt i overensstemmelse med fabrikantens instruktioner (se 1.3.c).

5 b. Inkubation med guldmærket sekundært antistof: GAR G20

De vaskede strimler (se 1.3.a) inkuberedes med GAR G20, fortyndet til O.D. = 0,2 ’ 0,1% BSA-Tris + 0,4% gelatine, i 2 ti mer. Efter denne inkubation vaskedes strimlerne i 0,1% BSA-Tris i 2 x 10 10 minutter og lufttørredes.

c. Inkubation med Vectastainudstyret

De vaskede strimler (se 1.3.a) inkuberedes med sekundær biotinyle-ret antistofopløsning (1:200 i 0,1% BSA-Tris) i 1 time. Strimlerne va-15 skedes i et overskud af 0,1% BSA-Tris i 3 x 10 minutter og inkuberedes derefter i avidin-biotinylperoxidasekomplekset i 1 time. Komplekset fremstilledes i henhold til fabrikantens instruktioner: 100 /il reagens A (avidin DH) sattes til 10 ml PBS (Dulbecco's, uden Mg2+ og Ca^+). 100 /il reagens B (biotinyleret peberrodsperoxidase) tilsattes under kontinuert 20 omrøring. Komplekset anvendtes efter 5 minutter. Strimlerne vaskedes i 0,1% BSA-Tris (2 x 10 minutter) og derefter i 100 mM Tris-HCl-puffer, pH 7,6. Den immobil iserede peroxidase gjordes derefter synlig med 4-chlor-1-naphtol som substrat: 20 mg 4-chlor-l-naphtol opløstes i 1 ml ethanol og fortyndedes yderligere med 20 ml 100 mM Tris-HCl-puffer, pH 7,6, op-25 varmet til ca. 50°C. 200 /il 1% H2O2 tilsattes, og substratopløsningen anbragtes på strimlerne med en sprøjte gennem et mikrofilter (0,2 μm, millipore) monteret på sprøjten. Reaktionen fik lov til at forløbe i 5 minutter og blev afbrudt ved, at strimlerne vaskedes med H2O og lufttørredes.

30 1.4 Vurdering

Ved ABC-proceduren påvises positiv reaktion som en blå farve. Når kolloidalt guld anvendes, opnås der ved positiv reaktion en lyserød-rød-lig farve med den anvendte guldparti kel størrelse (større guldpartikler, 35 for eksempel 40 nm giver en purpuragtig farve). Følsomheden er den samme for begge metoder og er i størrelsesordenen 5 ng//il for tubulin og 30 ng//il for calmodulin under de anvendte betingelser. Specificiteten vises ved den negative reaktion, når de pågældende antisera adsorberes af de- 12

DK 160108 C

res respektive antigen.

Eksempel II

Screening for tilstedeværelse af monoklonale museantistoffer for mikrotubulusassocierede proteiner i kultursupernatanter fra hybridomer i vækst under anvendelse af guldmærkede gedeantistoffer mod muse IgG.

2.1 Immunisering af mus

Hus (Balb/C) fik injiceret en homogeniseret blanding (se eksempel 1.1) rottehjernemikrotubulusproteiner (100 øg/mus) (fremstillet ved to cykler af temperaturafhængig polymerisation-depolymerisation) og komplet Freunds adjuvans. Injektioner gives subkutant 5 steder på ryggen. Boosteri njektioner af antigen (100 øg) fremstillet med ukomplet Freunds ad-juvans blev givet 3 gange med 14 dages mellemrum. 3 dage før fusion af miltcellerne med myelomcellelinien boostedes mus ved intravenøs injektion af 50 øg antigen/mus i 100 øl PBS-puffer.

2.2 Fusion af miltceller med NS-1-myelomceller NS-l-celler fusioneredes med miltceller fra to immuniserede mus på kendt måde, og de resulterende hybridomer dyrkedes i 5 plader med 96 fordybninger (Nunc) ved 37*C i en vandmættet atmosfære indeholdende 7% C02· Efter ca. 2 ugers vækst udtoges 100 øl af kultursupernatanten fra fordybninger indeholdende hybridomer i vækst og testedes for tilstedeværelse af udskilte monoklonale antistoffer (se 2.4).

2.3 Fremstilling af nitrocellulosepapirstrimler, på hvilke et mønster af proteiner fra en SDS-polyacrylamidgel er blevet bundet ved elektroblotting SDS-polyacrylamidgel elektroforese af antigenet (2 x polymeriserede mikrotubulusproteiner) udførtes efter Laemmlis metode på en 7,5% gel. Antigenet, som var opløst og kogt i prøvepuffer, fyldtes oven på stab-lingsgelen som et kontinuert lag, 300 øg pr. gel. Når farvefronten havde migreret 3 cm ind i separeringsgelen, blev elektroforesen afbrudt. En lille lodret strimmel af gelen blev udskåret til "coomassie blue" farvning, og resten anvendtes til elektroblotting på nitrocellulosepapir. Gelen ligevægtsindsti 11 edes i overføringspuffer [25 mM Tris-192 mM gly-cin/20% (vol/vol) methanol ved pH 8,3] i 30 minutter ved stuetemperatur. Gelen anbragtes på et nitrocelluloseark (udblødt i puffer på forhånd), 13

DK 160108 C

og der blev draget omsorg for at undgå eller fjerne alle indesluttede luftbobler. Arket anbragtes mellem to stykker filterpapir, som var udblødt på forhånd, og to nylonnetpuder. Dette resulterede i en tæt pasning i et lukket elektrodeskellet i et EC-elektroblotapparat, hvori 5 elektroblotting udførtes natten over ved 400 mA ved stuetemperatur. Efter elektroforetisk overførsel undertrykkedes resterende proteinbindingssteder på nitrocellulosepapirarket ved inkubation af arkene i 5% BSA i 20 mM Tris-pufret saltvand, pH 8,2 i 30 minutter ved 37*C. Nitro-cellulosearket blev derefter udskåret i 3 mm brede strimler parallelt 10 med elektroforeseretningen. Disse strimler anvendtes til screening af supernatanten for hybridomceller.

2.4 Påvisning af monoklonale antistoffer 100 μΐ af hver hybridomkultursupernatant overførtes til 3,5 cm lan-15 ge 0,5 ml Eppendorf tips og fortyndedes 1:5 med 0,4 ml 0,1% BSA-Tris. Tips og strimler forsynedes med et kodenummer. Hver tip forsynedes med 1 strimmel og de inkuberedes i 2 timer. Strimlerne vaskedes portionsvis i et overskud af 0,1% BSA-Tris og inkuberedes også portionsvis med GAM G20 (gedeantimuse IgG, mærket med 20 nM kolloidale guldpartikler) fra 20 Janssen Life Sciences Products, 2340 Beerse, Belgien. GAM G20 fortyndedes med 0,1% BSA-Tris + 0,4% gelatine til en O.D. ^o^nm " og omsattes natten over. Strimlerne vaskedes med 0,1% BSA-Tris og HgO og lufttørredes.

Positiv reaktion var klart synlig som lyserøde til rødlige bånd (se 25 vedføjede eksempler) svarende til proteinbånd med en given molekylmasse. Denne meget simple screeningsprocedure ikke blot identificerer antistof-udskillende hybridomer, men giver også umiddelbar information om specificiteten af det pågældende antistof og er derfor til stor hjælp ved udvælgelse af interessante antistofudskiIlende hybridomer.

30

Eksempel III

En sandwichimmunoblot-overlejringsanalyse til påvisning af antigener i en vandig testprøve: påvisning af IgGér i en vandig testprøve.

35 3.1 Analyseprincip

En lille dråbe (±1 μΐ) af et renset eller beriget antistof, som er monospecifikt for antigenet, som skal bestemmes, bindes ved blotting på en strimmel nitrocellulosepapir (eller et hvilket som helst bekvemt 14

DK 160108 C

blottingmedium), tørres, og fri proteinbindingssteder undertrykkes (se eksempel 1.3). Disse antistofholdige undertrykte strimler kan eventuelt vaskes i vand, lufttørres og opbevares. Strimlen inkuberes derefter med et volumen antigenholdig testopløsning i et fast tidsrum. Efter udvaskning af ikke-bundne stoffer inkuberes strimlerne yderligere med passende fortyndet, med kolloidale metal parti kl er (for eksempel en sol af guld eller sølv) mærket monospecifikt antistof lig det, der er adsorberet på aftrykningsmediet. Eventuelt kan der anvendes to monoklonale antistoffer, som genkender forskellige antigeniske epitoper. Det ene knyttes til blottingmediet, det andet knyttes til kolloidale metal parti kl er. Under faste betingelser vil analysen være i stand til at påvise en forudbestemt minimal koncentration af antigen og kan anvendes som en kvalitativ diagnostisk test, forudsat at den kan påvise en som minimum nødvendig koncentration i en given testopløsning.

3.2 Eksempel på princippet: påvisning af kanin IgGér i en pufret opløsning af kanin IgG med kendt koncentration For at afprøve muligheden for at realisere denne nye sandwichanalyse udførtes følgende forsøg: 6 strimler nitrocellulosepapir på 6 x 0,6 cm forsynedes med dråber (1 μΐ) indeholdende faldende mængder (½ fortyndingsrække begyndende ved 125 ng/μΐ) affinitetsrensede gedeantistoffer mod kanin IgG (GAR IgG) som beskrevet 1 eksempel 1.2.

Resterende proteinbindingssteder undertrykkedes som beskrevet i eksempel 1.2. 1 strimmel (nr. 6) vaskedes i 20 mM Tris-puffer-sal tvand, sugedes tør på filterpapir, lufttørredes og anvendtes efter tør opbevaring natten over ved stuetemperatur.

De resterende 5 strimler inkuberedes i tilproppede plastreagensglas 1 30 minutter ved stuetemperatur som følger: nr. 1: med RIgG, 1 ml, 1 øg/ml, nr. 2: med RIgG, 1 ml, 0,25 jig/ml, nr. 3: med RIgG, 1 ml, 0,063 øg/ml, nr. 4: med RIgG, 1 ml, 0,015 øg/ml, nr. 5: med RIgG, 1 ml, 0 øg/ml.

Kanin IgG fortyndedes i 0,1% BSA-Tris. Strimmel nr. 6 inkuberedes med 0,25 øg/ml RIgG.

15

DK 160108 C

Strimlerne vaskedes 2 x 10 minutter i 0,1% BSA-Tris.

Alle strimlerne inkuberedes i nøjagtig 1 time ved stuetemperatur i GAR G20 (gedeantistoffer mod kanin IgG, mærket med kolloidale guldpartikler på 20 nm i diameter) fra Janssen Life Sciences Products, 2340 Beerse, Belgien.

GAR G20 fortyndedes til en O.D. 520^ * 0,2 med 0,1% BSA-Tris + 0,4% gelatine.

Strimlerne vaskedes med 0,1% BSA-Tris efterfulgt af vand og lufttørredes.

3.3 Vurdering

Pletter indeholdende så lidt som 15 ng adsorberet GAR IgG blev synlige som lyserøde pletter efter inkubation i kun 30 minutter i 1 ml af en opløsning indeholdende 15 ng/ml RIgG efterfulgt af inkubation med 1 ml GAR G20, 0,0520 nm - 0,2 i 1 time. Opløsninger indeholdende mindst denne mængde RIgG ville være blevet anført som positive. Resultatet for strimmel nr. 6 er identisk med resultatet fra strimmel nr. 2, hvilket indikerer, at strimlerne kan tørres efter undertrykkelsestrinnet under bibeholdelse af antistofaktiviteten.

Eksempel IV

Direkte påvisning af et antigen knyttet til NC-papir med kolloidalt sølvmærket primært antistof: påvisning af pletter af muse IgGér ved hjælp af med kolloidalt sølv mærkede gedeantistoffer mod muse IgG. NC-papirstrimler (6 cm x 0,6 cm) forsynedes med pletter af muse IgG (1 μΐ) indeholdende en 2-fold seriefortynding fra 250-0,4 ng/μΐ, som beskrevet i eksempel 1.2.

De resterende proteinbindingssteder undertrykkedes som i eksempel 1.2.

Strimlerne inkuberedes med med kolloidalt sølv mærkede gedeantistoffer mod muse IgG (fra E.Y. Laboratories, SP-0011), fortyndet 1:100 i 0,1% BSA-Tris, i 1 time og 30 minutter ved stuetemperatur.

Strimlerne vaskedes 2 x 10 minutter med 0,1% BSA-Tris HgO og lufttøredes.

Positive pletter karakteriseredes ved en gul farve. Under disse betingelser kunne ±30 ng i en 1 μΐ plet påvises.

16

DK 160108 C

Eksempel V

Testning af specificiteten af et affinitetsrenset kaninantistof mod kyllingekråseactin for actin i et totalt cellelysat af sekundære kulturer af kyllingeembryolungeepithelceller ved anvendelse af en blot-overlejringsanalyse og guldmærket sekundært antistof efterfulgt af sølvforstærkning.

5.1 Fremstilling af antiactinantiserum

Elektroforetisk rent kyllingekråseactin homogeniseredes og injiceredes i kaniner som beskrevet for tubulin og calmodulin i eksempel 1.1. Serum fremstilledes og opbevaredes som beskrevet i eksempel 1.1.

5.2 Affinitetsrensning af antistoffet mod actin

Actin kobledes til Sepharose-4-B-CNBr (Pharmacia) i overensstemmelse med fabrikantens instruktioner. Antistoffet rensedes direkte fra serum. Sidstnævnte inkuberedes med den antigenholdige gel. Der anvendtes 20 ml serum til 10 mg koblet antigen. Efter 2 timers inkubation hældtes gelen i en kolonne og vaskedes med 10 mH Tris-pufret saltvand (TBS), indtil O.D. ved 280 nm var næsten nul. Ikke-specifikt adsorberende materiale elueredes med TBS indeholdende IH NaCl efterfulgt af vask med TBS. Det specifikke antistof elueredes med 0,1M glycin-HCl-puffer ved pH 2,8. 1 ml fraktioner neutraliseredes straks med 100 /il IH Tris-HCl-puffer, pH 8,5. Antistofkoncentrationen måltes ved 280 nm under anvendelse af en EJ% 14,3. Portioner af de eluerede antistoffer opbevaredes ved -20°C uden yderligere behandling.

5.3 Dyrkning af kyllingeembryolungeepithelceller

Embryoniske kyllingelungeepithelceller isoleredes fra 14 dage gamle kyllingeembryolunger. Vævet fintdeltes manuelt og tryptini seredes i 2+ 2+

0,25% trypsin i Ca og Hg fri Hanks balanceret saltopløsning ved 37°C

i 20 minutter. Reaktionen blev afbrudt med medium og 10% FCS. Efter cen- 2 tri fugering og resuspension overførtes cellerne til en 75 cm T-kolbe og henstilledes for tilknytning i 12 til 24 timer, før mediet ændredes. Efter 3 til 5 dage under kultur tryptini seredes cellerne kortvarigt (2 til 3 minutter i 0,25% trypsinopløsning) og blev udstrøget på petriskåle, 9 cm 0, og anvendtes efter 3 til 5 dage under kultur, når cellerne var sammenflydende. Cellerne dyrkedes i Eagles minimum essentielle medium suppleret med ikke-essentielle aminosyrer og 10% kalvefosterserum i en 17

DK 160108 C

atmosfære af fugtig luft indeholdende 5% C02 ved 37°C.

5.4 Fremstilling af totalt celle-SDS-lysat af kvllingeembryolungeepi-thelceller ?+ ?+ 5 Celler dyrket i petriskåle, 9 cm 0, vaskedes i Ca og Mg frit PBS (Dulbecco's) og opsamledes med en gummibeklædt spatel og nedsænkedes i absolut acetone ved -20°C i Eppendorf tip (1,5 ml). Acetonen afdampe-des, og den tørre celleremanens opløstes i kogende SDS-prøvepuffer indeholdende 1 mM TAME (en proteaseinhibitor). Uopløselige rester efter cen-10 trifugering bortkastedes. SDS-geler (ifølge Laemmli) af dette lysat seriefortyndet med prøvepuffer og farvet med "coomassie blue" anvendtes for at vurdere den mest passende fortynding af prøven. 1:16 anvendtes til den efterfølgende elektroforetiske overførsel til en Gene screen membran (fra NEN). 1 overføringsenhed dannedes af 1 bane af et sådant 15 fortyndet lysat og 1 bane af en blanding af rensede referenceproteiner: Ch.g. filamin, Ch.g. myosin (H + L Chain), Ch.g. α-actinin, BSA, rotte-ti jernetubul in, svinemavetropomyosin, hver med 0,06 /tg pr. bane.

Pufferfronten fik nu lov til at nå bunden af gelen, og elektroforetisk overførsel til Gene screen membranen udførtes nøjagtig som i ek-20 sempel 2.3. Blotenheden blev udskåret og de resterende proteinbindingssteder undertrykt som beskrevet i eksempel 1.2 og 2.3. Inkubation med antistof mod actin (0,5 /zg/ml) og GAR G20 (O.D. 520 nm « 0,2), og fortynding af GAR G20 med 0,1% BSA-Tris + 0,4% gelatine udførtes i lukkede plastposer af omtrent samme størrelse som arket i 2 timer hver på samme 25 måde som beskrevet i eksempel 2.4.

Efter 2 timers inkubation med GAR G20 vaskedes arkene med 0,1% BSA-Tris og forberedtes til sølvforstærkning. På dette tidspunkt var et ly-serødt-rødligt bånd med samme mobilitet som actin i lysatet og svarende til actin i proteinblandingen allerede synligt.

30 5.5 Sølvforstærkning

Arkene vaskedes i 2 minutter i 1:10 fortyndet citratforrådspuffer. Denne puffer indeholder 100 ml 25,5 g trina-triumcitrat og 23,5 g citronsyre til et pH på 4.

35 - Arkene inkuberedes derefter i 15 minutter omhyggeligt beskyttet mod lys i en fysisk fremkalder indeholdende 60 ml deioniseret H20, 0,85 g hydroquinon i 15,0 ml deioniseret H20, 18

DK 160108 C

10 ml citratpuffer pH 4, 0,11 g sølvlactat i 15,0 ml deioniseret HgO.

Sølvlactatet beskyttes omhyggeligt mod lys og tilsættes de andre komponenter lige før brug.

5 - Efter reaktionstiden vaskedes arkene i et overskud af

HgO og behandledes med Agefix (1:4 1 H20), et fotografisk fiksativ.

Arkene vaskedes igen 1 et overskud af H2O og lufttørredes.

10 5.6 Resultater Båndet, som tidligere kunne ses som et lyserødt-rødligt farvet bånd, var nu blevet dybt sort. Antistoffet mod actin kan anses for ekstremt specifikt og har givet tilfredsstillende resultater for immunocy-15 tokemisk farvning af actinholdige strukturer i de dyrkede celler.

5.7 Konklusion

Denne sølvforstærkning øger påvisningsmetodens kontrast og følsomhed stærkt. For eksempel var påvisningsgrænsen 3 1 stedet for 30 ng/plet 20 efter kun 5 minutters reaktion, hvis prøven i eksempel IV, der farvedes med antistoffer mærket med kolloidalt sølv, fremkaldtes yderligere.

A

V

Claims (12)

1. Fremgangsmåde til påvisning og/eller bestemmelse ved blot-overlejringsanalyse af et agglomerat dannet af et bindingsmiddel og den tilsvarende acceptorsubstans omfattende i) immobilisering af acceptorsubstansen på et blottingmedium ved direkte adsorption og/eller covalent binding og undertrykkelse af de tilbageværende bindingssteder, eller immobilisering af acceptorsubstansen på et blottingmedium ved at lade acceptorsubstansen blive bundet af et specifikt bindingsmiddel, som er blevet immobiliseret på blottingme-diet, efterfulgt af undertrykkelse af tilbageværende bindingssteder, KENDETEGNET ved, at i i) blottingmediet yderligere bringes i kontakt med et bindingsmiddel mærket med kolloidale metal parti kl er, eller blottingmediet bringes i kontakt med et umærket specifikt bindingsmiddel og efterfølgende med for det umærkede specifikke bindingsmiddel specifikt protein mærket med kolloidalt metal; og iii) med det blotte øje eller under anvendelse af spektrofotome-triske teknikker, eventuelt efter påføring af en fysisk fremkalder, påviser eller bestemmer det farvede signal, som frembringes af og er karakteristisk for de bundne kolloidale metal parti kl er på stedet mellem det specifikke bindingsmiddel og den tilsvarende acceptorsubstans ved blottingmediets overflade.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at der som specifikt bindingsmiddel benyttes et specifikt bindende protein.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, KENDETEGNET ved, at blottingmediet vaskes før aflæsning af signalet ved overfladen deraf.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, KENDETEGNET ved, at der som kolloidale metal parti kl er anvendes guld, sølv, platin eller forbindelser af disse metaller eller jern- eller kobberforbindelser med en partikelstørrelse mellem 3 nm og 100 nm.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, KENDETEGNET ved, at der som kolloidale metal parti kler anvendes guld eller sølv med en partikelstørrelse mellem 3 nm og 100 nm. DK 160108 C

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, KENDETEGNET ved, at der benyttes guld og/eller sølv med en partikelstørrelse mellem 5 og 50 nm.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, KENDETEGNET ved, at den endelige påvisning af de kolloidale metal parti kl er gennemføres efter anvendelse af en fysisk fremkalder.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, KENDETEGNET ved, at der som fysisk fremkalder anvendes en som indeholder sølvioner og et reduktionsmiddel.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, KENDETEGNET ved, at der benyttes en fysisk fremkalder, som indeholder sølvlactat eller sølvnitrat.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, KENDETEGNET ved, at der benyttes en fysisk fremkalder, som indeholder hydroquinon.

11. Testudstyr til påvisning eller bestemmelse af en af komponenterne i reaktionen mellem et specifikt bindingsmiddel og den tilsvarende acceptorsubstans ifølge generelle metoder til blot-overlejringsanalyse, KENDETEGNET ved, at det omfatter a) med kolloidale metal parti kl er mærkede komponenter, som forårsager et farvet signal på reaktionsstedet mellem acceptorsubstansen og det specifikke bindingsmiddel ved overfladen af et blottingmedium; b) komponenter til en fysisk fremkalder; og c) andre reagenser.

12. Testudstyr ifølge krav 11, KENDETEGNET ved, at de andre reagenser er valgt blandt i) puffere ii) ikke-mærket bindingsmiddel og i i i) en fikserende opløsning.