CN1483040A - 心锚蛋白重复蛋白基因上游序列、含有该序列的载体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新启动子序列，它们来源于CARP蛋白(心锚蛋白重复蛋白)基因编码序列上游的一部分，能够控制转基因在心肌细胞中体内表达的水平和特异性。本发明描述了新组合物、构建体、载体及其在向心肌细胞中体内转移和表达核酸中的体内用途。本发明的主题也包括启动子序列在生产作为研究某些心脏病的模型的转基因动物中的用途。

Description

心锚蛋白重复蛋白基因上游序列、 含有该序列的载体及其用途

发明领域

本发明涉及生物学领域。具体涉及基因表达靶向领域，更具体而言，涉及用于转基因特异性表达的新系统的设计与发展。本发明的主题具体是能够控制心肌细胞中转基因体内表达的水平和特异性的新启动子序列。本发明描述了能够控制和指导心肌细胞中核酸表达的新型组合物、构建体和载体。由本发明衍生的用途很多，例如在实验、临床、治疗和诊断领域，更具体而言，对于某些心脏病的治疗和/或预防。

发明背景

对于许多用途而言，控制转基因表达的水平和靶向是必要的。因此，对于基因治疗，治疗成功可能需要由转基因合成的蛋白质之靶向作用，从而使得有可能限制副作用的扩散。转基因动物的构建和基因作用的研究都是能够采用适当控制蛋白质表达的特异性并能产生改进的例子。

在这方面，已经检验了多种启动子指导心特异性表达的能力。具体包括编码下列物质的基因的启动子：大鼠心肌球蛋白轻链(MLC-2)(Henderson S.A.等人，J Biol Chem，264(1989)18142-8；Lee K.J.等人，J Biol Chem，126(1992)15875-85)、小鼠心α-肌动蛋白(Biben C.等人，Dev Biol，173(1996)200-12)、利尿因子(ANF)(Harris A.N.等人，J MolCell Cardiol，29(1997)515-25)、α-或β-肌球蛋白重链(α-或β-MHC)(Colbert M.C.等人，J Clin Invest，100(1997)1958-68)、兔肌肉肌酸激酶(MCK)(Vincent C.K.等人，M0l Cell Biol，13(1993)567-74)或心肌钙蛋白T(US 5,266,488)。

公知这些启动子能提供一定程度的组织特异性，也公知其活性水平大大低于那些所谓的强启动子，通常低10-100倍，以致不能真正地展望其治疗用途。

例如，Franz W.M.等人(Cardiovasc Res，35(1997)560-6)和Griscelli F.等人(C R Acad Sci III，320(1997)103-12)表示，腺病毒构建体中编码大鼠α-MHC和MLC-2的基因的上游序列的活性水平大大低于RSV(劳斯肉瘤病毒)启动子，大约低10倍。

因此更准确地说，本申请涉及一种来源于CARP(心锚蛋白重复蛋白)基因上游区的新启动子序列。它不仅能指导心特异性表达，而且显示与强启动子如CMV(巨细胞病毒)启动子相当的高水平的体内表达。

曾经研究了CARP蛋白，并在小鼠(Zou Y.等人，Development，24(1997)793-804)、兔(Aihara Y.等人，Biochim Biophys Acta，28(1999)318-24)和人(Chu W.等人，J Biol Chem，270(1995)10236-45)中对其基因的编码部分进行了测序，CARP蛋白是区别MLC-2v基因表达调节中作用于同源框基因Nbx2.5下游的心肌细胞的第一种标记物之一。

Kuo H.等人(Development，126(1999)4223-34)克隆了一条10Kb的片段，并且对小鼠CARP基因编码序列上游的2.5Kb片段进行了测序。该片段在5’具有缺失，显示位于核苷酸-166与+47之间(相对于转录位点+1)的启动子的213bp区足以在体外引起心特异性表达，这提示在5’端存在控制启动子特异性的元件。Kuo等人也生产了含有CARP基因上游2.5Kb片段的转基因小鼠系，在胚胎发育早期，转基因在心肌和骨骼肌细胞中显示特异性表达，这种表达在发育过程中受到抑制。

申请WO 00/15821描述了小鼠CARP基因编码序列上游5’中的一部分，相对于转录位点+1，它位于核苷酸-2285与+62之间。利用腺病毒载体特别评价了该序列的体内活性。但是获得的活性水平仍然极低，因此发现，为了检测体内活性，分离位于腺伴随病毒两个反向末端重复序列(AAV-ITR)之间的启动子序列是必要的。

申请人致力于更好地表征CARP蛋白基因5’中的区域。从而能鉴定CARP基因上游的一种新序列，并且证明这种新序列的意料之外的和有利的特性，特别是体内活性水平的显著提高。

发明人确实惊奇地发现，这种新鉴定的序列不引起明显的体外表达，相反能获得水平极高的体内活性，与所谓的强启动子相当，而且在心脏组织中的表达保持较高的选择性。

发明内容

因此本发明的主题是一种多核苷酸，其含有CARP蛋白基因编码序列上游的一部分，或者在高严格条件下与该上游序列杂交的一部分，该多核苷酸能够诱导在其控制下的转基因在心脏组织中的特异性表达。

本发明也涉及天然来源的或者通过化学合成获得的任何一种多核苷酸，其显示与序列SEQ ID NO：1有至少93％，优选地至少95％的同一性。更优选地，根据本发明的多核苷酸显示与序列SEQ ID NO：1有至少98％的同一性。

表述“天然来源的多核苷酸”是指利用限制酶酶切细胞DNA获得的基因组DNA片段。

表述“通过化学合成获得的多核苷酸”是指通过自动合成，例如利用适当的自动装置产生的DNA片段。

对于本发明而言，术语“高严格条件”具有Maniatis等人，1982(《分子克隆，实验室手册》，Cold Spring Harbor CSH，N.Y.，USA)或其最新版本之一所述的含义。例如，为了除去未杂交的片段，杂交条件是在0.2 SSC和0.1％SDS存在下，在65℃下洗涤3次。

表达的“特异性”特征是指在心脏组织的细胞中启动子的活性显著提高。尽管在其它细胞中也可能存在非特异性表达，但是与在心脏细胞中所见的相比，相应的活性水平通常极低(可以忽略)，一般至少低10倍。

就此而言，实施例的结果显示表达的差异可达1000倍，这反映了根据本发明的多核苷酸在体内心脏细胞中的高选择性。

而且，下列实施例的结果清楚地表明，使用多核苷酸使本发明的系统具有高水平的表达，高于已知为心脏组织特异性的其它启动子，相差可能超过100倍。因此这些元件说明了根据本发明的多核苷酸在心脏组织中目的核酸的表达强度和特异性方面的优点和意料之外的特性。

根据本发明的多核苷酸有利地在-2266与+92之间(相对于转录位点+1)含有一部分序列，其序列SEQ ID NO：1在附录中列出。

因此本发明的主题是在高严格条件下可与序列SEQ ID NO：1杂交的序列。

但是本发明不限于含有小鼠基因上游片段的多核苷酸，而是涉及具有相同特性的任何功能变体或其它任何种的其它任何序列，即能够特异性诱导转基因在心脏组织中的体内表达。

因此，本领域技术人员能方便地参考在GenBank以AF131884保藏的人类基因上游序列，其序列SEQ ID NO：2在附录中列出。因此本发明涵盖含有CARP蛋白基因上游序列片段的任何序列，例如由于特定结构缺失而修饰，并且保留与序列SEQ ID NO：1相同或相似的功能。

优选地，根据本发明的多核苷酸显示与序列SEQ ID NO：2有至少80％，更优选地至少90％的同一性。

表述功能变体是指保留上述多核苷酸的特性的任何修饰序列。修饰包括所述序列中核苷酸添加、突变、缺失和/或置换中的一种或多种。这些修饰可以通过常规分子生物学方法引入，如定点诱变，或者用更实用的方法，用合成仪人工合成该序列。然后检测获得的变体控制心肌细胞中的表达特异性的能力，与具有序列SEQ ID NO：1的多核苷酸相比较。

本发明的另一个主题涉及一种表达盒，它包含如上所述的多核苷酸，与一种转基因有效连接，使得后者在心肌中的表达被特异性引导。

有利地，本发明的盒还包含一种转录终止信号，其位于转基因核苷酸序列的3’。

优选地，该转基因含有一种具有治疗用途的核酸，该核酸编码可能与心脏病(如心功能不全、心脏肥大、缺氧、局部缺血或心脏移植排斥)有关的蛋白质或RNA。

具有治疗用途的蛋白质尤其包括：

-诱导血管形成的蛋白质，如VEGF家族的成员，FGF家族的成员，更具体而言，如FGF1、FGF2、FGF4、FGF5、血管生成素、EGF、TGFα、TGFβ、TNFα、分散因子/HGF，angiopoietin家族的成员，细胞因子，特别是白介素，包括IL-1、IL-2、IL-8、血管紧张肽-2、纤溶酶原激活物(TPA)、尿激酶(uPA)，参与活性脂(前列腺素，Cox-1)合成的分子；

-参与控制心肌收缩性的蛋白质，如受磷蛋白、受磷蛋白抑制剂、SERCA-2a、β2-肾上腺素能受体或肌营养不良蛋白或小肌营养不良蛋白(FR 91 11947)；

-具有冷冻保护活性，特别是可阻断凋亡的蛋白质，如bcl家族成员的蛋白质和蛋白质激酶如AKT/PKB；

-转录因子，如天然或嵌合核受体，其含有DNA结合域、配体结合域和转录激活或抑制域，如融合蛋白tetR-NLS-V16、来源于雌激素受体的融合蛋白、来源于类固醇激素受体的融合蛋白、来源于孕酮受体的融合蛋白、CID(二聚化的化学诱导剂)系统的蛋白质，如Rivera等人(Rivera等人，Nature Medicine，2(1996)1028-1032)所述。嵌合核受体具体可包括：核受体PPAR(过氧化物酶体增殖物激活的受体)，特别是PPARγ2，如申请WO 96/23884和FR 99 07957和Frohnert等人(J Biol Chem 274(1999)3970-3977)和Mukherjee等人(J Biol Chem272(1997)8071-8076)所述，其或为天然形式，一级结构没有修饰，或者是含有一个或多个配体结合位点或E/F域的修饰PPARγ2(Schoonjans等人，Biochim.Biophys.Acta.1302(1996)93-109)，如具有序列SEQ ID NO：3的PPARγ2γ2；

-免疫抑制剂，如白介素2和10，它们能完全或部分抑制免疫信号传导途径，从而延长心脏移植的持续时间；

-作为试剂参与缓解缺氧的蛋白质，如NOS(氧化氮合成酶)、B细胞白血病/淋巴瘤2(bcl-2)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶。

具有治疗用途的RNA可包括，例如：反义RNA，按照专利EP 140308所述的技术，它们可用于控制基因表达或细胞mRNA转录，从而阻断翻译为蛋白质，以及如EP 321 201所述能选择性破坏靶RNA的核酶。

应当认为，本发明不限于蛋白质或RNA的具体实例，本领域技术人员能通过简单的实验操作，利用它们在心脏细胞中表达任何核酸。

本发明的主题还包括含有根据本发明的多核苷酸或表达盒的载体。这种载体可含有转基因在靶组织中表达所需的其它任何DNA序列，尤其是含有在心脏细胞中有效的复制起点。

本发明的载体可以是不同性质和/或不同来源的，特别是来源于质粒、附加体、染色体、病毒或噬菌体。优选地是质粒或重组病毒。

为了说明含有多核苷酸或表达盒的质粒，例如可以提到质粒pXL3634、pXL3728和pXL3759，它们在下文描述。

根据第一个实施方案，根据本发明的载体是质粒类型的。质粒载体包括本领域技术人员周知的任何克隆和/或表达质粒，它们一般含有一个复制起点。也包括携带复制起点和/或已经确定的标记的新一代质粒，如申请WO 96/26270所述。

根据一个优选实施方案，质粒载体是一种小质粒，含有一个复制起点，它在宿主细胞中的功能性需要存在至少一种对于该细胞而言特异且外源的蛋白质。申请WO 97/10343中具体描述了这类载体。

根据第二个实施方案，根据本发明的载体是病毒载体。后者包括重组腺病毒、重组腺伴随病毒、重组逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒和痘苗病毒，它们的制备可以按照本领域技术人员周知的方法进行。优选地使用嵌合病毒载体，如申请WO 95/22617所述的腺病毒-逆转录病毒嵌合载体，以及Leblois等人(Mol Ther(2000)1(4)，314-322)和申请WO 97/47757所述的附加体/腺病毒载体。

当根据该实施方案使用腺病毒时，优选地是来源于缺陷腺病毒的载体，即它们在靶细胞中不能自主复制。这类缺陷病毒的构建以及它们的传染性在文献中已有广泛描述(具体参见，S.Baeck和K.L.March，Circul.Research，82，(1998)295-305；T.Shenk，B.N.Fields，D.M.Knipe，P.M.Howley等人(1996)，腺病毒科：病毒与复制(《病毒学》)211-2148，EDS-Ravens Publishers Philadelphia；Yeh，P.等人FASEB11(1997)615-623)。

已经表征了多种腺病毒血清型，它们的结构和特性略有不同。在这些血清型中，本发明优选地使用2型或5型人类腺病毒(Ad2或Ad5)或动物来源的腺病毒，如申请FR 93 05954所述，或混合来源的腺病毒。本发明能够使用的动物来源的腺病毒包括犬、牛、鼠(Beard等人，Virology 75(1990)81)、绵羊、猪、鸟或猿来源的腺病毒。动物来源的腺病毒优选地是犬腺病毒，更优选地是CAV2腺病毒(Manhattan或A26/61株)，如申请WO 94/26914所述。

本发明的缺陷腺病毒通常在每个末端含有反向末端重复序列(ITR)、允许包壳的序列(Psi)、E1基因和选自基因E2、E4和L1-L5中的至少一种，这些基因已经用本领域技术人员周知的任意一种技术灭活(Levero等人，Gene，101(1991)195，EP 185 573；Graham，EMBOJ.3(1984)2917)。

有利地，本发明中使用的重组腺病毒在其基因组的E1区含有缺失。更具体而言，包括E1a和E1b区的缺失。例如，影响核苷酸454-3328、382-3446或357-4020的缺失(对于Ad5的基因组)。

根据一个优选变化，本发明中使用的重组腺病毒还包括基因组E4区中的缺失。更具体而言，E4区中的缺失影响所有开放阅读框。例如33466-35535或33093-35535缺失。申请WO 95/02697和WO 96/22378中描述了E4区中其它类型的缺失，在此引用作为参考。

至于腺伴随病毒(AAV)，它们是相对较小的DNA病毒，能以稳定和位点特异的方式整合到所感染的细胞的基因组中。它们能感染广谱的细胞，而不诱发对细胞生长、形态学或分化的任何影响。而且，它们似乎与人类的病理学无关。AAV基因组已经克隆、测序并表征。它含有大约4700个碱基，在每个末端含有一个大约145碱基的反向末端重复序列(ITR)，作为病毒的复制起点。基因组的其余部分被分为两个具有包壳功能的必需区：基因组的左侧部分，含有参与病毒复制和病毒基因表达的rep基因；基因组的右侧部分，含有编码病毒衣壳蛋白的cap基因。

AAV衍生载体在体外和体内基因转移中的应用在文献中已有描述(具体见WO 91/18088；WO 93/09239；US 4,797,368，US 5,139,941，EP 488528)。这些申请描述了rep和/或cap基因已经缺失并被置换为目的基因的不同AAV衍生构建体，以及它们在体外(到培养的细胞上)或体内(直接到生物中)转移该目的基因中的用途。根据本发明的缺陷重组AAV可以如下制备：用含有以两个AAV反向末端重复序列(ITR)为界的本发明的核酸序列的一种质粒，和携带AAV包壳基因(rep和cap基因)的一种质粒，共转染被人辅助病毒(例如腺病毒)感染的一种细胞系。然后用常规技术纯化产生的重组AAV。

根据该实施方案也可以使用慢病毒；它们允许向静止细胞中转移和高效、稳定地整合目的基因。

例如动物慢病毒的HTLV-1，如FIV(猫传染性病毒)、EIAV(马传染性贫血病毒；WO 98/51810)、BIV(牛免疫缺陷病毒)、SIV(猿免疫缺陷病毒)、CAEV(山羊关节炎脑炎病毒)(WO 98/39463；Naldini等人，Science 272(1996)263-267；Schnele等人，Hum Gen Ther 11(2000)439-447)，或者与引起AIDS的病毒HIV-2(在人类中不是高度致病的)有关的一种慢病毒(Kundra等人，Hum Gen Ther 9(1998)1371-1380)。

表达盒可以在重组基因组的不同位点插入。它可以在E1、E3或E4区的水平上插入，置换抑制的或多余的序列。也可以在产生病毒所需的顺式序列(ITR序列和包壳序列)之外的其它任意位点插入。

然而应当指出，向上述载体中导入根据本发明的序列不是必需的，这样可以用含有这些序列的DNA直接转染心脏细胞。

根据本发明的核酸可以在该核酸与促进其进入细胞或转运到核中的化合物共价偶联之后导入，产生的偶联物任选地包封于聚合微颗粒中，如国际申请WO 94/27238所述。

根据另一个实施方案，该核序列可包含于一种转染系统中，该系统包括促进其进入细胞中的多肽，如国际申请WO 95/10534所述。

这些多核苷酸、表达盒和载体可以用本领域技术人员周知的任何方法原位施用，例如通过冠状输注(Barr等人，Gene Ther，1.(1994)51-58)、心内注射、心表注射，即通过心室壁(Guzman等人，Cir Res，73(1993)1202-1207)、心包内注射(Fromes等人，Gene Ther，6(1999)683-688)或通过冠状静脉回输(retrofusion)(Boeckstegers等人，Circulation，100(Suppl I)(1999)，I-815)。

根据本发明的多核苷酸、表达盒或载体可以以含有它们的组合物的形式方便地施用，例如利用促进转染心脏细胞的化学或生物化学转移剂。表述“化学或生物化学转移剂”是指促进核酸进入细胞中的任一化合物。可能包括：阳离子剂，如阳离子脂、肽、聚合物(聚乙烯亚胺、聚赖氨酸)、小颗粒，或非阳离子剂，如非阳离子脂质体、非阳离子小颗粒或聚合物，这些试剂本领域技术人员周知，尤其在申请WO95/18863、WO 97/18185和WO 98/15639中描述。

另外，本发明还涉及含有这些多核苷酸、表达盒或载体的药物，以及以药学有效的量含有它们和药学相容的赋形剂的药物组合物。

这些多核苷酸、表达盒或载体可方便地用于生产向心脏组织中施用的药物，它们尤其可表达编码目的蛋白质的基因，用于治疗心脏病，特别是治疗和/或预防心功能不全、缺氧、心脏肥大、心肌炎、心脏局部缺血，或者预防心脏移植中的排斥。

例如，这种药物可以含有根据本发明的表达盒或载体，根据希望治疗的心脏病，它能表达受损基因的功能形式。

对于可注射的，尤其是心内注射的制剂，药物组合物优选地含有药学可接受的载体。具体包括等渗、无菌盐溶液(磷酸一钠或二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等，或这些盐的混合物)，或干燥的，特别是冻干的组合物，视情况不同，它们在加入无菌水或生理盐水后，即配制成可注射溶液。也可以使用其它赋形剂，如水凝胶。这种水凝胶可以用任何生物相容的和无细胞毒性的聚合物(同聚物或异聚物)制备。例如在申请WO 93/08845中描述了这些聚合物。其中一些可以作为商品获得，特别是例如由乙烯和/或环氧丙烷获得的。可以根据不同参数调节注射用剂量，特别是根据使用目的(标记、病理学、筛查等)、将要表达的转基因或希望的表达时间。

根据本发明的重组腺病毒通常以10⁴-10¹⁴pfu，优选地以10⁶-10¹⁰pfu的剂量配制和施用。术语pfu(噬斑形成单位)对应于病毒溶液的感染力，通过感染适当的细胞培养物并测定感染细胞的噬斑数来确定。测定病毒溶液pfu滴度的技术在领域中众所周知。

另外，本发明的主题还包括一种表达具有治疗用途的转基因的方法，在该方法中使用根据本发明的多核苷酸、表达盒或载体，以使转基因能够表达。

此外，本发明还涉及用如上所述的表达盒或载体(特别是腺病毒)修饰的任何细胞。表述“修饰的”细胞是指含有根据本发明的多核苷酸或表达盒的任何细胞。这些细胞可以按照申请WO 95/14785所述的方法植入生物内。这些细胞基本上是人类心脏细胞。

本发明还涉及转基因动物，特别是携带上述多核苷酸或表达盒的小鼠，其中编码具有治疗用途的蛋白质的基因被置换为一种报道基因。这种转基因小鼠可用来根据对编码CARP蛋白的基因的调节序列的活性筛选分子。

可以对小鼠施用分子，在杀死后制备组织切片，来鉴定用报道基因染色的组织。

根据本发明的转基因动物也是用于了解遗传性心脏病(如心功能不全、心脏肥大、心脏增生和心肌梗死)分子机制的分子生物学研究工具。

例如，用于研究心肌炎的鼠模型，其中编码干扰素-1(IFN-1)的基因被灭活(Aitken等人，Circulation，90(1994)1-139)。

根据本发明的其它目的动物模型可含有根据本发明的多核苷酸，它们与转基因(如原癌基因或癌基因)相连接，例如与c-myc连接，形成缺氧模型(Jackson等人，Mol Cell Biol，10(1990)3709-3716)，与p21-ras连接，形成心室肥大模型(Hunter等人，J Biol Chem，270(1995)23176-23178)，为了研究某些心肌病，可含有EB病毒核抗原(Huen等人，J Gen Virol，74(1993)1381-1391)。

根据另一个实施方案，根据本发明的转基因动物形成心脏肥大实验模型，它们含有一种表达盒，其中转基因编码例如钙调蛋白(Gruver等人，Endocrinology，133(1993)376-388)、白介素-6或白介素-6受体(Hirota等人，Proc Natl Acad Sci，92(1995)4862-4866)、cardiotrophin-1(Pennica等人，Proc Natl Acad Sci，92(1995)1142-1146)，最后是α-肾上腺素能受体(Milano等人，Proc Natl AcadSci，92(1994)10109-10113)。

另外，经过修饰使得CARP基因表达增强的根据本发明的多核苷酸也是本发明的一部分。这样获得的转基因动物是心肌梗死的实验工具(Stanton等人，Circul Res，86(2000)939-945)。

为了实施本发明，本领域技术人员能方便地参考下列手册：“SAMBROOK等人，《分子克隆，实验室手册》，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，1989，或其最新版本之一。

通过下列实施例更详细地描述了本发明，应当认为这些实施例是说明性的，并且是非限制性的。

附图说明

图1：显示编码小鼠CARP蛋白的基因上游多核苷酸的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)；

图2：显示编码人CARP蛋白的基因上游多核苷酸的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)；

图3：是质粒pXL3634的图示；

图4：是质粒pXL3728的图示；

图5：显示质粒pXL3635和pXL3634的相对体外活性，相对于CMV启动子(pRL-CMV)的参照活性。每种启动子的活性代表用花虫(Renilla reniformis)萤光素酶活性标准化的萤火虫(Photinus Pyralis)萤光素酶活性。

图6A：是质粒pXL3759的图示；

图6B：是腺病毒AV1.0 CARP-luc+的图示；

图7A：显示对大鼠心内透膈注射不同量的质粒pXL3031和pXL3634 7天后的萤光素酶活性(pg萤光素酶/心脏)；

图7B：显示对大鼠心脏心内透膈注射25μg质粒pXL3031和pXL3635、pXL3130和pXL3153 7天后的萤光素酶表达(pg萤光素酶/心脏)；

图8：显示心内施用质粒pXL3031、pXL3634、pXL3635、pXL3153和pXL3130后获得的，随心脏表达而变化的心脏内萤光素酶表达与肌肉内表达之比。

实施例

实施例1：CARP基因上游多核苷酸的表征

克隆编码CARP蛋白的小鼠基因5’序列的2.3Kb BamHI-XhoI片段，利用测序酶试剂盒(United States Biochemical，Cleveland，Ohio)通过链终止法(Sanger等人，1977，PNAS，74，5463)对两条链进行测序。序列示于图1中，因此在核苷酸-2266与+92之间(相对于转录位点+1)含有编码小鼠CARP蛋白的基因上游的一部分(SEQ ID NO：1)。

实施例2：CARP质粒载体的构建

2.1质粒pXL3634

在实施例1中表征的2.3Kb BamHI-XhoI片段，在补平BamHI位点后克隆到预先用XhoI和SmaI消化的质粒pGL3-Basic(Promega)中，获得质粒pXL3634。图3显示该质粒的图示。

2.2质粒pXL3728

质粒pXL3728由质粒pXL3179获得，后者是一种来源于质粒pXL2774(WO 97/10343)的载体，其中导入编码人成纤维细胞干扰素信号肽与FGF1(成纤维细胞生长因子1)cDNA的融合体的基因(sp-FGF1，Jouanneau等人，PNAS 88(1991)，2893-2897)，置于从人巨细胞早期区(hCMV IE)获得的启动子和SV40病毒晚期区(GenBankSV4CG)的聚腺苷酸化信号控制下。

在实施例1中表征的2.3Kb BamHI-XhoI片段，在其末端补平后克隆到预先用XbaI和EcoRI消化的质粒pXL3179(pCOR CMV-FGF)中，获得质粒pXL3728。图4显示该质粒的图示。

2.3质粒pXL3729

将质粒pXL3634的EcoRI-SalI片段克隆到预先用EcoRI-SalI消化的质粒pXL3728中，获得质粒pXL3729。

实施例3：比较质粒

3.1质粒pXL3130和pXL3153

质粒pXL3130和pXL3153分别含有与CMV增强子(-522，-63)偶联的人平滑肌α-肌动蛋白启动子(-680，+30)和小鼠SM22启动子(-436，+43)，如申请WO 00/18908所述。

3.2质粒pXL3635

通过PCR从含有较长形式的RSV启动子(包含于Ad1.0RSVLAcZ中，Stratford-Perricaudet等人，J Clin Invest 90(1992)626-30)的构建体中克隆RSV-229，+34启动子，PCR中使用引物5’-GGC GAT TTAAAT AAT GTA GTC TTA TGC AAT-3’和5’-GGG GTC TAG AAGGTG CAC ACC AAT GTG GTG A-3’，它们分别在PCR片段的5’和3’引入一个SwaI和XbaI位点。然后利用这两个限制酶切位点将启动子片段导入pGL3-basic中，产生pXL3635。

3.2质粒pXL3031

质粒pXL3031如Soubrier等人，Gene Ther.6(1999)，1482-8所述。它是一种来源于质粒pXL2774(WO 97/10343)的载体，其中导入从pGL3basic(GenBank：CVU47295)中获得的编码修饰萤火虫(Photinuspyralis)萤光素酶的luc基因(细胞质)，置于从人巨细胞病毒早期区(hCMV IE，GenBank HS5IEE)获得的启动子和SV40病毒晚期区(GenBank SV4CG)的聚腺苷酸化信号控制下。

实施例4：细胞培养

建立大鼠心肌细胞的原代培养物。为此，在CO₂饱和的容器中杀死怀孕的大鼠。切开腹部后，取出子宫角，在室温下用PBS洗涤。从包膜中取出胚胎，切下胎盘(每只大鼠10-12个胚胎)。取出心脏，用ADS/葡萄糖洗涤。在双目透镜下，取出心耳和大血管，然后再次用ADS/葡萄糖清洗心脏，只留下心室，并用无菌ADS/葡萄糖漂洗3次。

然后使用终浓度为0.1mg/ml的胰蛋白酶T 4674(Sigma，St Louis，Missouri)，在每个心脏0.3ml ADS/葡萄糖/胰蛋白酶混合物中胰酶消化心脏，37℃20分钟，其间轻轻搅拌(每分钟60-100转)。

然后吸取上清液，加入1ml去补体的FCS灭活胰蛋白酶。在以1500rpm离心10分钟后，吸取上清液，心脏细胞在1ml去补体的FCS中吸收。与此平行地，胰蛋白酶处理步骤重复5-6次，直到细胞完全解离。细胞集合体以1500rpm离心10分钟，然后用FCS洗涤两次，最后用栅网滤器过滤细胞。

然后培养这样分离的细胞，对于24孔板而言，浓度为10⁶细胞/孔，对于12孔板，浓度为2×10⁶细胞/孔。每孔含有1ml培养基。

在100ml的总体积中，培养基含有68ml DMEM(不含丙酮酸)(Gibco-BRL)、17ml M199(Sigma M4530)、10ml去补体的马血清(Sigma H6762)、5ml去补体的FCS(Gibco-BRL)和1ml 100×青霉素/链霉素/谷氨酰胺混合物(Gibco-BRL)。

心肌细胞培养约1天或2天。

实施例5：心肌细胞原代培养物的转染

心肌细胞的原代培养物用总量等于每孔500ng的DNA共转染，其中含有1ng质粒pRL-CMV(Promega Inc.，Madison，WI)，含量在1-100ng之间不等的如上所述的质粒pXL3635和pXL3634，适量500ng pUC19。

为此，在终体积为20μl的150mM NaCl和50mM碳酸氢盐中，质粒混合物与6nmol RPR 120535B(Byk等人，J Med Chem.41(1998)229-35)/μg DNA(0.3μl 10mM脂溶液)温育，然后振荡混合5秒，再次在室温下温育大约20-30分钟。

然后将该混合物加入250μl无血清培养基中，与细胞温育至少2小时。最后吸出培养基，细胞在5％CO₂和37℃下温育24小时至7天。

在转染后24小时或48小时收获细胞，用Promega双发光试剂盒按照使用说明书分析花虫萤光素酶和荧火虫萤光素酶活性。活性用Victor装置读取。

实施例6：多核苷酸体外活性的比较评价

通过大鼠心肌细胞原代培养物的瞬时转染在体外评价CARP多核苷酸(pXL3634)和RSV(pXL3635)启动子的相对活性，表示相对于质粒pRL-CMV的活性(图5)。

结果表明，采用的CARP基因(pXL3634)上游的多核苷酸具有极低的体外活性，相对于CMV启动子约为0.04％。

非特异性强RSV启动子(pXL3635)的相对活性也较低，分别约为参照CMV启动子的0.05％和0.68％。

实施例7：腺病毒的构建

可使在CARP启动子控制下的萤光素酶表达的腺病毒按照Crouzet等人(PNAS，94(1997)1414-1419)的方法构建，表达盒与质粒pXL3634的相同(图3)。

允许在大肠杆菌中重组的穿梭载体通过两个阶段构建。首先，向pXL3474(用ScaI和BglII消化)的ITR-Ψ区与pIX之间导入CARP启动子(片段：用Klenow补平的XhoI/BamHI)，产生质粒pXL3758。然后向BstBII(用Klenow补平)和BstEII消化的pXL3758中导入含有萤光素酶cDNA和SV40聚腺苷酸化位点的片段(pXL3634的用Klenow补平的BamHI片段/BstEII)，产生pXL3759。图6A是pXL3759的图示。

在大肠杆菌中的同源双重组如上所述完成，针对含有ΔE1/ΔE3腺病毒基因组的质粒pXL3215，其中向E1区内导入了一个RSV-LacZ表达盒。质粒pXL3215是质粒pXL2689的衍生物，它含有质粒RK2的复制起点，四环素抗性基因(Crouzet等人，PNAS，1997)。这种双重组的产物，质粒pXL3778，通过表达盒测序验证。为了释放线性病毒基因组，在用PacI酶切后，用该质粒转染Per.C6细胞系(WO97/00326)，产生病毒AV1.0CARP-Luc+。

也通过限制酶切分析、表达盒测序证实该病毒，并通过与探针Ψ杂交检验RCA E1+(复制型腺病毒)颗粒的存在。

高病毒滴度的原种如下获得：在Per.C6系中扩增病毒，用CsCl梯度纯化病毒颗粒。通过层析获得该病毒的滴度，单位为病毒颗粒/ml(vp/ml)，其体外活性如下检测：在感染骨骼肌或心肌细胞后，滴定萤光素酶活性，并与作为对照的含CMV启动子的病毒相比较。

实施例8：体内DNA注射

以1ml/kg经腹膜内途径注射，用氯胺酮(70mg/ml)/赛拉嗪(6mg/ml)混合物麻醉体重为200g的CD SPRAGUE大鼠。

在剖腹手术后，用100μl Hamilton玻璃注射器经透膈途径进行心肌内注射，该注射器与Steriflex导管(ref.167.10 G19 V)相连，具有一个终止凸缘，顶端为BD 26G*3.8针头(短刃)。

50μl DNA溶液用0.9％NaCl配制，注射5秒钟以上。

杀死动物后，取出心脏，用0.9％NaCl溶液漂洗，肉眼观察。然后利用匀浆器(Ultra-thurax，Diax600 Heidolph)，在试剂盒所带的含蛋白酶抑制剂(CΦmplete^TM，Roche Diagnostics)的裂解缓冲液中研磨，并在4℃下以4000rpm离心20分钟，之后用试剂盒(Promega E151A)分析萤光素酶活性。用装置LUMAT LB 9501(10μl上清液+50μlPromega萤光素酶底物)读数。应用Mir等人(PNAS 96(1999)，4262-4267)所述的校准，将萤光素酶活性转化为每个心脏的萤光素酶质量(pg萤光素酶/心脏)。

此外，心脏也在3.7％低聚甲醛中固定，并通过免疫组化分析FGF-1的表达。

实施例9：CARP多核苷酸的体内活性的比较评价

图7A汇集的结果表明，在注射剂量逐渐升高的1、5、25和125μg质粒pXL3031和pXL3634之后获得的萤光素酶表达水平没有显著不同，从而清楚地证实，CRAP基因上游多核苷酸能诱导高水平的表达，与强启动子如CMV相当。

另一方面，用另一种强病毒启动子RSV启动子(pXL3635)获得的表达弱于用CMV启动子或CARP基因上游多核苷酸获得的表达(图7B)。

另外，尽管证实在平滑肌细胞启动子(SMα-肌动蛋白，pXL3130，或SM22，pXL3153)上游添加CMV增强子在体外非常有效(WO00/18908)，但在体内在心脏细胞中似乎无效。

实施例10：CARP多核苷酸表达特异性的评价

通过心内透膈注射对大鼠施用各25μg质粒pXL3634、pXL3435和pXL3031。

与此平行地，向小鼠组颅颈肌中肌内注射10μg这些质粒，进行或不进行电转移。

注射7天后如(PNAS 96(1999)，4262-4267)所述分析萤光素酶的表达。

心脏中的萤光素酶表达水平相对于在颅颈肌中观察到的水平表示，汇集于图8中。

结果清楚地表明，CARP基因上游的多核苷酸和CMV启动子是仅有的两种能够在心脏组织中诱导最高表达的启动子。然而，使用CMV启动子时，心脏/肌肉表达比为1，而在使用CARP基因上游多核苷酸时，这一比值接近100，这清楚地表明后者对心脏组织的极高选择性。

相对于含有平滑肌细胞特异的增强子和启动子(如编码蛋白质SM-22和肌动蛋白的基因的)的其它构建体，该多核苷酸的表达特异性优势明显，为了说明起见，在图8中也显示了其心脏/肌肉表达比。

                                     序列表

                           序列表<110>AVENTIS PHARMA SA

 THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA<120>CARP基因上游序列，含有该序列的载体及其用途<130>CART<140>ST00033<141>2000-12-05<160>3<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2358<212>ADN<213>Mus musculus<400>1ggatcctttc atgtttaaca atatcaaccc taacccaagg ggaacagcct gcctgacagt 60ggctttgcca cccatgaata cttcctagtc tagtccgttt gtgaaactca gcccatccca 120acacttctgc aagccccatc ctctacaagg tgctcattgg gaatttcctg gagcttctct 180ttcaggatca gcctgattct agggcagcag ttctcaacct gggggcctcg acccctttgg 240gggaatcaaa cgacccttta caggggtcac atatcatcta tcctatatgt caggtattta 300cattacgatt cgtaacagta gcaaaattac aggtatgaaa tagcaatgaa ataattttat 360gattgaaggt caccacaaca tgaggccgcc acactgttct agagaaaaat cacctgggtg 420gggaaaggtt tgggaaagcc tttctgtcca ttcttcattc ttcaaagtga tgtgttcaca 480gaaagccttt cagctgttct gctggggctc ttagtaagtc tgagtaggaa ctgtatgtac 540caggtctgct tcttatgggt ggagccaaga cgcatcgtgg gtggagcgaa gacgcaacct 600caccttctag ctctgcatcc atagcaagta gcctaatgtt tctgtgtcta ggtgtcatct 660ctgtgaatcg agatccttgg ccttgcttga attagggagg cacaaaatac tcagagattc 720aagactgctc agcagcccag agtccttcct caaaggaaag gtctcaactc tcagcccccc 780ttagctctga gtcaggcctg gaacaaacgg ccacaggaat gagaaaagct gccatagctg 840cttgtcactt caagaggtca aagaaaatag tgttaaccat gaaaacgaga agaccaacag 900ttatccattg atagcgtctc aggacagata ggacagagag aacactagga gaggggaacc 960cacgaaggac aaggtattag tgtgttggtt ttcagggcaa tgtcttgtac tgaagattct 1020agaaacacaa tttgctggtt gaacagctga agtggggtgg gggttcttac cccatgttca 1080tggaagggtg agtgaggaga gacagatata tgatggccag cataacaaac atacacaaca 1140ccctaattaa cacttccctc ttctactgac acccccttca ctctcctctt tcataaaaaa 1200taaaaaaagt attttatgtg gctcttacga tagaatcttt cctcgaacta taaaaagatc 1260taaatattta tatttttcac attttaatat cttagcgatg acaagccaga aacaagtatt 1320ttttgcctct ctcaacagca aagcttgggg cctttttgtt tccgtgttag gaatagaaca 1380cgagagcccc gtgtatctag gcagatgctc tatcattagc ccatgagtct ccagcctcag 1440acgcacattt ttctcgggct ctcttaagct tttcccacag cattgggaaa ctttactgac 1500agcatccaag ttgtgcttct gctaagaact ggactcacat ctctctgtgc atcacttcgg 1560cccgttttgg ggtagatcct ctgattagcc ttcagattta gaacacggtg agcctgtggt 1620gcactaatta tggccagtga caccatagag tcaaagtgca ttactgaatg ctttcaattt 1680ctcctaatgc tggtacgatg gcatgtcaca gggccatttt agctgcagac atcactccag 1740agaattccaa acagatagag acaagtggca cccagaccca tctccttccc ctcgggctga 1800ttatccccag aaataggatg tcccaaagca acacttccca gccaactgga gtgctgataa 1860gtccagttat cagaaagata tggctgtaag tgtgatgcac agtgcttgca ttttcttgat 1920acgttagtca tatgagagct gacaaagaag gaaaaagagc agcgatgtgg tgcaatatta 1980acaggcagct gtcccctggc ttcccgatac gtgggatgac tcgcattgct gagcggtgtg 2040gtcactgcca aaggaatgac cctctcacat ttcttcctga ttcgcatacg ccgcggccag 2100cttgtcatct ccctcttggg cttcccagac actaagtctg gaatgaaaat tcacctgcct 2160ctgaattggc cactggtggg ggcaggggtg tgacttggct tcccaggctg gaagattatc 2220tcacccagcc ctagctatat aacgggctgg tgtggagggg ctccacaggg ccagttccag 2280gggttcatcc acaagagaga aaaacataga ctcgaggtct agggagcttg catgcctgca 2340ggtcggaggc caccatgg                                               2358<210>2<211>2074<212>ADN<213>Homo sapiens<400>2ctgcagcaag ttacttaatg ttttttgcct cagcatcctc tctgtaaaat gagagcatta 60gtcttgctcc aacttcgagg gcatggacag ctctgggatt tcatatccaa gacccttaaa 120catcccacag tccttccccc aaacacttct cctcctaata cctccctcag tttgggtcag 180gcctggaaca aaaaggcata cgaaatggta gaaaaagtgt ccatgactac ttctgactta 240gatgaagaga ccaatgaaaa tagtaatgac tctgtttgct tcagcaggac atatactaaa 300ataggagcta tacaaagaag attagcatgg actctgtgca agaatgacac acaaatttgt 360gaaacattcc atatattaaa aataaataaa taataaagag aaaaggaaaa aattaaaaag 420aaaatagtga tagctgtgtc catctcaaag aaaagcccag gagatttcct ttatttaccc 480cctttaagat agaatattag gagaccggaa catatgatac aggaggtact gggagggtcc 540ctctttgtca atgttttgtc ttggggtggg gagtcgatgt cttctcaaag tttcagaaac 600accatccact gactgagcat tcaaggggca agaggagaat ggcagccaca tttgttgatt 660gggtgagttt ggggagaaat agacacacaa aggtcaaaca taacttccta attaacactt 720ccctccattc acaattccct tctcccattc ttctctcctg tcttttacts akaraaaccc 780agtttttcct gaaactataa aaataccccc agtatgttta cataatttac acctcaaaga 840ttagaaacca gaaatagaga ccttttcaac ccttccggaa gcaaagtgca ttatccctcc 900agccacgtgt ctcaaatctt gatgcatcag aatcatctgg gtgctttkaa attcaagatg 960attcctacga gttaccataa atcaactcag aattccctgg agtggggcca gggatctgta 1020tttctgacaa gctcccacag gtgattcctt tccccacagc atttgagaac ttcagctcaa 1080tgacctaatc agagtcctgc cattgctaat atctggtctc atttttbtca tatatatata 1140tagtatttgt ggtagagatg ggattttgcc atgttgccca ggctagtatt gaactcctaa 1200gctaagcaat cttcctgtct ctgcctccca aaatgttggg attacaggtg taagccactg 1260cacccggctg atagctggtt tcatttactc tatttcttga ccactctgat ccattttgaa 1320gtaaaaatgc tccaattatt atgctgtttt agaacacggt aagcatgtca tgtgctaatg 1380gccagtgaca tcataaaaga aaagtgcatt actgaatgct ttcaatgtct tataatgatg 1440gtaaggtggc atgtcatggg gcctatttag cccagacatc actccaaaga attccaaaca 1500gatatagaca agtgccttta gggcccagat cccttcccct caggctgttt acccagggaa 1560taggatgtcc tgggacaagt ttcccctaag tgaagtgttg ataagtctgc ttatcagaaa 1620gatattactg ggggtgtgat atgtagggca tctacatttt cttgataggt agtcatatga 1680aagctgacaa agaaaaaaag ggcagtgatg tggtgcaatg tcaacagaca gctgtcccct 1740gactcttgac aaataggatg acttgcattg ctgagcgatg tgatcaccac caaaggaatg 1800gccctctcac atttcttcct gattcacata ttcagcaggg ttagcttgtc ctcccctccc 1860tcttcagctt cccagacact gagtctggaa tgaaaattca cctgcctctg agttggctcc 1920taatgggggc gggagtgtta cttcggttcc caggttggaa gattatctca cccggcccca 1980gctatataag ctgaccggtg tggaggggcc cagcagggcc aactccaggg attccttcca 2040cgacagaaaa acatacaaga ctccttcagc caac                             2074<210>3<211>750<212>PRT<213>Homo sapiens<400>3Met Gly Glu Thr Leu Gly Asp Ser Pro Ile Asp Pro Glu Ser Asp Ser1               5                   10                  15Phe Thr Asp Thr Leu Ser Ala Asn I1e Ser Gln Glu Met Thr Met Val

        20                  25                  30Asp Thr Glu Met Pro Phe Trp Pro Thr Asn Phe Gly Ile Ser Ser Val

    35                  40                  45Asp Leu Ser Val Met Glu Asp His Ser His Ser Phe Asp Ile Lys Pro

50                  55                  60Phe Thr Thr Val Asp Phe Ser Ser Ile Ser Thr Pro His Tyr Glu Asp65                  70                  75                  80Ile Pro Phe Thr Arg Thr Asp Pro Val Val Ala Asp Tyr Lys Tyr Asp

            85                  90                  95Leu Lys Leu Gln Glu Tyr Gln Ser Ala Ile Lys Val Glu Pro Ala Ser

        100                 105                 110Pro Pro Tyr Tyr Ser Glu Lys Thr Gln Leu Tyr Asn Lys Pro His Glu

    115                 120                 125Glu Pro Ser Asn Ser Leu Met Ala Ile Glu Cys Arg Val Cys Gly Asp

130                 135                 140Lys Ala Ser Gly Phe His Tyr Gly Val His Ala Cys Glu Gly Cys Lys145                 150                 155                 160Gly Phe Phe Arg Arg Thr Ile Arg Leu Lys Leu Ile Tyr Asp Arg Cys

            165                 170                 175Asp Leu Asn Cys Arg Ile His Lys Lys Ser Arg Asn Lys Cys Gln Tyr

        180                 185                 190Cys Arg Phe Gln Lys Cys Leu Ala Val Gly Met Ser His Asn Ala Ile

    195                 200                 205Arg Phe Gly Arg Met Pro Gln Ala Glu Lys Glu Lys Leu Leu Ala Glu

210                 215                 220Ile Ser Ser Asp Ile Asp Gln Leu Asn Pro Glu Ser Ala Asp Leu Arg225                 230                 235                 240Ala Leu Ala Lys His Leu Tyr Asp Ser Tyr Ile Lys Ser Phe Pro Leu

            245                 250                 255Thr Lys Ala Lys Ala Arg Ala Ile Leu Thr Gly Lys Thr Thr Asp Lys

        260                 265                 270Ser Pro Phe Val Ile Tyr Asp Met Asn Ser Leu Met Met Gly Glu Asp

    275                 280                 285Lys Ile Lys Phe Lys His Ile Thr Pro Leu Gln Glu Gln Ser Lys Glu

290                 295                 300Val Ala Ile Arg Ile Phe Gln Gly Cys Gln Phe Arg Ser Val Glu Ala305                 310                 315                 320Val Gln Glu Ile Thr Glu Tyr Ala Lys Ser Ile Pro Gly Phe Val Asn

            325                 330                 335Leu Asp Leu Asn Asp Gln Val Thr Leu Leu Lys Tyr Gly Val His Glu

        340                 345                 350Ile Ile Tyr Thr Met Leu Ala Ser Leu Met Asn Lys Asp Gly Val Leu

    355                 360                 365Ile Ser Glu Gly Gln Gly Phe Met Thr Arg Glu Phe Leu Lys Ser Leu

370                 375                 380Arg Lys Pro Phe Gly Asp Phe Met Glu Pro Lys Phe Glu Phe Ala Val385                 390                 395                 400Lys Phe Asn Ala Leu Glu Leu Asp Asp Ser Asp Leu Ala Ile Phe Ile

            405                 410                 415Ala Val Ile Ile Leu Ser Gly Asp Arg Pro Gly Leu Leu Asn Val Lys

        420                 425                 430Pro Ile Glu Asp Ile Gln Asp Asn Leu Leu Gln Ala Leu Glu Leu Gln

    435                 440                 445Leu Lys Leu Asn His Pro Glu Ser Ser Gln Leu Phe Ala Lys Leu Leu

450                 455                 460Gln Lys Met Thr Asp Leu Arg Gln Ile Val Thr Glu His Val Gln Leu465                 470                 475                 480Leu Gln Val Ile Lys Lys Thr Glu Thr Asp Met Ser Leu His Pro Leu

            485                 490                 495Leu Gln Glu Ile Tyr Lys Asp Leu Tyr Ala Trp Ala Ile Leu Thr Gly

        500                 505                 510Lys Thr Thr Asp Lys Ser Pro Phe Val Ile Tyr Asp Met Asn Ser Leu

    515                 520                 525Met Met Gly Glu Asp Lys Ile Lys Phe Lys His Ile Thr Pro Leu Gln

530                 535                 540Glu Gln Ser Lys Glu Val Ala Ile Arg Ile Phe Gln Gly Cys Gln Phe545                 550                 555                 560Arg Ser Val Glu Ala Val Gln Glu Ile Thr Glu Tyr Ala Lys Ser Ile

            565                 570                 575Pro Gly Phe Val Asn Leu Asp Leu Asn Asp Gln Val Thr Leu Leu Lys

        580                 585                 590Tyr Gly Val His Glu Ile Ile Tyr Thr Met Leu Ala Ser Leu Met Asn

    595                 600                 605Lys Asp Gly Val Leu Ile Ser Glu Gly Gln Gly Phe Met Thr Arg Glu

610                 615                 620Phe Leu Lys Ser Leu Arg Lys Pro Phe Gly Asp Phe Met Glu Pro Lys625                 630                 635                 640Phe Glu Phe Ala Val Lys Phe Asn Ala Leu Glu Leu Asp Asp Ser Asp

            645                 650                 655Leu Ala Ile Phe Ile Ala Val Ile Ile Leu Ser Gly Asp Arg Pro Gly

        660                 665                 670Leu Leu Asn Val Lys Pro Ile Glu Asp Ile Gln Asp Asn Leu Leu Gln

    675                 680                 685Ala Leu Glu Leu Gln Leu Lys Leu Asn His Pro Glu Ser ger Gln Leu

690                 695                 700Phe Ala Lys Leu Leu Gln Lys Met Thr Asp Leu Arg Gln Ile Val Thr705                 710                 715                 720Glu His Val Gln Leu Leu Gln Val Ile Lys Lys Thr Glu Thr Asp Met

            725                 730                 735Ser Leu His Pro Leu Leu Gln Glu Ile Tyr Lys Asp Leu Tyr

        740                 745                 750

Claims (26)

1.多核苷酸，其特征在于它含有CARP蛋白基因编码部分上游的具有序列SEQ ID NO：1的序列片段，或在高严格条件下可与该序列杂交的序列，该多核苷酸能够诱导与该多核苷酸有效连接的基因在心脏细胞中特异性体内表达。

2.多核苷酸，其特征在于它显示与序列SEQ ID NO：1至少有93％的同一性。

3.根据权利要求1的多核苷酸，其特征在于该片段包含于位于小鼠CARP蛋白基因的核苷酸-2266与+92之间的序列中(SEQ IDNO：1)。

4.表达盒，其特征在于它含有编码具有治疗用途的蛋白质或RNA的序列，它置于如权利要求1-3中任一所述的DNA序列控制下。

5.表达盒，其特征在于它含有编码具有治疗用途的蛋白质或RNA的序列，它置于与序列SEQ ID NO：2至少有80％序列同一性的DNA序列控制下。

6.根据权利要求4和5任一项的表达盒，其特征在于该蛋白质或该RNA能够激活心脏细胞的生长，降低或抑制免疫应答，诱导血管形成，矫正肌肉收缩性、心脏肥大、心功能不全和心肌炎。

7.根据权利要求4-6中任一项的表达盒，其特征在于这种具有治疗用途的蛋白质是包括VEGF、FGF、angiopoietin和细胞因子的家族的一种蛋白质。

8.根据权利要求4-6中任一项的表达盒，其特征在于这种具有治疗用途的蛋白质是一种激活或抑制转录因子。

9.根据权利要求4-6中任一项的表达盒，其特征在于这种具有治疗用途的蛋白质是一种免疫抑制蛋白，如白介素-10、白介素-2和白介素-8。

10.根据权利要求4-6中任一项的表达盒，其特征在于具有治疗用途的RNA是一种反义RNA，它能控制心脏细胞中的基因表达或阻断mRNA转录。

11.根据权利要求4-6的表达盒，其特征在于该蛋白质是一种减少缺氧的试剂，选自NOS(氧化氮合成酶)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶。

12.载体，其特征在于它含有根据权利要求1-3中任一项的多核苷酸。

13.载体，其特征在于它含有根据权利要求4-11中任一项的表达盒。

14.载体，其特征在于它含有一个在心脏细胞中有效的复制起点。

15.根据权利要求12-14中任一项的载体，其特征在于它是一种质粒、粘粒或未被病毒包壳的任何一种DNA。

16.根据权利要求12和14任一项的载体，其特征在于它是一种重组病毒，选自腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、腺伴随病毒或其衍生物。

17.组合物，其特征在于它含有根据要求12-16中任一项的载体。

18.组合物，其含有根据要求12-16中任一项的载体和化学或生物化学转移剂。

19.药物，其特征在于它含有根据要求12-16中任一项的载体。

20.药物组合物，其特征在于它含有有效量的多核苷酸或根据要求1-3和12-16中任一项的载体。

21.根据要求1-3中任一项的多核苷酸或根据要求12-16中任一项的载体在生产用于治疗心功能不全的药物中的用途。

22.根据要求1-3中任一项的多核苷酸或根据要求12-16中任一项的载体在生产用于治疗心脏肥大的药物中的用途。

23.根据要求1-3中任一项的多核苷酸或根据要求12-16中任一项的载体在生产用于治疗缺氧的药物中的用途。

24.根据要求1-3中任一项的多核苷酸或根据要求12-16中任一项的载体在生产用于预防心脏移植排斥的药物中的用途。

25.转基因动物，其特征在于它携带根据要求1-3中任一项的多核苷酸，其中编码具有治疗用途的蛋白质的基因被置换为一种报道基因。

26.在体内表达具有治疗用途的基因的方法，其特征在于：

a)分离根据要求12-16中任一项的载体，和

b)在允许目的基因表达的条件下，向心脏组织中导入有效量的该载体。

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