CZ20031569A3

CZ20031569A3 - Polynukleotidy obsahující fragment sekvence v protisměru od genu CARP, vektory a expresní kazety, které je obsahují, a jejich použití

Info

Publication number: CZ20031569A3
Application number: CZ20031569A
Authority: CZ
Inventors: Patrick Benoit; Bertrand Schwartz; Didier Branellec; Kenneth Chien; Ju Chen
Original assignee: Gencell S. A.; The Regents Of The University Of California
Priority date: 2000-12-07
Filing date: 2001-12-05
Publication date: 2003-11-12
Also published as: US20030039984A1; CN1483040A; RU2003120081A; ZA200305184B; NO20032584L; CA2431193A1; FI20030851A7; AU2002226400B2; WO2002046220A3; JP2004519222A; AU2640002A; WO2002046220A9; IL156137A0; BR0116014A; US7193075B2; MXPA03005039A; NO20032584D0; NZ526408A; EP1358208A2; US20070150971A1

Description

Polynukleotidy obsahující fragment sekvence v protisměru od genu CARP, vektory a expresní kazety, které je obsahují, a jejich použití

Oblast techniky

Předkládaný vynález spadá do oblasti biologie, zejména se týká oboru cíleni exprese genů. Konkrétně se vynález týká návrhu a vývoje nového systému pro specifickou expresi transgenů. Předmětem vynálezu je nová promotorové sekvence, která je schopná řídit hladinu a specifitu exprese transgenů in vivo v buňkách srdečního svalu. Vynález tak poskytuje nové přípravky, konstrukty a vektory, které umožňují regulaci a cílení exprese nukleových kyselin do buněk srdečního svalu. Předkládaný vynález má četné způsoby využití, například v experimentálních a klinických oborech, při léčení a diagnostice, a konkrétně při léčení a/nebo prevenci některých nemocí srdce.

Dosavadní stav techniky

Řízení hladiny a cílení exprese transgenů je nutné v mnoha aplikacích. Tak například v genová terapii úspěch léčení vyžaduje cílení proteinu syntetizovaného transgenem, což umožňuje omezit nežádoucí vedlejší účinky. Konstrukce transgenních zvířat a výzkum účinků oblastí, kde může být využita vhodná exprese proteinů a poskytnout tak zlepšení dosud užívaných metod.

genů jsou příklady kontrola specifity

- 2 ·· ··♦· ·«*· • 4 • · · · ·4 · 4 · · · • 4 4 9 4 4 · · ·· 4 4444 4444

444 44 ·· ·· ··

Z tohoto hlediska bylo již mnoho promotorů testováno na jejich schopnost regulace a cílení kardiospecifické exprese. Konkrétně jde promotor genu kódujícího lehký řetězec srdečního myosinu (MLC-2) u laboratorního potkana (Henderson S. A. et al., J Biol Chem, 264 (1989) 18142-8, Lee K. J. et al·., J Biol Chem, 126 (1992) 15875-85), srdeční α-aktin U myší (Biben C. et al., Dev Biol, 173 (1996) 200-12), natriuretický faktor (ANF) (Harris A. N. et al., J Mol Cell Cardiol, 29 (1997) 515-25), těžký řetězec a- nebo β-myosinu (a- nebo β-MHC) (Colbert M. C. et al., J Clin Invest, 100 (1997) 195868), svalovou kreatinkinázu (MCK) králíků (Vincent C. K. et al., Mol Cell Biol, 13 (1993) 567-74) nebo srdeční troponin T (Patent Spojených Států č. 5,266,488).

Zatímco tyto promotory jsou známy tím, míru tkáňové specifity, je také známo, zůstávají hluboko pod úrovní aktivity promotorů, obecně 10 až lOOkrát, takže využití nelze předpokládat.

že poskytují jistou že úrovně aktivity takzvaných silných jejich terapeutické

Například Franz W. M. et al., (Cardiovasc Res, 35 (1997) 560-6) a Griscelli F. et al., (C R Acad Sci III, 320 (1997) 103-12) prokázali, že hladiny aktivity sekvencí ležících „upstream (proti směru transkripce) od genů kódujících a-MHC a MLC-2 laboratorního potkana v adenovirovém konstruktu zůstávají podstatně níže než aktivity promotoru RSV (virus Rousova sarkomu), a to přibližně lOx.

Předkládaná přihláška se proto týká nové promotorové sekvence pocházející z „upstream (proti směru transkripce) úseku genu CARP (srdeční ankyrinový repetiční protein). Tato nová promotorové sekvence je nejen schopná řídit kardiospecifickou expresi, ale také projevuje vysokou hladinu exprese in vivo srovnatelnou s jakýmkoliv silným promotorem,

4 444 • 4 4 • «ΜΙ • 4 ··

4 4 • 4 444 • · ♦ « • 4 4 1

4 β 4

4444 » 4 4 jako je například promotor CMV (cytomegaloviru).

Protein CARP, který představuje jeden z prvních markérů diferenciace kardiomyocytů působící „downstream (po směru transkripce) od homeoboxového genu Nbx2.5 při regulaci exprese genu MLC-2v, byl studován a kódující úsek tohoto genu byl sekvencován u myši (Zou Y. et al., Development, 24 (1997) 793804), králíka, (Aihara Y. et al. , Biochim Biophys Acta, 28 (1999) 318-24) a člověka (Chu W. et al., J Biol Chem, 270 (1995) 10236-45) .

Kuo H. et al. (Development, 126 (1999) 4223-34) klonovali fragment velikosti 10 Kb a z něho sekvencovli fragment velikosti 2,5 Kb v protisměru od kódující sekvence myšího genu CARP. Delece provedené na 5' konci fragmentu ukázaly, že úsek promotoru velikosti 213 bp mezi nukleotidy -166 a +47, vzhledem k počátku transkripce v poloze +1, byl dostatečný k tomu, aby poskytl kardiospecifickou expresi in vitro, což vedlo k předpokladu výskytu elementu na 5’ konci, který řídí specifita promotoru. Kuo et al. také připravili transgenní myší linii obsahující fragment velikosti 2,5 Kb v protisměru od genu CARP, projevující specifickou expresi transgenu v buňkách srdečního a kosterního svalstva v rané etapě embryonální vývoje, přičemž toto exprese pak byla inhibována během dalšího vývoje.

Mezinárodní přihláška WOOO/15821 popisuje úsek ležící 5' v protisměru od kódující sekvence myšího genu CARP, umístěný konkrétně mezi nukleotidy -2285 a +62, vzhledem k transkripci v poloze +1. Tento sekvence byla hodnocena zejména na in vivo aktivitu prostřednictvím adenovirových vektorů. Úrovně získané aktivity nicméně byly velmi nízký, takže bylo nutné, aby vůbec bylo možno detekovat aktivitu in vivo, izolovat promotorovou sekvenci mezi dvěma invertními terminální repeticemi

- 4 9« 999» • · · * 9 9*«

9 » • 9 9

99 9 • 9 ^9 <9

9 999

9 9 ·

99 »P> 9999 • 9 9 · «

9 ·

9 9 9

9* adeno-asociovaného viru (AAV-ITR).

Původce se zaměřil na lepší charakterizaci úseku 5' genu pro CARP protein. Tak byl schopen identifikovat novou sekvenci v protisměru CARP genu a demonstrovat neočekávané a výhodné vlastnosti této nové sekvence, konkrétně významné zlepšení hladiny aktivity in vivo.

Původce skutečně překvapivě zjistil, že zatímco tato nově identifikovaná sekvence nevede k žádné významné expresi in vitro, velmi dobré hladiny aktivity bylo dosaženo in vivo, a to ekvivalentní s takzvanými silnými promotory, přičemž byla zachována vysoká selektivita exprese pro srdeční tkáň.

Podstata vynálezu

Předmět předkládaného vynálezu je polynukleotid obsahující úsek v protisměru od kódující sekvence genu pro CARP protein, nebo fragment hybridizující v podmínkách vysoké stringence s touto sekvencí, přičemž polynukleotid je schopen u transgenu umístěného pod jeho kontrolu indukovat expresi specifickou pro srdeční tkáň.

Vynález se také týká jakéhokoliv polynukleotidu přírodní původu nebo získaného chemickou syntézou, který vykazuje alespoň 93%, výhodně alespoň 95% identitu se sekvencí uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKVENECE ID. Č. 1. Ještě výhodněji má polynukleotid podle vynálezu alespoň 98% identitu se SEKVENCÍ ID. Č. 1.

Expresním polynukleotidem přírodní původu se v kontextu předkládaného popisu rozumí fragment genomové DNA získaný štěpením buněčné DNA pomocí restrikčních enzymů.

- 5 Expresní polynukleotid získaný chemickou syntézou znamená v kontextu předkládaného vynálezu DNA fragment připravený automatizovanou syntézou, například s pomocí vhodného automatizovaného zařízení pro syntézu DNA.

V kontextu předkládaného vynálezu termín podmínky s vysokou stringencí se požívá ve smyslu definovaném v laboratorní příručce Maniatis et al. 1982 (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor CSH, N. Y., USA) nebo v některém z mnoha dalších vydání. Tak například hybridizační podmínky jsou takové, že následně jsou potřebná tři promytí v 65 °C v přítomnosti 0,2 SSC a 0,1% SDS , aby se eliminovaly nehybridizované fragmenty.

Specifický charakter exprese znamená předkládaného vynálezu, že aktivita promotoru vyšší v buňkách specifické tkáně, tj .

tkáně. Ačkoli nespecifická exprese kontextu je významné v tomto případě srdeční může existovat i v ostatních buňkách, odpovídající hladina aktivita zůstává obecně velmi nízká (zanedbatelná) ve srovnání s hladinou, která je pozorována v srdečních buňkách, obecně je nižší nejméně lOx.

Výsledky uvedené v této přihlášce v příkladech v tomto ohledu ukazují rozdíl v expresi, který dosahuje faktoru 1000 (t j . specifická exprese je lOOOx vyšší než nespecifická), což odráží vysokou selektivitu polynukleotidů podle vynálezu v srdečních buňkách in vivo.

Navíc výsledky uvedené v příkladech níže jasně ukazují, že použití polynukleotidů podle vynálezu poskytuje vysoké hladiny exprese, mnohem vyšší než jaké byly dosud známy pro jiné promotory specifické pro srdeční tkáň, přičemž tento rozdíl je až lOOx vyšší. Tyto prvky tak jasně ukazují výhody a neočekávané vlastnosti polynukleotidů podle vynálezu • · · ·

- 6 v termínech síly a specifity exprese nukleové kyseliny požadovaných v srdeční tkáni.

Výhodně polynukleotid podle vynálezu obsahuje část sekvence mezi polohou -2266 a +92, vzhledem k transkripční poloze +1, ze sekvence uvedené v připojeném seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 1.

Předmětem předkládaného vynálezu je proto sekvence hybridizující, a to v podmínkách vysoké stringence, se uvedenou zde jako SEKVENCE ID. Č. 1.

Předkládaný vynález nicméně není omezen na polynukleotidy obsahující fragmenty „upstream od myšího genu, ale týká se jakýchkoliv funkčních variant nebo jakékoliv jiné sekvence kteréhokoliv jiného biologického druhu, která má stejné vlastnosti, zejména je schopná specificky indukovat in vivo exprese transgenu v srdeční tkáni.

Takže odborník je výhodně schopen vztahovat uvedené údaje odkazem na sekvence „upstream v humánním genu, jehož sekvence je uložena v GenBank pod referenčním č. AF131884, a která je zde uvedena jako SEKVENCE ID. Č. 2. Předkládaný vynález tudíž zahrnuje jakékoliv sekvence obsahující fragmenty sekvence „upstream od genu pro CARP protein, modifikované například delecí určité struktury, které si zachovávají totožné nebo podobné funkce jako sekvence uvedená zde jako SEKVENCE ID. Č. 1.

Výhodně polynukleotid podle vynálezu projevuje alespoň 80%, výhodněji alespoň 90% identitu se sekvencí uvedenou zde jako SEKVENCE ID. Č. 2.

Expresní funkční modifikovaná sekvence, polynukleotidů uvedené variantou se rozumí která si zachovává výše. Modifikace mohou jakákoliv vlastnosti zahrnovat • · 4 4 · · ·9 4 4 · · «44 4 4 4 · 4 • 4 4 4 4 4 · · · · · 4 • · 4 4 · ·· ··· 4

4 · 4 4 4 4 · · «4 444 44 44 44

- 7 modifikace jednoho nebo více nukleotidů v požadované sekvenci typu adice, mutace, delece a/nebo substituce. Tyto modifikace mohou být do sekvence vneseny obvyklými molekulárněbiologickými metodami, jako je například konkrétně místně cílená mutageneze nebo ve výhodnějším způsobu umělou syntézou sekvence v syntetizátoru. Získané varianty jsou pak testovány na jejich schopnost kontrolovat specifitu exprese v srdečních svalových buňkách srovnatelnou polynukleotidem majícím SEKVENCI ID. Č. 1.

Další předmět vynálezu se týká expresní kazety obsahující polynukleotid jak byl definován výše, operativně spojený s transgenem, takže exprese transgenu je specificky cílena do srdečního svalu.

Výhodně kazeta podle vynálezu obsahuje navíc signál pro ukončení transkripce, umístěný směrem 3' od nukleotidové sekvence transgenu.

Výhodně transgen obsahuje požadovanou terapeutickou nukleovou kyselinu kódující protein nebo RNA, které se mohou podílet na patologickém stavu srdce jako je například srdeční vada, srdeční hypertrofie, hypoxie, ischemie nebo rejekce srdečního transplantátu.

Jako požadovaný terapeutický protein lze uvést kromě jiných následující příklady:

proteiny indukující angiogenezi, jako jsou například členy VEGF rodiny, členy FGF rodiny a konkrétně FGF1, FGF2, FGF4, FGF5, angiogenin, EGF, TGFcť, TGFp, TNFa, rozptylový faktor/HGF, členiy angiopoetinové rodiny, cytokiny a konkrétně interleukiny jako IL-1, IL-2, IL-8, angiotensin-2, aktivátor plazminogenu (TPA), urokináza (uPA), molekuly zapojené do syntézy aktivních lipidů (prostaglandiny, Cox-1) , • · • · ···· · · ·· « · · · · · · • ···· · ···· · • · · · · ·· ··· proteiny podílející se na řízení kontraktility srdce, jako je například fosfolamban, inhibitory fosfolambanu, SERCA-2a, p2-adrenergní receptor nebo dystrofin nebo minidystrofin (viz FR 91 /11947), proteiny s kryoprotektivní aktivitou, které specificky blokují apoptózu, jako například proteiny, který jsou členy rodiny bel a proteinkinázy jako je například AKT/PKB, transkripční faktory, jako jsou například přírodní nebo chimérické nukleární receptory, obsahující vazebnou doménu pro DNA, vazebnou doménu pro ligand a doménu působící jako transkripční aktivátor nebo inhibitor, jako jsou například fúzní proteiny tetR-NLS-VPl6, fúzní proteiny odvozené z estrogenních receptorů, fúzní proteiny odvozené z receptorů pro steroidní hormony, fúzní proteiny odvozené z receptorů pro progesteron, proteiny z CID (chemický induktor dimerizace, „Chemical Inducer of Dimerization) systému, který popsali Rivera et al., (Rivera et al., Mature Medicine, 2 (1996) 10281032) . Konkrétně lze zde uvést jako chimérický nukleární receptor nukleární receptory PPAR („Peroxisome Proliferator Activated Receptor), a zejména PPARy2, jak byly popsány v publikované přihlášce WO 96/23884 a FR 99/07957, a v Frohnert et al., (J Biol Chem 274 (1999) 3970-3977) a Mukherjee et al., (Biol Chem 272 (1997) 8071-8076), buďto v nativní formě, tj. bez modifikace primární struktury, nebo modifikovaný PPARy2 obsahující jedno nebo více vazebných míst pro ligand nebo E/F domény (Schoonjans et al. Biochim. Biophys. Acta. 1302 (1996) 93-109), jako například PPARy2y2 mající sekvenci uvedenou zde • · · ·

jako SEKVENCE ID. Č. 3, imunosupresory jako například interleukiny 2 a 10, které umožňují úplně nebo částečně inhibovat imunitní signální dráhu a tak prodloužit dobu udržení srdečního transplantátu, proteiny působící jako agens redukující hypoxii jako například NOS (syntetáza oxidu dusnatého), bcl-2 (B lymfocytární leukémie/lymfom 2), SOD (superoxiddismutáza) a kataláza.

Jako příklad vhodné požadované terapeutické RNA lze uvést „antisense RNA (tj . RNA s opačným smyslem proti směru transkripce), který jsou použitelné pro řízení (resp. potlačení) exprese genů nebo transkripce z buněčných mRNA, takže blokují translaci do proteinu, jak bylo popsáno v patentu EP 140 308, a také ribozymy, které jsou schopné selektivně štěpit (likvidovat) cílové RNA, jak bylo popsáno v patentu EP 321 201.

Samozřejmě předkládaný vynález není omezen na tyto specifické příklady proteinů nebo RNA, ale odborník může snadno vynález využít pro expresi jakékoliv nukleové kyseliny v srdečních buňkách na základě předkládaného vynálezu a jednoduchého rutinního experimentování.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je vektor obsahující polynukleotid nebo expresní kazetu podle vynálezu. Takový vektor může obsahovat jakoukoliv jinou DNA sekvenci nutnou pro expresi transgenu v cílových tkáních a konkrétně může obsahují počátek replikace, který je účinný v srdečních buňkách.

Vektor podle vynálezu může být různého charakteru, konkrétně se může jednat o vektor plazmidového, episomálního, • · · · • ·

chromosomálního, virového nebo fágového charakteru a/nebo původu. Výhodně je vektorem plazmid nebo rekombinantni virus.

Pro ilustraci plazmidů obsahujících polynukleotid nebo expresní kazetu mohou být uvedeny plazmidy pXL3634, pXL3728 a pXL3759, který jsou popsány podobněji dále.

Podle první provedení vynálezu jsou vektory podle vynálezu typu plazmidů. Jako plazmidový vektor lze kromě dalších uvést jakýkoliv z klonovacích a/nebo expresních plazmidů, které jsou odborníkům známy a které obecně obsahují replikační počátek. Lze také zmínit plazmidy nové generace nesoucí replikační počátek a/nebo markér, které byly dále zlepšeny, jak bylo popsáno například v publikované přihlášce WO 96/26270.

Podle výhodného provedení vynálezu je plazmidový vektor miniplazmid a obsahuje replikační počátek, jehož funkčnost v hostitelské buňce vyžaduje přítomnost alespoň jednoho proteinu, který je specifický a cizorodý vzhledem k buňce. Takové vektory byly konkrétně popsány v publikované přihlášce WO 97/10343.

Podle druhého provedení vynálezu jsou vektory podle předkládaného vynálezu virové vektory. Jako příklady virových vektorů lze, kromě dalších, uvést rekombinantni adenoviry, rekombinantni adeno-asociované viry, rekombinantni retroviry, lentiviry, herpetické viry a virus vakcínie, jejichž příprava může být provedena metodami, které jsou odborníkům známy. Výhodně jsou použity chimérické virové vektory jako například chimérické vektory adenovirus-retrovirus, který jsou popsány např. v publikované přihlášce WO 95/22617, a také vektory episom/adenovirus, který jsou popsány v publikaci Leblois et al. (Mol Ther (2000) 1 (4), 314-322) a v přihlášce

WO 97/47757.

Pokud jsou použity adenoviry podle tohoto provedení, jsou • · · · · · • · «· ····

-lito výhodně vektory pocházející z defektních adenovirů, tj. virů, které nejsou schopné autonomní replikace v cílových buňkách. Konstrukce těchto defektních virů, a také jejich infekční vlastnosti, byly podrobně popsány v odborné literatuře (viz konkrétně např. S. Baeck and K. L. March, Circul. Research, 82, (1998) 295-305), T. Shenk, B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley et al. (1996), Adenoviridae: Viruses and Replication (in virology) 211-2148, EDS-Ravens publishers Philadelphia, Yeh, P. et al. FASEB 11 (1997) 615-623).

Různý sérotypy adenovirů, jejichž struktura a vlastnosti se poněkud liší, již byly charakterizovány. Mezi sérotypy, jejichž použití je výhodně v kontextu předkládaného vynálezu, patří humánní adenoviry typu 2 nebo 5 (Ad 2 nebo Ad 5) nebo adenoviry živočišného původu, jako například adenoviry popsané v přihlášce FR 93/05954, a nebo adenoviry smíšeného původu. Jako příklady adenovirů živočišného původu, které mohou být použit v kontextu předkládaného vynálezu, lze uvést psí, bovinní (hovězí) a myší adenoviry (Beard et al., Virology 75 (1990) 81), a adenoviry ovčího, prasečího, ptačího nebo opičího původu. Výhodný adenovirus živočišného původu je psí adenovirus, výhodněji adenovirus CAV2 (kmen Manhattan nebo A26/61), jak byl popsáno v publikované přihlášce WO 94/26914.

Defektní adenoviry podle vynálezu obsahují obecně na každém konci invertovanou terminální repetici (ITR), sekvence dovolující enkapsidaci (Psi), gen El a alespoň jedem z genů E2, E4 a L1-L5, které přesto byly deaktivovány kterýmkoliv z postupů, které jsou odborníkům známy (Levero et al., Gene, 101 (1991) 195, EP 185 573, Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917).

Výhodný rekombinantní adenovirus pro použití v kontextu předkládaného vynálezu obsahuje deleci v El úsek svého genomu. Konkrétněji obsahuje delece úseků Ela a Elb. Jako konkrétní ·· ·♦·« ·· ···· · · ··· ··· · · · • · «· · · · · · · · · · ·· · · · ······ ·

9 9 9 9 9 9 9 · 9 9

999 9 9 9 9 9 9 99

- 12 příklad lze uvést delece zahrnující nukleotidy 454-3328, 3823446 nebo 357-4020 (číslování vztaženo ke genomu Ad5).

Podle výhodné varianty rekombinantní adenovirus použitý v kontextu vynálezu obsahuje navíc deleci v úseku E4 svého genomu. Konkrétně delece v E4 úseku postihuje všechny otevřené čtecí rámce. Jako zcela konkrétní příklad lze uvést delece zahrnující nukleotidy 33466-35535 nebo 33093-35535. Jiné typy delece v E4 úseku jsou popsán v přihláškách WO 95/02697 a WO 96/22378, které jsou zahrnuty v předkládaném popisu formou odkazu.

Co se týče adeno-asociovaných virů (AAV) , jsou to relativně malé DNA viry, které se stabilně a místně specificky integrují do genomu buněk, které infikují. Jsou schopné nakazit široké spektrum buněk, bez indukce jakéhokoliv účinku na buněčný růst, morfologii nebo diferenciaci. Navíc se nezdá, že jsou zapojeny do patologických stavů u lidí. AAV genom byl klonován, sekvencován a charakterizován. Obsahuje přibližně 4700 bází a na každém konci obsahuje invertovanou terminální repetici (ITR) asi 145 bází, která slouží jako počátek replikace pro virus. Zbytek genomu je rozdělen do 2 základních úseků nesoucích enkapsidační funkce: levá část genomu, která obsahuje rep gen zapojený do virové replikace a exprese virových genů, pravá část genomu, která obsahuje cap gen kódující virové kapsidové proteiny.

Použití vektorů pocházejících z AAV pro přenos genů in vitro a in vivo byl popsán v literatuře (viz konkrétně WO 91/18088, WO 93/09239, patent Spojených Států č. 4 797 368, patent Spojených Států č. 5 139 941, EP 488528). Tyto přihlášky popisují různé konstrukty pocházejících z AAV, ve kterých geny rep a/nebo cap byly odstraněny a nahrazeny požadovanými geny, a jejich použití pro transfer in vitro (na ·· »··· ·« ····

- 13 buňky v kultuře) nebo in vivo (přímo v organismu) požadovaného genu. Defektní rekombinantní AAV podle vynálezu mohou být připraveny kotransfekcí do buněčné linie infikované humánním pomocným virem (například adenovirem) plazmidu obsahujícího nukleové sekvence podle vynálezu ohraničené dvěma AAV invertovanými terminálními repeticemi (ITR) a plazmidu nesoucího AAV enkapsidační geny (geny rep a cap) . Vytvořené rekombinantní AAV jsou pak purifikovány obvyklými technikami.

Podle tohoto provedení mohou také být použity lentiviry, umožňují transfer a účinnou a stabilní integraci požadovaného genu do klidových buněk.

Mohou být uvedeny například HTLV-1 ze zvířecích lentivirů, jako je například FIV (kočičí infekční virus), EIAV (koňský virus infekční anémie, WO 98/51810), BIV (virus bovinního imunodeficitu), SIV (virus opičího imunodeficitu), CAEV (virus kozí artritidy a encefalitidy) (WO 98/39463, Naldini et al., Science, 272, 1996, 263-267, Schnele et al. Hum Gen Ther, 11, 2000, 439-447) nebo lentivirus příbuzný typu, který způsobuje AIDS, HIV-2, který u lidí není vysoce patogenní (Kundra et al., Hum Gen Ther, 9, 1998, 1371-1380).

Expresní kazety mohou být vloženy do různých místa rekombinantního genomu. Kazeta může být vložena na úrovni úseku El, E3 nebo E4, jako náhrada suprimovaných nebo nadbytečných sekvencí. Může také být vložena v kterémkoliv jiném místě, mimo sekvencí nutných v cis pro produkci virů (ITR sekvence a enkapsidační sekvence).

Nicméně je nutné poznamenat, že zavedení sekvencí podle předkládaného vynálezu do vektorů popsaných výše není esenciální, takže srdeční buňky mohou být přímo transfekovány DNA obsahující tyto sekvence.

Nukleové sekvence podle předkládaného vynálezu mohou být *· »<··· • · » · ·* » ·* • · • ··* • · 4 • ·· · · · • · 1 • · · <

• 4 ·9

kyselin	se
buněk	nebo
mohou	být
:, jak	bylo

zavedeny po kovalentní kondenzaci nukleových sloučeninami podporujícími jejich penetraci do buněk nebo jejich transport k jádru, výsledné konjugáty volitelně enkapsidovány do polymerních mikročástj popsáno v mezinárodní přihlášce WO 94/27238.

Podle dalšího provedení mohou být nukleové sekvence zahrnuty v transfekčním systému obsahujícím polypeptidy podporující jejich proniknutí do buněk, jak bylo popsáno v mezinárodní přihlášce WO 95/10534.

Tyto polynukleotidy, kazety a vektory mohou být podávány in šitu kterýmikoliv prostředky odborníkům známými , například koronární infúzí (Barr et al., Gene Ther, 1, 1994, 51-58), intrakardiální injekcí, epikardiální injekcí, tj. přes ventrikulární stěnu (Guzman et al., Cir Res, 73, 1993, 12021207), intraperikardiální injekcí (Fromes et al. , Gene Ther, 6, 1999, 683-688) nebo retrofúzí koronárních žil (Boeckstegers et al., Circulation, 100, (Suppl I), 1999, 1-815).

Polynukleotidy, kazety nebo vektory podle vynálezu mohou výhodně být podávány ve formě přípravku, který je obsahuje, například s pomocí chemického nebo biochemického transferového agens usnadňujícího jejich transfekci do srdečních buněk. Termínem chemické nebo biochemické transferové agens se rozumí kterákoliv sloučenina usnadňující penetraci nukleové kyseliny do buňky. Patří sem např. kationtová agens (činidla), jako jsou například kationtové lipidy, peptidy, polymery (polyethylenimin, polylysin), nanočástice nebo nekationtová činidla, jako jsou například nekationtové lipozomy, nekationtové nanočástice nebo polymery, Taková činidla jsou odborníkům dobře známa a jsou konkrétně popsána v přihláškách WO 95/18863, WO 97/18185 a WO 98/15639.

Předkládaný vynález se kromě toho týká léků obsahujících ♦ « ···· <· »« *» ·»·· > > · · · · ·· · • « »·· » · ··· · · · • · ·»·<··«· · · • · · · · · · · « · · «· lil ·» ·· ·· ·»

- 15 polynukleotidy podle vynálezu, expresní kazety nebo vektory, a také farmaceutických přípravků, které je obsahují ve farmaceuticky účinném množství, společně s farmaceuticky kompatibilními excipienty.

Polynukleotidy, expresní kazety nebo vektory podle vynálezu mohou být výhodně použity pro výrobu léků pro aplikaci do srdeční tkáně, které mohou exprimovat konkrétně gen kódující požadovaný protein, pro léčbu srdečních nemocí a konkrétně pro léčbu a/nebo prevenci srdeční insuficience, hypoxie, srdeční hypertrofie, myokarditidy, srdeční ischémie nebo pro prevenci rejekce po srdeční transplantaci.

Takový lék může například zahrnovat kazetu nebo vektor podle vynálezu, který je schopný exprimovat funkční formu poškozeného genu podle srdečního patologického stavu, který je žádoucí léčit .

Výhodně farmaceutický přípravek obsahuje farmaceuticky přijatelná vehikula pro formulace pro injekci, konkrétně pro intrakardiální injekci. To může zahrnovat konkrétně izotonické, sterilní fyziologické roztoky (hydrogenfosforečnan a dihydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, draselný, vápenatý nebo hořečnatý, apod. nebo směsi takových solí) nebo suché, konkrétně lyofilizované, přípravky, které po přidání sterilizované vody nebo fyziologického roztoku, v závislosti na požadavku, umožňují přípravu roztoků pro injekci. Mohou být použity jiné excipienty, jako například hydrogel. Tento hydrogel může být připraven jako každý biologicky kompatibilní a necytotoxický (homo- nebo hetero-) polymer. Takové polymery byly například popsány v přihlášce WO 93/08845. Některé z nich, jako například konkrétně ty získané z ethylenoxidu a/nebo propylenoxidu jsou komerčně dostupné. Dávky použité pro injekci mohou být upraveny podle různých parametrů a konkrétně ·· φ φ · φ φ · ··· · · · · φ · φ φφφφ φ φφφφ φ φ φ φ φ φφφ φφ φφφ φ φ • Φ φ φφφφ φφφφ φφφφφ φ φ φφ φφ φφ

- 16 podle sledovaného cíle (značení, patologický stav, screening apod.), exprimovaného transgenu nebo trvání požadované exprese.

Obecně jsou rekombinantní adenoviry podle vynálezu formulovány a podávány ve formě dávek mezi 10⁴ a 10¹⁴ pfu a výhodně 10⁶ a 1O¹⁰ pfu. Termín pfu (jednotka tvořící plaky) odpovídá infekční síle virového roztoku a je určen infekcí vhodné tkáňové kultury a měřením počtu plaků infikovaných buněk. Techniky pro určování pfu titru virového roztoku jsou v oboru dobře známy.

Předmětem předkládaného vynálezu je navíc způsob exprese terapeutického požadovaného transgenu, během kterého jsou použity polynukleotidy, kazety nebo vektory podle předkládaného vynálezu, takže transgen může být exprimován.

Kromě toho se vynález také týká kterékoliv buňky modifikované kazetou nebo vektorem (obzvláště adenovirem), jak bylo popsáno výše. Termín modifikovaná buňka znamená kteroukoliv buňku obsahující polynukleotid nebo kazetu podle vynálezu. Tyto buňky mohou být určeny pro implantaci do organismu podle metodologie popsané v přihlášce WO 95/14785. Tyto buňky jsou v podstatě humánní srdeční buňky.

Předkládaný vynález se také týká transgenních zvířat a konkrétně myší nesoucích polynukleotid nebo kazetu, jak bylo definováno výše, ve kterých je gen kódující terapeutický požadovaný protein nahrazen reportérovým genem. Takové transgenní myši mohou být použity pro screening molekul na jejich aktivitu na regulační sekvence genu kódujícího CARP protein.

Molekuly mohou být podávány myším, a pak po jejich utracení jsou připraveny histologické řezy, aby se identifikovaly tkáně obarvené reportérovým genem.

• · · · • · · 4

- 17 • 4 · · · · · 4 4 • 4 · · 4 4 4 4 4* 4 4 4

4 4444 4444

44444 ·» 44 44 44

Transgenní zvířata podle předkládaného vynálezu také představují molekulárně biologické modely vhodné pro výzkum nezbytný k porozumění molekulárním mechanismům, které jsou základním prvkem srdečních patologických stavů genetického původu, jako je například srdeční insuficience, srdeční hypertrofie, srdeční hyperplázie a infarkt myokardu.

Jako příklad mohou být uvedeny myší modely pro studium myokarditidy, ve kterých je inaktivován gen kódující interferon-1 (IFN-1) (Aitken et al., Circulation, 90, 1994, 1139) .

Další požadované zvířecí modely podle předkládaného vynálezu mohou zahrnovat polynukleotid podle vynálezu spojený s transgeny, jako jsou například protoonkogeny nebo onkogeny, například c-myc, tak tvořící modely hyperplázie (Jackson et al·., Mol Cell Biol, 10, 1990, 3709-3716), p21-ras pro modely ventrikulární hypertrofie (Hunter et al., J Biol Chem, 270, 1995, 23176-23178), nukleární antigen viru Epstein-Barrové pro studium určitých kardiomyopatií (Huen et al., J Gen Virol, 74, 1993, 1381-1391).

Podle dalšího provedení transgenní zvířata podle vynálezu představují experimentální modely srdeční hypertrofie a zahrnují expresní kazetu, ve které transgen kóduje například kalmodulin (Gruver et al., Endocrinology, 133, 1993, 376-388), interleukin-β nebo receptor interleukinu-6 (Hirota et al., Proč Nati Acad Sci, 92, 1995, 4862-4866), kardiotrofin-1 (Pennica et al., Proč Nati Acad Sci, 92, 1995, 1142-1146) a konečně α-adrenergní receptor (Milano et al., Proč Nati Acad Sci, 92, 1994, 10109-10113).

Navíc polynukleotidy podle vynálezu, modifikované tak, že umožní zvýšení exprese CARP genu, také představují předmět vynálezu. Transgenní zvířata takto získaná tak představují • · · 9 • ·· ·

9 9 9 9 9 99 9 • 9999 9 9999 9 9 9

9 9 ř- 9 9 9 9 » 9 9 ·

9 999 » 9999

999 99 99 99 99

- 18 experimentální prostředky pro infarkt myokardu (Stanton et al., Circul Res, 86, 2000, 939-945).

Pro uskutečnění předkládaného vynálezu odborník může výhodně odvolávat na následující manuál SAMBROOK et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989) nebo jedno z jeho posledních vydání.

Předkládaný vynález je detailněji popsán s pomocí následujících příkladů, které jsou pouze ilustrativní a neomezuj 1cl.

Popis obrázků

Obrázek 1: ukazuje nukleotidovou sekvenci (sekv. id. č. : 1) polynukleotidu v protisměru genu kódujícího myší CARP protein.

Obrázek 2: ukazuje nukleotidovou sekvenci (sekv. id. č.: 2) polynukleotidu v protisměru genu kódujícího humánní CARP protein.

Obrázek 3: je schématické znázornění plazmidu pXL3634.

Obrázek 4: je schématické znázornění plazmidu pXL3728.

Obrázek 5: ukazuje relativní aktivitu in vitro plazmidů pXL3635 a pXL3634 vzhledem k referenční aktivitě CMV promotoru (pRL-CMV). Aktivita každého promotor reprezentuje Photinus pyralis luciferázovou aktivitu normalizovanou k Renilla reniformis luciferázové aktivitě.

Obrázek 6A: je schématické znázornění plazmidu pXL3759.

Obrázek 6B: je schématické znázornění adenovirů AVI. 0

CARP-Luc+.

* • » • · · · • · · · · · · · · · · • · 99· · · ·· · · ··

- 19 Obrázek 7A: ukazuje luciferázovou aktivitu (pg luciferázy/srdce) 7 dnů po intrakardiální transdiafragmatické injekci laboratorních potkanů variabilním množstvím plazmidů pXL3031 a pXL3634.

Obrázek 7B: ukazuje expresi luciferázy (pg luciferázy/srdce) 7 dnů po intrakardiální transdiafragmatické injekci do srdcí laboratorních potkanů 25 μg plazmidů pXL3031 a pXL3635, pXL3130 a pXL3153.

Obrázek 8: představuje poměr exprese luciferázy v srdci relativně k expresi ve svalu jako funkci exprese v srdci získané po intrakardiálním podávání plazmidů pXL3031, pXL3634, pXL3635, pXL3153 a pXL3130.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Charakterizace polynukleotidu „upstream (v protisměru) CARP genu

BamHI-XhoI fragment o velikosti 2,3 kb ze sekvence v 5' myšího genu kódujícího CARP protein byl klonován a sekvencován na obou vláknech metodou terminace řetězců (Sanger et al., 1977, PNAS, 74, 5463) s použitím soupravy Sequenase (United States Bíochemical, Cleveland, Ohio). Sekvence je ukázána na obrázku 1 a obsahuje tedy část v protisměru genu kódujícího myší CARP protein mezi nukleotidy -2266 a +92 relativně k transkripční poloze +1 (sekv. id. č.: 1).

- 20 4 4 4« 4 4 • · 4 4 4 4

449« 9 · 4 • 44 4 9 44 4 • 4 · · 49 · *

Příklad 2

Konstrukce CARP plazmidových vektorů

2.1 Plazmid pXL3634

BamHI-XhoI fragment o velikosti 2,3 kb charakterizovaný v příkladu 1 byl klonován po doplnění BamHI místa do plazmidu pGL3-Basic (Promega), předem štěpeného s Xhol a Smál, za zisku plazmidu pXL3634. Schématické znázornění tohoto plazmidu je ukázáno na obrázku 3.

2.2 Plazmid pXL3728

Plazmid pXL3728 byl získán z plazmidu pXL3179, což je vektor pocházející z plazmidu pXL2774 (WO 97/10343/), ve kterém byl zaveden gen kódující fúzi mezi signálním peptidem interferonu humánních fibroblastů a cDNA FGF1 (fibroblastový růstový faktor 1) (sp-FGFl, Jouanneau et al., PNAS, 88, 1991, 2893-2897) pod kontrolu promotoru získaného z časného úseku humánního cytomegaloviru (hCMV IE) a pozdního úseku polyadenylačního signálu SV40 viru (GenBank SV4CG).

BamHI-XhoI fragment o velikosti 2,3 kb charakterizovaný v příkladu 1, jehož konce byly doplněny, byl klonován do plazmidu pXL3179 (pCOR CMV-FGF), předem štěpeného s Xbal a EcoRI za zisku plazmidu pXL3728. Schématické znázornění tohoto plazmid je ukázáno na obrázku 4.

2.3 Plazmid pXL3729

EcoRI-SalI fragment z plazmidu pXL3634 byl klonován do plazmidu pXL3728 předem štěpeného s EcoRI-SalI za zisku plazmidu pXL3729.

- 21 •4 4444

4444 44 44 «44 444 44 4 · 4 4 4 4 4444 4 4 4

4 4 f> 4 44 444 4 4 «4 4 4444 4444 • 4444 44 44 44 44

Přiklad 3

Komparativní plazmidy

3.1 Plazmidy pXL3130 a pXL3153

Plazmidy pXL3130 a pXL3153 obsahují v daném pořadí humánní promotor α,-aktinu hladkého svalstva (-680, +30) a myší promotor SM22 (-436, +43) připojený k CMV enhanceru (522,-63), jak bylo popsáno v přihlášce WO 00/18908.

3.2 Plazmid pXL3635

GAT TTA AAT	AAT GTA	GTC	TTA
GTG CAC ACC	AAT GTG	GTG	A-3 ’
místa Swal	a Xbal	do	5 '
restrikční	místa byla	pak

Promotor RSV-229, +34 byl klonován obsahujícího delší verzi RSV promotoru v Adl.ORSVLAcZ, Stratford-Perricaudet et al., J Clin Invest, 90, 1992, 626-30) prostřednictvím PCR pomocí primerů 5'-GGC

TGC AAT-3 ' a 5'-GGG GTC TAG AAG , které zavedly, v daném pořadí, a 3' PCR fragmentu. Tato dvě pak použita k zavedení fragmentu promotoru do pGL3-basic za vzniku pXL3635.

z konstruktu (obsaženého

3.2 Plazmid pXL3031

Plazmid pXL3031 je dle popisu autorů Soubrier et al. (Gene

Ther., 6, 1999, 1482-8).

pXL2774 (WO 97/10343),

Je to vektor pocházející z plazmidu ve kterém luc gen kódující modifikovanou luciferázu Photinus pyralis (cytoplazmatickou) získanou z pGL3-basic (GenBank: CVU47295) byl zaveden pod kontrolu promotoru získaného z časného úseku humánního cytomegaloviru (hCMV IE, GenBank HS5IEE) a pozdního úseku polyadenylačního signálu SV40 viru (GenBank SV4CG).

- 22 • · · · · · · · 4 · *44 4 · 4 · · • · · · · 4 4 4 4 4 4 · • 4 4 4444 444 ··· 44 44 44 44

Příklad 4

Buněčné kultury

Byly založeny z laboratorních potkanů, primární kultury kardiomyocytů Březí samice laboratorního potkana byly utraceny v komoře saturované C0₂. Po otevření břišní dutiny byly odstraněny dělohy a byly promyt v PBS při teplotě místnosti. Embrya byla uvolněna z obalů a placenta odříznuta (10 až 12 embryí na samici laboratorního potkana). Srdce byla odstraněna a promyta ve směsi ADS/glukóza. Srdeční ouška a velké cévy byly odstraněny pod binokulární čočku, a pak byla srdce opět pročištěna směsí ADS/glukózy, aby se uchovaly pouze srdeční komory a byly 3-krát promyty v sterilní směsí ADS/glukózy.

Srdce pak byla ošetřena trypsinem v 0,3 ml směsi ADS/glukóza/trypsin na srdce, s použitím trypsinu T 4674 (Sigma, St Louis, Missouri) v konečné koncentraci 0,1 mg/ml, po dobu 20 minut ve 37 °C, za jemného míchání (60 až 100 otáček za minutu).

Supernatant pak byl odstraněn a trypsin byl deaktivován přidáním 1 ml FCS zbaveného komplementu. Po centrifugaci v 1500 rpm po dobu 10 minut byl supernatant odstraněn a srdeční buňky byly nabrány do 1 ml FCS zbaveného komplementu. Souběžně byly kroky ošetření trypsinem opakovány 5 až 6 krát, dokud nebylo dosaženo kompletní disociace buněk. Pool buněk byl stočen v 1500 rpm po dobu 10 minut, pak byl dvakrát promyt v FCS a buňky byly konečně filtrovány na mřížkovém filtru.

Takto oddělené buňky pak byly uloženy do kultury v koncentraci 10⁶ buněk/jamka na 24 jamkovou destičku nebo v koncentraci 2 x 10⁶ buněk/jamka na 12 jamkovou destičku.

• · 4 · 4 4 »4 44

444 444 44 4 • 4444 4 4444 4 4 4

4 444 44 444 4 4

4 4444 4444

444 44 44 4 · 44

- 23 Každá jamka obsahovala 1 ml kultivačního média.

Kultivační médium obsahovalo v celkovém objemu 100 ml, 68 ml DMEM (bez pyruvátu) (Gibco-BRL), 17 ml M199 (Sigma M 4530), ml koňského séra zbaveného komplementu (Sigma H6762), 5 ml

FCS zbaveného komplementu (Gibco-BRL) a 1 ml lOOx směsi Peni/Strepto/glutamin (Gibco-BRL).

Kardiomyocyty byly pěstovány po dobu přibližně 1 nebo 2 dny.

Přiklad 5

Transfekce primárních kultur kardiomyocytů

Primární kultury kardiomyocytů byly kotransfekovány celkovým množstvím DNA rovnajícím se 500 ng na jamku, obsahující 1 ng plazmidu pRL-CMV (Promega lne., Madison, WI), variabilním množstvím v rozmezí od 1 do 100 ng každého z plazmidů pXL3635 a pXL3634, jak bylo popsáno výše, q.s. 500 ng pUCl9.

Směs plazmidů byla inkubována s 6 nmol RPR 120535B (Byk et al., J Med Chem. 41, 1998, 229-35) na gg DNA (0,3 μΐ roztoku lipidu v koncentraci 10 mM) v konečném objemu 20 μΐ ve 150mM NaCl, 50mM hydrouhličitanu, a pak míchána na vortexu po dobu 5 sekund a znovu inkubována po dobu přibližně 20 až 30 minut při teplotě místnosti.

Směs pak byla přidána ke 250 μΐ média bez séra a inkubována s buňkami po dobu alespoň 2 hodin. Médium bylo nakonec odstraněno a buňky byly inkubovány po dobu pohybující se od 24 hodin do 7 dnů při teplotě 37 °C v přítomnosti 5% CO₂.

Buňky byly sklízeny 24 hodin nebo 48 hodin po transfekci a • · ··· ·

004«

- 24 «0 4«

0 0 0 0 «404 « 4 0 «0 0 «444 «000

00« «0 00 «4 «0 aktivita Renillia luciferázy a luciferázy ze světlušek byla analyzována s pomocí soupravy Promega Duál Luc podle instrukcí výrobce. Aktivity byly odečítány na přístroji Victor.

Příklad 6

Komparativní vyhodnocení in vitro aktivity polynukleotidu

Relativní aktivity CARP polynukleotidu (pXL3634) a RSV (pXL3635) promotorů byly vyhodnoceny in vitro přechodnou transfekcí v primárních kulturách kardiomyocytů z laboratorních potkanů a byly exprimovány relativně k aktivitě plazmidů pRL-CMV (obrázek 5) .

Výsledky ukazují, že použitý polynukleotid v protisměru od CARP genu (pXL3634) má velmi nízkou in vitro aktivitu, řádově 0,04 % relativně k aktivitě CMV promotoru.

Relativní aktivita nespecifického silného RSV promotoru (pXL3635) byla také nízká, v daném pořadí řádově 0,05 % a 0,68 % aktivity referenčního CMV promotoru.

Příklad 7

Konstrukce adenoviru

Adenovirus umožňující expresi luciferázy pod kontrolou CARP promotoru byl konstruován podle způsobu autorů Crouzet et al. (PNAS, 94, 1997, 1414-1419), expresní kazeta byla totožná s kazetou plazmidů pXL3634 (obrázek 3).

Kyvadlový vektor umožňující rekombinaci v E. coli byl konstruován ve dvou stádiích. Nejdříve byl CARP promotor

44 4

- 25 * * 4 · * * · · 4 4 4 4 ··· 4 4 4 · · · ····* 4 · ··· · · ·

4 444 44 444 4 4

4 4444 4*44

4*4*9 *· ·4 44 4* (fragment: Xhol doplněn Klenow/BamHI) zaveden do pXL3474 (štěpen se Seal a BglII) mezi úseky ITR-Ψ a pIX, aby vznikl piazmid pXL3758. pXL3759 pak byl vytvořen zavedením do pXL3758, štěpením s BstBII (doplněn Klenowem) a BstEII, fragment obsahující luciferázovou cDNA a SV40 polyadenylační místo (BamHI fragment doplněn s Klenow/BstEII z pXL3634). pXL3759 je schématicky ukázán na obrázku 6A.

Homologní dvojitá rekombinace v E. coli byla uskutečněna tak, jak bylo popsáno výše, před plazmidem pXL3215 obsahujícím ΔΕ1/ΔΕ3 adenovirový genom, do kterého byla zavedena RSV-LacZ expresní kazeta do El úseku. Piazmid pXL3215 je derivát plazmidu pXL2689, který obsahuje replikační počátek plazmidu RK2, gen rezistence na tetracyklin (Crouzet et al. PNAS, 1997). Produkt této dvojité rekombinace, piazmid pXL3778, byl kontrolován sekvencováním expresní kazety. Po štěpení s PacI, aby se uvolnil lineární virový genom, byl piazmid transfekován do buněčné linie Per.C6 (WO 97/00326), aby se vytvořil virus AVI.0CARP-Luc+.

Virus byl také kontrolován sekvencováním expresní kazety restrikční analýzou a přítomnost částic RCA E1+ (replikačně kompetentní adenovirus) byla testována hybridizací se sondou Ψ.

Zásobní roztoky s vysokým titrem viru byly získány amplifikací viru v linii Per.C6 a virové částice byly purifikovány na CsCl gradientu. Titr tohoto viru ve virových částicích/ml (vp/ml) byl získán chromatografií a aktivita byla testována in vitro titrací luciferázové aktivity po infekci svalových buněk kosterního svalstva nebo kardiálních svalových buněk a srovnáním s viry používanými jako kontrola obsahujícími CMV promotor.

»4 4444 • 4 4444

- 26 44 44 • 4 · · · 4 4« 4

44444 44444 44 4

4 444 44 444 4 4 · 4 » 4 4 4 4444

444 4 4 44 44 44

Příklad 8

Injekce DNA in vivo

Laboratorní potkani kmene CD SPRAGUE o hmotnosti 200 g byli uvedeni do anestézie směsí Ketaminu v koncentraci 70 mg/ml/Xylazinu v koncentraci 6 mg/ml v dávce 1 ml/kg injikované intraperitoneálně.

Intramyokardiální injekce byly prováděny po laparotomii transdiafragmaticky Hamiltonovou skleněnou injekční stříkačkou o objemu 100 μΐ připojenou ke katétru Steriflex (ref. 167.10 G19 V) vybaveným stop-přírubou a ukončeným jehlou BD 26G*3.8 (krátké sešikmení). Po dobu 5 sekund tak bylo injikováno 50 μΐ DNA roztoku v 0,9% NaCl.

Po utracení zvířat byla srdce odstraněna, promyta v 0,9% roztoku NaCl a makroskopicky vyšetřena. Srdce pak byla analyzována na luciferázovou aktivitu pomocí soupravy (Promega E151A) po rozmělnění homogenizátorem (Ultra-thurax, Diax600 Heidolph) v lyzačním pufru ze soupravy doplněném inhibitory proteázy (C0mplete™, Roche Diagnostics), pak následovala centrifugace po dobu 20 minut ve 4 000 rpm ve 4 °C. Odečty byly prováděny na přístroji LUMAT LB 9501 (10 μΐ supernatantu + 50 μΐ luciferázového substrátu Promega). Luciferázové aktivity byly konvertovány na hmotu luciferázy v srdci (pg luciferázy/srdce) s použitím kalibrace popsané v práci autorů Mir et al (PNAS, 96, 1999, 4262-4267) .

Alternativně byla srdce fixována ve 3,7% paraformaldehydu a analyzována imunohistochemickým vyšetřením na expresi FGF-1.

- 27 ♦ · AAAA • A A · · · A A A

A AAAA A AAAA A A A

A A AAA AA AAA A A

AA A AAAA AAAA • A AAA AA AA AA AA

Příklad 9

Komparativní vyhodnocení in vivo aktivity CARP polynukleotidu

Výsledky shrnuté na obrázku 7A ukazují, že hladiny exprese luciferázy získané po injekci zvyšujících se dávek 1, 5, 25 a 125 μρ plazmidů pXL3031 a pXL3634, nejsou významně odlišné, což jasně dokazuje, že polynukleotid v protisměru od CARP genu je schopný indukovat vysoké hladiny exprese ekvivalentní hladinám silného promotoru, jako je například CMV.

Na druhé straně, exprese dosažená s dalším silným virovým promotorem, promotorem RSV (pXL3635), byla slabší, než exprese dosažená s CMV promotorem nebo polynukleotidem v protisměru od CARP genu (obrázek 7B).

Navíc, ačkoli se přidání CMV enhanceru v protisměru od promotorů buněk hladkého svalstva (SM α-aktin, pXL3130 nebo SM22, pXL3153) ukázalo in vitro velmi účinné (WO 00/18908), zdá se, že in vivo je v srdečních buňkách neúčinné.

Příklad 10

Vyhodnocení specifity exprese CARP polynukleotidu

Intrakardiální transdiafragmatickou injekcí bylo laboratorním potkanům podáváno 25 μg každého z plazmidů pXL3634, pXL3435 a pXL3031 .

Souběžně byly prováděny intramuskulární injekce do kraniálního holenního svalu skupiny myší 10 μg každého z těchto plazmidů s elektrotransferem nebo bez něj.

Exprese luciferázy byla analyzována 7 dnů po injekci tak, • ••4

44 4

444 444 44 4

4 4·· 4 4 444 4 4 4

449449949 4

4 4444 4444

444 44 4« 44 44

- 28 jak bylo popsáno (PNAS, 96, 1999, 4262-4267).

Hladiny exprese luciferázy v srdci byly exprimovány relativně k hladinám pozorovaným v kraniálním holenním svalu a jsou shrnuty na obrázku 8.

Výsledky jasně ukazují, že polynukleotid v protisměru od CARP genu a CMV promotor jsou jediné dva promotory schopné indukovat nej vyšší expresi v srdeční tkáni. Nicméně, poměr exprese srdce/sval je 1 při CMV promotoru, zatímco tento poměr je blízko 100, když byl použit polynukleotid v protisměru od CARP genu, což jasně ukazuje velice vysokou selektivitu druhého uvedeného k srdeční tkáni.

Výhodnost specifity exprese polynukleotidu je také jasná relativně k jiným konstruktům obsahujícím enhancer a promotor specifický pro buňky hladkého svalstva, jako je například genu kódujícího protein SM-22 a aktin, jehož poměr exprese srdce/sval jsou také uvedeny pro ilustraci na obrázku 8.

- 29 •9 ···· • 9 ·· • 99 999 99 • · 99« · · 99« 9 ·

9 9 9 9 9 99 *9 *«« 99 99 9« • «99

Seznam sekvencí <160> 3 <Π0> PatentTn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2358 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 ggatcctttc atgtttaaca atatcaaccc,taacccaagg ggaacagcct gcctgacagt 60 ggctttgcca cccatgaata cttcctagtc tagtocgttt gtgaaactca goccatccca 120 acacttctgc aagccccatc ctctacaagg tgctcattgg gaatttcctg gagcttctct 180 ttcaggatca gcctgattct agggcagcag ttctcaacct gggggcctcg accectttgg 240 gggaatcaaa cgacccttta caggggtoac atatcatcta tcctatatgt caggtattta 300 cattacgatt čgtaacagta gcaaaattae aggtatgaaa tagcaatgaa ataattttat 360 gattgaaggfc caccacaaca tgaggccgcc acactgttct agagaaaaat cacctgggtg 420 gggaaaggtt tgggaaagcc tttctgtcca ttcttcattc ttcaaagtga tgtgttcaca 480 gaaagccttt cagctgttct gctggggcto ttagtaagtc tgagtaggaa ctgtatgtac 540 caggtctgct tcttatgggt ggagccaaga cgcatcgtgg gtggagcgaa gacgcaacct 600 caccttctag ctctgcatcc atagcaagta gcctaatgtt tctgtgtcta ggtgtcatct 660 ctgtgaatcg agatcctfcgg ócttgcttga attagggagg cacaaaatac toagagattc 720 aagactgctc agcagcccag agtccttcct caaaggaaag gtctcaactc tcagcccccc 780 ttagctctga gtcaggcctg gaacaaacgg ccacaggaat gagaaaagct gccatagctg 840 cttgtcactt caagaggfcca aagaaaatag tgttaaccat gaaaacgaga agaccaacag 900 ttatccattg atagcgtctc aggacagata ggacagagag aacactagga gaggggaacc 960 cacgaaggac aággtattag tgtgttggtt ttcagggcaa tgtcttgtac tgaagattct 1020 agaaacaoaa tttgctggtt gaacagctga agtggggtgg gggttcttae ccčatgttca 1080 tggaagggtg agtgaggaga gacagatata tgatggccag cataacaaac atacacaaca 1140 ccctaattaa cacttccctc ttctactgac acccccttca ctctcctctt tcataaaaaa 1200 taáaaaaagt attttatgtg gctcttacga tagaatcttt ectcgaacta taaaaagatc 1260 taaatattta tatttttcac attttaatat cttagcgatg acaagccaga aacaagtatt 1320 ttttgcctct ctcaacagaa aagcttgggg cctttttgtt tccgtgttag gaatagaaca 1380 cgagágcccc gtgtatctag gcagatgctc tatcattagc ccatgagtot ccagcctcag 1440 acgcacattt ttctcgggct ctcttaagct tttcccacag cattgggaaa ctttactgac 1500 agcatccaag ttgtgcttct gctaagaact ggactcacat ctctctgtgo atcacfctcgg 1560 cccgttttgg ggtagatcct ctgattagcc ttcagáttta gaacacggtg agcctgtggt 1620 gcactaatta tggccagtga caccatagag tcaaagtgca ttactgaatg ctttcaattt 1680 etectaatgc tggtacgatg gcatgtcaca gggccatttt agctgcagac atcactccag 1740 agaattccaa acagatagag acaagtggca cccagaccca tctccttccc etcgggctga 1800 ttatccccag aaataggatg tcccaaagca acacttccca gcoaactgga gtgctgataa 1860 gtccagttat cagaaagata tggctgtaag tgtgatgcac agtgcttgca ttttcttgat 1920 acgttagtca tatgagagct gacaaagaag gaaaaagagc agcgatgtgg tgcaatatta 1980 acaggeagct gtcccctggc ttcccgatac gtgggatgac tcgcattgct gagcggtgtg 2040 gtcactgoca aaggaatgac cctctcacat ttcttcctga ttcgcatacg ccgcggccag 2100 cttgtcatct ccctcttggg cttcocagac actaagtctg gaatgaaaat tcacctgcct 2160 ctgaattggc cactggtggg ggcaggggtg tgacttggct tcecaggctg gaagattatc 2220 tcacccagcc ctagctatat aacgggctgg tgtggagggg ctccacaggg ccagttccag 2280 gggttcatcc acaagagaga aaaacataga ctcgaggtct agggagcttg catgcctgca 2340 ggtcggaggc oaccatgg 2358

- 30 ·· ···« «· ·*··

9 9 9 9 9 9 9 9

9 999 9 9 999 99 9

9 999 99 999 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 ·· 999 99 99 99 99 <210> 2 <211> 2074 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ctgcagcaag ttacttaatg ttttttgcct cagcatcctc gtcttgctcc aacttcgagg gcatggacag ctctgggatt catcccaoag tcottcoecc aaacacttct cctcctaata gcctggaaca aaaaggčata cgaaatggta gaaaaagtgt gatgaagaga ccaatgaaaa tagtaatgac tctgtttgct ataggagcta tacaaagaag attagcatgg actctgtgca gaaacattcc atatattaaa aataaataaa taataaagag aaaatagtga tagctgtgtc catctcaaag aaaagcccag cctttaagat agaatattag gagaccggaa catatgatac ctctttgtca afcgttttgtc ttggggtggg gagtcgatgt accatccact gactgagcat tcaaggggca agaggagaat gggtgagttt ggggagaaat agacacacaa aggtcaaaca ccctccattc acaattccct tctcccattc ttctatcctg agtttttcct gaaactataa aaataccccc agtatgttta ttagaaacca gaaatagaga cottttoaac ccttccggaa agccacgtgt ctcaaatctt gatgcatcag aatcatctgg attcctacga gttaccataa atcaactcag aattccctgg tttctgacaa gctcccacag gtgattcctt tccccacagc tgacctaatc agagtcctgc cattgctaat atctggtctc tagtatttgt ggtagagatg ggattttgcc atgttgccca gctaagcaat cttcctgtct ctgcctccca aaatgttggg cacecggctg atagctggtt tcatttactc tatttcttga gtaaaáatgc tccaattafct atgctgtttfc agaacacggt gccagtgaca tcátaaaaga aaagtgcatt actgaatgct gtaaggtggc atgtcatggg gcctatttag cccagacatc gatatagaca agtgccttta gggccoagat cccttcccct taggatgtcc tgggacaagt ttcccctaag tgaagtgttg gatattactg ggggtgtgat atgtagggca tctacatttt aagctgacaa agaaaaaaag ggcagtgatg tggtgcaatg gactcttgác aaataggatg acttgcattg ctgagcgatg gccctctcac atttcttcct gattcacata ttcagcaggg tcttcagctt cccagacact gagtctggaa tgaaaattca taátgggggc gggagtgtta cttcggttcc cággttggaa gctatataag ctgaccggtg tggaggggoc cagcagggcc cgacagaaaa acatacaaga ctccttcagc caac tctgtaaaat gagagcatta 60 tcatatccaa gacccttaaa 120 cctccctcag tttgggtcag 180 ccatgactac ttatgactta 240 tcagcaggac atatactaaa 300 agaatgacac acaaatttgt 360 aaaaggaaaa aattaaaaag 420 gagatttcct ttatttacco 480 aggaggtact gggagggtcc 540 cttctcaaag tttcagaaac 600 ggcagceaca tttgttgatt 660 taacttccta attaacactt 720 tcttttacts akaraaaccc 780 cataatttac acctcaaaga 840 gcaaagtgca ttatccctcc 900 ' gtgctttkaa attcaagatg 960 agtggggcca gggatctgta 1020 , atttgagaac ttcagctcaa 1080.· atttttbtca tatatatata 1140 ggctagtatt gaactcctaa 1200 attacaggtg taagccactg 1260 ccactctgat ecattttgaa 1320 . aagcatgtca tgtgctaatg 1380 ttcaatgtct tataatgatg 1440 actccaaaga attccaaaca 1500 caggetgttt acccagggaa 1560 ataagtctgc ttatcagaaa 1620 cttgataggt agtcatatga 1680 tcaacagaca gctgtcccct 1740 tgatcaccac caaaggaatg 1800 ttagcttgtc ctcccctccc 1860 cctgcctctg agttggctcc 1920 gattatctca cccggcccca 1980 aactccaggg attccttcca 2040

2074 <210> 3 <211> 750 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Met Gly Glu Thr Leu Gly Asp Ser Pro Ile Asp Pro Glu Ser Asp Ser 1 5 10 . 15 .

- 31 ·« ···« • · * • · · · · • · ·

9 ·

9 99 • · · • « ··· • · · a • · · « a· «« ·««« a

Phe

Thr

Asp

Thr 20

Leu

Ser

Ala

Asn

Ile 25

Ser

Gin

Glu

Met

Thr Met 30

Val

Asp

Thr

Glu 35

Met

Pro

Phe

Trp

Pro 40

Thr

Asn

Phe

Gly

Ile 45

Ser Ser

Val

Asp

Leu 50

Ser

Val

Met

Glu

Asp 55

His

Ser

His

Ser

Phe 60

Asp

Ile Lys

Pro

Phe 65

Thr

Val

Asp

Phe 70

Ser

Ile

Ser

Thr 75

Pro

His

Tyr Glu

Asp 80

Ile

Pro

Phe

Thr

Arg 85

Thr

Asp

Pro

Val

Val 90

Ala

Asp

Tyr Lys Tyr Asp 95

Leu

Lys

Leu

Gin 100

Glu

Tyr

Gin

Sex

Ala 105

Ile

Lys

Val

Glu

Pro Ala 110

Ser

Pro

Tyř 115

Tyr

Ser

Glu

Lys

Thr 120

Gin

Leu

Tyr

Asn

Lys 125

Pro His

Glu

Pro 130

Ser

Asn

Ser

Leu

Met 135

Ala

Ile

Glu

Cys Arg 140

Val

Cys Gly Asp

Lys 145

Ala

Ser

Gly

Phe

His 150

Tyr

Gly

Val

His

Ala 155

Cys

Glu

Gly Cys

Lys 160

Gly

Phe

Arg

Arg 165

Thr

Ile

Arg

Leu

Lys 170

Leu

Ile

Tyr

Asp Arg 175

Cys

Asp

Leu

Asn

Cys Arg 180

Ile

His

Lys

Lys 185

Ser

Arg

Asn

Lys

Cys Gin 190

Tyr

Cys

Arg

Phe 195.

Gin

Lys

Cys

Leu

Ala 200

Val

Gly

Met

Ser

His 205

Asn

Ala

Ile

Arg

Phe 210

Gly Arg

Met

Pro

Gin 215

Ala

Glu

Lys

Glu

Lys 220

Leu

Ala

Glu

Ile 225

Ser

Asp

Ile

Asp 230

Gin

Leu

Asn

Pro

Glu 235

Sex

Ala

Asp

Leu

Arg 240

Ala

Leu

Ala

Lys

His 245

Leu

Tyr Asp

Ser

Tyr 250

Ile

Lys

Ser

Phe

Pro 255

Leu

Thr

Lys

Ala

Lys 260

Ala

Arg

Ala

Ile

Leu 265

Thr

Gly Lys

Thr

Thr 270

Asp

Lys

Ser

Pro

Phe 275

Val

Ile

Tyr Asp

Met 280

Asn

Ser

Leu

Met

Met 285

Gly

Glu

Asp

Lys

Ile

Lys

Phe

Lys

His

Ile

Thr

Pro

Leu

Gin

Glu

Gin

Sex

Lys

Glu

290 29S 300

- 32 φφ ·Φ*« • φ • φ • φ • * * · «

φ«· * · φ

Λφφ

Φ· »* »· φ

Φ·· φ · φ • φ φφ φ φ φ φ φ φ φ » φφ ·»·· φφ «

t • φ φφ

Val	Gin Glu	Ile	Thr 325	Glu Tyr Ala Lys Ser Ile Pro Gly Phe Val Asn
330	335
Leu	Asp Leu	Asn	Asp	Gin Val Thr Leu Leu Lys	Tyr Gly Val His Glu
		340		345	350
Ile	Ile Tyr	Thr	Met	Leu Ala Ser Leu Met Asn	Lys Asp Gly Val Leu
	355			360	365
Ile	Ser Glu	Gly	Gin	Gly Phe Met Thr Arg Glu	Phe Leu Lys Ser Leu
	370			375	380
Arg Lys Pro	Phe	Gly Asp Phe Met Glu Pro Lys	Phe Glu Phe Ala Val
385				390 395	400
Lys Phe Asn	Ala	Leu	Glu Leu Asp Asp Ser Asp	Leu Ala Ile Phe Ile
			405	410	415
Ala Val Ile	Ile	Leu	Ser Gly Asp Arg Pro Gly	Leu Leu Asn Val Lys
		420		425	430
Pro	Ile Glu	Asp	Ile	Gin Asp Asn Leu Leu Gin	Ala Leu Glu Leu Gin
	435			440	445
Leu	Lys Leu	Asn	His	Pro Glu Ser Ser Gin Leu	Phe Ala Lys Leu Leu
	450			455	460
Gin	Lys Met	Thr	Asp	Leu Arg Gin Ile Val Thr	Glu His Val Gin Leu
465				470 ' 475	,480
Leu	Gin Val	Ile	Lys	Lys Thr Glu Thr Asp Met	Ser Leu His Pro Leu
			485	490	495
Leu	Gin Glu	Ile	Tyr	Lys Asp Leu Tyr Ala Trp	Ala Ile Leu Thr Gly
		500		505	510
Lys	Thr Thr	Asp	Lys	Ser Pro Phe Val Ile Tyr Asp Met Asn Ser Leu
	515			520	525
Met	Met Gly	Glu	Asp	Lys Ile Lys Phe Lys His	Ile Thr Pro Leu Gin
	530			535	540
Glu	Gin Ser	Lys	Glu	Val Ala Ile Arg Ile Phe	Gin Gly Cys Gin Phe
545				550 555	560
Arg	Ser Val	Glu	Ala	Val Gin Glu Ile Thr Glu	Tyr Ala Lys Ser Ile
			565	570	575
Pro	Gly Phe	Val	Asn	Leu Asp Leu Asn Asp Gin	Val Thr Leu Leu Lys
		580		. 585	590
Tvr Gly Val	HIS	Glu	Ile Ile Tyr Thr Met Leu	Ala Ser Leu Met Asn
	595			600	605
Lys Asp Gly	Val	Leu	Ile Ser Glu Gly Gin Gly	Phe Met Thr Arg Glu
	610			615	620
Phe	Leu Lys	Ser	Leu	Arg Lys Pro Phe Gly Asp	Phe Met Glu Pro Lys

- 33 • ·· • · · ·· · · ···· • · · · · · • · · · · · · · • · »·· ·· · · · · · • · · · · · · ···· 99 999 9 9 9 9 9 9 9 9

625

630

635

640

Phe

Glu

Phe

Ala

Val 645

Lys

Phe

Asn

Ala

Leu 650

Glu

Leu Asp Asp

Ser 655

Asp

Leu

Ala

lle

Phe 660

lle

Ala

Val

lle

lle 665

Leu

Ser

Gly Asp Arg 670

Pro

Gly

Leu

Asn 675

Val

Lys

Pro

lle

Glu 680

Asp

lle

Gin

Asp

Asn 685

Leu

Gin

Ala

Leu 69Ó

Glu

Leu

Gin

Leu

Lys 695

Leu

Asn

His

Pro

Glu 700

Ser

Gin

Leu

phe 705

Ala

Lys

Leu

Gin 710

Lys

Met

Thr

Asp

Leu 715

Arg

Gin

lle

Val

Thr 720

Glu

His

Val

Gin

Leu 725

Leu

Gin

Val

lle

Lys 730

Lys

Thr

Glu

Thr

Asp 735

Met

Ser

Leu

His

Pro

Leu

Gin

Glu

lle

Tyr

Lys

Asp

Leu

Tyr

740 745 750

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Polynukleotid obsahující fragment sekvence v protisměru od kódující části genu pro protein CARP mající sekvenci uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 1 nebo sekvenci, která s ní hybridizuje v podmínkách vysoké stringence, přičemž polynukleotid je schopen indukovat in vivo specifickou expresi genu operativně spojeného s polynukleotidem v srdečních buňkách.
2. Polynukleotid, který má alespoň 93% identita se SEKVENCÍ ID. Č. 1.
3. Polynukleotid podle nároku 1, kde fragment je obsažen v sekvenci zahrnující nukleotidy -2266 až +92 v myším genu pro protein CARP uvedeném jako SEKVENCE ID. Č. 1.
4. Expresní kazeta, která obsahuje sekvenci kódující požadovaný terapeutický protein nebo RNA, kterážto kazeta je umístěna pod kontrolu DNA sekvence definované ve kterémkoliv z nároků 1 až 3.
5. Expresní kazeta, která obsahuje sekvenci kódující požadovaný terapeutický protein nebo RNA, kterážto kazeta je umístěna pod kontrolu DNA sekvence mající alespoň 80% sekvenční identitu se sekvencí uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 2.
6. Kazeta podle kteréhokoliv z nároků 4 a 5, kde protein nebo RNA jsou schopny aktivovat růst srdečních buněk, redukovat nebo potlačovat imunitní reakce, indukovat angiogenezi, korigovat kontraktilitu svalu, srdeční • · · ·

- 35 4·· 4 4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 4444 4 4 4 «4 444 44 ·«4 4 4

44 4 4444 4444 «4 444 44 4 0 4 4 44 hypertrofii, srdeční vadu a myokarditidu.
7. Kazeta podle kteréhokoliv z nároků 4 až 6, kde požadovaný terapeutický protein je protein z rodiny obsahující VEGF, FGF, angiopoetiny a cytokiny.
8. Kazeta podle kteréhokoliv požadovaný terapeutický protein je transkripční faktor.

z nároků 4 až 6, kde aktivační nebo inhibiční
9. Kazeta podle kteréhokoliv z nároků 4 až 6, kde požadovaný terapeutický protein je imunosupresivní protein jako například interleukin-10, interleukin-2 a interleukin-8.
10. Kazeta podle kteréhokoliv z nároků 4 až 6, kde požadovaná terapeutická RNA je antisense RNA, která umožňuje potlačit expresi genů nebo blokovat transkripci z mRNA v srdečních buňkách.
11. Kazeta podle nároku 4 až 6, kde protein je agens pro redukci hypoxie, vybrané ze skupiny obsahující syntetázu oxidu dusnatého (NOS), superoxid dismutázy (SOD) a katalázy.
12. Vektor, který obsahuje polynukleotid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3.
13. Vektor, který obsahuje expresní kazetu podle kteréhokoliv z nároků 4 až 11.
14. Vektor, který obsahuje replikační počátek, který je účinný v srdečních buňkách.

• · · 4 · ·

- 36 ·· · ··· ♦ · ♦ · · · • 4 4 44 4 • 4 * • 44 » · · 4444 4444

4444· 4 4 44 44 44
15. Vektor podle kteréhokoliv z nároků 12 až 14, kterým je plazmid, kozmid nebo jakákoliv DNA, která není ve virové kapsidš.
16. Vektor podle kteréhokoliv z nároků 12 a 14, kterým je rekombinantní virus vybraný ze skupiny obsahující adenovirus, retrovirus, herpesvirus, adeno-asociované viry nebo jejich deriváty.
17. Kompozice vyznačující se tím, že obsahuje vektor podle kteréhokoliv z nároků 12 až 16.
18. Kompozice vyznačující se tím, že obsahuje vektor podle kteréhokoliv z nároků 12 až 16 a chemické nebo biochemické přenosové agens.
19. Lék vyznačující se vektor podle kteréhokoliv z nároků 12 až tím,

16.

že obsahuje
20. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství polynukleotidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 nebo vektoru podle kteréhokoliv z nároků 12 až 16.
21. Použití polynukleotidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 nebo vektoru podle kteréhokoliv z nároků 12 až 16 pro výrobu léku určeného pro léčení srdeční vady.
22. Použití polynukleotidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 nebo vektoru podle kteréhokoliv z nároků 12 až 16 pro výrobu léku určeného k léčení srdeční hypertrofie.

- 37 * · · » · 0 0 · ··· «00 0« 0 0 0440 « 009« « 0 « • 40 0

40 0 0000 000«

00 900 00 00 0« 00
23. Použití polynukleotidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 nebo vektoru podle kteréhokoliv z nároků 12 až 16 pro výrobu lék určeného léčbě hypoxie.
24. Použití polynukleotidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 nebo vektoru podle kteréhokoliv z nároků 12 až 16 pro výrobu léku pro prevenci rejekce během srdeční transplantace.
25. Transgenní zvíře, které nese polynukleotid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, ve kterém je gen kódující požadovaný terapeutický protein nahrazen reportérovým genem.
26. Způsob in vivo exprese požadovaného terapeutického genu vyznačující se tím, že zahrnuje kroky

a) izolace vektoru podle kteréhokoliv z nároků 12 až 16 a

b) vnesení účinného množství vektoru do srdeční tkáně v podmínkách, kdy je požadovaný gen exprimován.