CN1556855A - 3-羟基丙酸及其它有机化合物 - Google Patents

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雷弗·R·戈卡恩
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托斯滕·塞尔默
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Abstract

本发明提供了与生产3－羟基丙酸和其它有机化合物相关的方法和材料。具体地说，本发明提供了用于生产3－羟基丙酸和其它有机化合物分离的核酸、多肽、宿主细胞以及方法和材料。

Description

3-羟基丙酸及其它有机化合物
发明领域
本发明涉及可用于生产有机酸和相关产品的酶和方法。
相关申请参考
本申请要求下列美国临时专利申请的优先权，分别在此引作参考：2000年11月20日提交的美国临时专利申请60/252,123；2001年4月20日提交的美国临时专利申请60/285,478；2001年7月20日提交的美国临时专利申请60/306,727；以及2001年9月7日提交的美国临时专利申请60/317,845。
发明背景
有机化合物如有机酸、酯和多元醇可以用来合成塑性材料和其它产品。为了满足对有机化合物日益增长的需求，人们正在开发一些更有效、更经济的方法，这些方法利用了基于碳水化合物而不是碳氢化合物的原材料。例如，已经利用了某些细菌生产大量的乳酸，这些乳酸被用于生产聚乳酸。
3-羟基丙酸(3-HP)是一种有机酸。尽管已经报道了几种生产3-羟基丙酸的化学合成途径，但迄今为止，仅有一条生物催化的途径已公开(WO01/16346，Suthers等)。3-羟基丙酸可用于合成一些特殊产品，还可以通过一些化学工业中已知的技术转化为具有重要商业价值的中间体，如通过脱水生成丙烯酸、通过氧化生成丙二酸、通过与醇的酯化反应生成酯，以及通过还原生成1，3-丙二醇。
发明概述
本发明涉及用于生产3-羟基丙酸及其它有机化合物(如1，3-丙二醇、丙烯酸、聚丙烯酸、丙烯酸酯、聚3-羟基丙酸、3-羟基丙酸酯以及丙二酸和丙二酸酯)的方法和材料。具体地说，本发明提供了用于生产3-羟基丙酸及其它有机化合物，如1，3-丙二醇、丙烯酸、聚丙烯酸、丙烯酸酯、聚3-羟基丙酸、3-羟基丙酸酯以及丙二酸和丙二酸酯的核酸分子、多肽、宿主细胞和方法。3-羟基丙酸具有潜在的生物学和商业上的重要性，例如，在营养工业中可使用3-羟基丙酸作为食品和饲料添加剂或防腐剂，上面提到的各种衍生物也可以从3-羟基丙酸生产。此处提到的核酸分子可用于对宿主细胞进行基因工程改造，使其具有生产3-羟基丙酸及其它有机化合物如1，3-丙二醇、丙烯酸、聚丙烯酸、丙烯酸酯、聚3-羟基丙酸和3-羟基丙酸酯的能力。此处提到的多肽可用在无细胞体系中生产3-羟基丙酸及其它有机化合物，如1，3-丙二醇、丙烯酸、聚丙烯酸、丙烯酸酯、聚3-羟基丙酸和3-羟基丙酸酯。此处提到的宿主细胞可用在培养体系中以大量生产3-羟基丙酸及其它有机化合物，如1，3-丙二醇、丙烯酸、聚丙烯酸、丙烯酸酯、聚3-羟基丙酸和3-羟基丙酸酯。
一方面，本发明提供了具有乳酰辅酶A脱水酶和3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的细胞，以及通过培养至少一种具有乳酰辅酶A脱水酶和3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的细胞来生产如本文所述的那些产物的方法。在一些实施方案中，细胞还可含有一种外源核酸分子，它编码一种或多种下列多肽：具有E1激活因子活性的多肽；E2α多肽，这是具有乳酰辅酶A脱水酶活性的酶的一个亚基；E2β多肽，这是具有乳酰辅酶A脱水酶活性的酶的另一个亚基；以及具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的多肽。此外，细胞还可具有辅酶A转移酶活性、辅酶A合成酶活性、聚羟酸合酶活性、3-羟基丙酰辅酶A水解酶活性、3-羟基异丁酰辅酶A水解酶活性和/或脂肪酶活性。而且，细胞还可含有至少一种外源核酸分子，它能表达一种或多种具有下列活性的多肽：辅酶A转移酶活性、3-羟基丙酰辅酶A水解酶活性、3-羟基异丁酰辅酶A水解酶活性、辅酶A合成酶活性、聚羟酸合酶活性和/或脂肪酶活性。
在本发明的另一个实施方案中，具有乳酰辅酶A脱水酶和3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的细胞产生了一种产物，如3-羟基丙酸、聚3-羟基丙酸和/或3-羟基丙酸酯，如羟基丙酸甲酯、羟基丙酸乙酯、羟基丙酸丙酯和/或羟基丙酸丁酯。因此，本发明也提供了生产一种或多种这些产物的方法。这些方法包括了在允许产物生产的条件下培养具有乳酰辅酶A脱水酶和3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的细胞。这些细胞也可具有辅酶A合成酶活性和/或聚羟酸合酶活性。
另一方面，本发明提供了具有辅酶A合成酶活性、乳酰辅酶A脱水酶和聚羟酸合酶活性的细胞。在一些实施方案中，这些细胞还可含有一种外源核酸分子，它编码一种或多种下列多肽：具有E1激活因子活性的多肽；E2α多肽，这是具有乳酰辅酶A脱水酶活性的酶的一个亚基；E2β多肽，这是具有乳酰辅酶A脱水酶活性的酶的另一个亚基；具有辅酶A合成酶活性的多肽；和具有聚羟酸合酶活性的多肽。
在本发明的另一个实施方案中，具有辅酶A合成酶活性、乳酰辅酶A脱水酶和聚羟酸合酶活性的细胞能够生产一种产物，如聚丙烯酸。
另一方面，本发明还提供了含有辅酶A转移酶活性、乳酰辅酶A脱水酶活性和脂肪酶活性的细胞。在一些实施方案中，这些细胞还可含有一种外源核酸分子，它编码一种或多种下列多肽：具有辅酶A转移酶活性的多肽；具有E1激活因子活性的多肽；E2α多肽，这是具有乳酰辅酶A脱水酶活性的酶的一个亚基；E2β多肽，这是具有乳酰辅酶A脱水酶活性的酶的另一个亚基；和具有脂肪酶活性的多肽。该细胞尤其可用于生产某些产物如丙烯酸的酯(如丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯和丙烯酸丁酯)。
在一些实施方案中，可以通过使用具有酶活性的多肽从3-羟基丙酰辅酶A或3-羟基丙酸来生产1，3-丙二醇。这些多肽的使用可以在体内也可在体外。在将3-羟基丙酰辅酶A转化为1，3-丙二醇时，可以使用具有氧化还原酶活性或还原酶活性的多肽(如分类于1.1.1-类中的酶)。或者，在从3-羟基丙酸生产1，3-丙二醇时，则需要将具有醛脱氢酶活性(如分类于1.1.1.34类中的酶)的多肽(1)和具有醇脱氢酶活性(如分类于1.1.1.32类中的酶)的多肽(2)联合起来使用。
在本发明的一些实施方案中，产物在体外(细胞外)生产。在本发明的其它实施方案中，产物是通过体外和体内(细胞内)相结合的方法生产的。还有一些本发明的实施方案，产物是在体内生产的。对于那些包含了体内步骤的方法，细胞可以是分离的培养细胞，也可以是完整的生物如转基因植物、非人的哺乳动物，还可以是单细胞生物如酵母和细菌(如乳杆菌、乳球菌、芽孢杆菌和埃希氏杆菌细胞)。在下文中这样的细胞被称为生产细胞。由这些生产细胞所生产的产物可以是有机产物如此处提到的3-羟基丙酸和/或核酸分子和多肽。
另一方面，本发明还提供了一些多肽，其氨基酸序列是：1)在SEQ ID NO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161中所述的序列；2)在SEQ ID NO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161中所述的序列中的至少10个连续氨基酸残基的序列；3)与在SEQ ID NO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161中所述的序列中的至少10个连续氨基酸残基具有至少65％的序列同一性；4)与在SEQ ID NO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161中所述的序列具有保守的氨基酸替代的序列；或5)与在SEQ IDNO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161中所述的序列具有至少65％的序列同一性的序列。因此，本发明还提供了编码任何在此描述的多肽的核酸序列，以及能与任何在此描述的多肽结合的特异性结合因子。同样，本发明提供了含有任何编码在此所述多肽的核酸序列的转化细胞，这些细胞可用于生产核酸分子、多肽和有机化合物。这些多肽可用于催化有机化合物的形成，或用作抗原以产生特异性结合因子。
在另一个实施方案中，本发明还提供了分离的核酸分子，它含有至少一种下列核酸序列：1)在SEQ ID NO：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162或163中所述的核酸序列；2)含有在SEQ ID NO：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162或163中所述序列中的至少10个连续核苷酸的核酸序列；3)在杂交条件(如中度或高度严格杂交条件)下，可与在SEQ ID NO：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162或163中所述的序列杂交的核酸序列；4)与在SEQ ID NO：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162或163中所述序列中的至少10个连续核苷酸具有65％的序列同一性的核酸序列；和5)与在SEQID NO：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162或163中所述序列具有至少65％的序列同一性的核酸序列。因此，本发明也提供了一种生产细胞，它含有至少一种具有任何上述核酸序列的外源核酸。该生产细胞可用于表达具有酶活性的多肽，如辅酶A转移酶活性、乳酰辅酶A脱水酶活性、辅酶A合成酶活性、脱水酶活性、脱氢酶活性、丙二酸单酰辅酶A还原酶活性、β-丙氨酸脱氨酶活性和/或3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性。因此，本发明还提供了生产由上述核酸序列编码的多肽的方法。
本发明还提供了几种方法，如从乳酸、磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)或丙酮酸生产3-羟基丙酸的方法。在一些实施方案中，从乳酸、磷酸烯醇式丙酮酸或丙酮酸生产3-羟基丙酸的方法包括在允许细胞生产3-羟基丙酸的条件下，对含有至少一种外源核酸的细胞进行培养。操作这些方法可以使用此处所述的各种类型的生产细胞。在一些实施方案中，生产细胞可以具有一种或多种下述活性：辅酶A转移酶活性、3-羟基丙酰辅酶A水解酶活性、3-羟基异丁酰辅酶A水解酶活性、脱水酶活性和/或丙二酸单酰辅酶A还原酶活性。
在其他实施方案中，生产3-羟基丙酸的方法包括：乳酸与具有辅酶A转移酶活性或辅酶A合成酶活性的第一个多肽作用形成乳酰辅酶A，生成的乳酰辅酶A再与具有乳酰辅酶A脱水酶活性的第二个多肽作用形成丙烯酰辅酶A，丙烯酰辅酶A再与具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的第三个多肽作用生成3-羟基丙酰辅酶A，3-羟基丙酰辅酶A再与第一个多肽作用形成3-羟基丙酸，或与具有3-羟基丙酰辅酶A水解酶活性或3-羟基异丁酰辅酶A水解酶活性的第四个多肽作用形成3-羟基丙酸。
另一方面，本发明提供了生产聚3-羟基丙酸的方法。这些方法包括：用前述方法生产3-羟基丙酰辅酶A，然后将3-羟基丙酰辅酶A与具有聚羟酸合酶活性的多肽作用形成聚3-羟基丙酸。
在本发明的另一种实施方案中，提供了生产3-羟基丙酸酯的方法。这些方法包括：用前述方法生产3-羟基丙酸，然后再将3-羟基丙酸与具有脂肪酶活性的第五个多肽作用形成3-羟基丙酸酯。
本发明还提供了生产聚丙烯酸的方法。这些方法包括对同时具有辅酶A合成酶活性、乳酰辅酶A脱水酶活性和聚羟酸合酶活性的细胞进行培养以生产聚丙烯酸。因此，本发明也提供了生产聚丙烯酸的方法，其中乳酸与具有辅酶A合成酶活性的第一个多肽作用形成乳酰辅酶A，生成的乳酰辅酶A再与具有乳酰辅酶A脱水酶活性的第二个多肽作用形成丙烯酰辅酶A，丙烯酰辅酶A再与具有聚羟酸合酶活性的第三个多肽作用生成聚丙烯酸。
本发明还提供了生产丙烯酸酯的方法。这些方法包括在让细胞生产丙烯酸酯的条件下，对具有辅酶A转移酶活性、脂肪酶活性和乳酰辅酶A脱水酶活性的细胞进行培养。
在另一个实施方案中，本发明提供了生产丙烯酸酯的方法，其中用前述方法生产丙烯酰辅酶A，然后将丙烯酰辅酶A与具有辅酶A转移酶活性的多肽作用形成丙烯酸，以及丙烯酸再与具有脂肪酶活性的多肽作用形成丙烯酸酯。
本发明还提供了生产3-羟基丙酸的方法。这些方法包括对含有至少一种编码了至少一种多肽的外源核酸的细胞进行培养，以从乙酰辅酶A或丙二酸单酰辅酶A生产3-羟基丙酸。
另一个实施方案也提供了生产3-羟基丙酸的方法，其中乙酰辅酶A与具有乙酰辅酶A羧化酶活性的第一个多肽作用形成丙二酸单酰辅酶A，以及丙二酸单酰辅酶A再与具有丙二酸单酰辅酶A还原酶活性的第二个多肽作用形成3-羟基丙酸。
在其它实施方案中，丙二酸单酰辅酶A与具有丙二酸单酰辅酶A还原酶活性的多肽作用以形成3-羟基丙酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种利用β-丙氨酸中间体生产3-羟基丙酸的方法。该方法的操作是将β-丙氨酰辅酶A与具有β-丙氨酰辅酶A脱氨酶活性的第一个多肽(如具有在SEQ ID NO：160或161中所述的氨基酸序列的多肽)作用生成丙烯酰辅酶A，丙烯酰辅酶A与具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的第二个多肽作用形成3-羟基丙酰辅酶A，以及再将3-羟基丙酰辅酶A与具有谷氨酸脱氢酶活性的第三个多肽作用形成3-羟基丙酸。
除非另有定义，在此所用的所有技术和科学术语，其意义与本发明相关领域普通专业技术人员通常理解的意义相同。尽管与在此描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或试验，但最适的方法和材料将在下文中描述。在此提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献以其全文在此引作参考。在有冲突的情况下，以本说明书，包括定义为准。此外，材料、方法和实施例仅为说明性的，并不以其为限。
本发明的其它特点和优点将在下面的详细描述和权利要求中显示出来。
附图描述
图1是生产3-羟基丙酸的途径的简图。
图2是生产聚3-羟基丙酸的途径的简图。
图3是生产3-羟基丙酸酯的途径的简图。
图4是生产聚丙烯酸的途径的简图。
图5是生产丙烯酸酯的途径的简图。
图6是编码具有辅酶A转移酶活性的多肽的核酸序列表(SEQ IDNO：1)。
图7是具有辅酶A转移酶活性的多肽的氨基酸序列表(SEQ IDNO：2)。
图8是SEQ ID NO：1、3、4和5中所述的核酸序列的比对。
图9是SEQ ID NO：2、6、7和8中所述的氨基酸序列的比对。
图10是编码具有E1激活因子活性的多肽的核酸序列表(SEQ IDNO：9)。
图11是具有E1激活因子活性的多肽的氨基酸序列表(SEQ IDNO：10)。
图12是SEQ ID NO：9、11、12和13中所述的核酸序列的比对。
图13是SEQ ID NO：10、14、15和16中所述的氨基酸序列的比对。
图14是编码具有乳酰辅酶A脱水酶活性的酶的E2α亚基的核酸序列表(SEQ ID NO：17)。
图15是具有乳酰辅酶A脱水酶活性的酶的E2α亚基的氨基酸序列表(SEQ ID NO：18)。
图16是SEQ ID NO：17、19、20和21中所述的核酸序列的比对。
图17是SEQ ID NO：18、22、23和24中所述的氨基酸序列的比对。
图18是编码具有乳酰辅酶A脱水酶活性的酶的E2β亚基的核酸序列表(SEQ ID NO：25)。其中第443位的“G”可以是“A”，和第571位的“A”可以是“G”。
图19是具有乳酰辅酶A脱水酶活性的酶的E2β亚基的氨基酸序列表(SEQ ID NO：26)。
图20是SEQ ID NO：25、27、28和29中所述的核酸序列的比对。
图21是SEQ ID NO：26、30、31和32中所述的氨基酸序列的比对。
图22是来自埃氏巨球菌(Megasphaera elsdenii)基因组DNA的核酸序列表(SEQ ID NO：33)。
图23是编码来自于埃氏巨球菌的多肽的核酸序列表(SEQ IDNO：34)。
图24是来自于埃氏巨球菌的多肽的氨基酸序列表(SEQ IDNO：35)。
图25是编码具有酶活性的多肽的核酸序列表(SEQ ID NO：36)。
图26是具有酶活性的多肽的氨基酸序列表(SEQ ID NO：37)。
图27是含有具有辅酶A合成酶、脱水酶和脱氢酶活性的多肽的非编码和编码序列的核酸序列表(SEQ ID NO：38)。编码序列的起始位点位于第480位，核糖体结合位点位于第466-473位，以及终止密码子位于第5946位。
图28是具有辅酶A合成酶、脱水酶和脱氢酶活性的多肽的氨基酸序列表(SEQ ID NO：39)。
图29是编码具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的多肽的核酸序列表(SEQ ID NO：40)。
图30是具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的多肽的氨基酸序列表(SEQ ID NO：41)。
图31是含有具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的多肽的非编码和编码序列的核酸序列表(SEQ ID NO：42)。
图32是SEQ ID NO：40、43、44和45中所述的核酸序列的比对。
图33是SEQ ID NO：41、46、47和48中所述的氨基酸序列的比对。
图34是一个合成的操纵子(pTDH)的构建简图，该操纵子编码具有辅酶A转移酶活性、乳酰辅酶A脱水酶活性(E1、E2α和E2β)和3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性(3-羟基丙酰辅酶A脱水酶)的多肽。
图35A和B是一个合成的操纵子(pHTD)的构建简图，该操纵子编码具有辅酶A转移酶活性、乳酰辅酶A脱水酶活性(E1、E2α和E2β)和3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性(3-羟基丙酰辅酶A脱水酶)的多肽。
图36A和B是一个合成的操纵子(pEIITHrEI)的构建简图，该操纵子编码具有辅酶A转移酶活性、乳酰辅酶A脱水酶活性(E1、E2α和E2β)和3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性(3-羟基丙酰辅酶A脱水酶)的多肽。
图37A和B是一个合成的操纵子(pEIITHEI)的构建简图，该操纵子编码具有辅酶A转移酶活性、乳酰辅酶A脱水酶活性(E1、E2α和E2β)和3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性(3-羟基丙酰辅酶A脱水酶)的多肽。
图38A和B是两个质粒pEIITH和pPROEI的构建简图。质粒pEIITH编码具有辅酶A转移酶活性、乳酰辅酶A脱水酶活性(E2α和E2β)和3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性(3-羟基丙酰辅酶A脱水酶)的多肽，而质粒pPROEI编码具有E1激活因子活性的多肽。
图39是编码具有辅酶A合成酶、脱水酶和脱氢酶活性的多肽的核酸序列表(SEQ ID NO：129)。
图40是SEQ ID NO：39、130和131中所述的氨基酸序列的比对。大写的氨基酸残基表示该位点的氨基酸残基在两个或多个序列中出现。
图41是SEQ ID NO：39、132和133中所述的氨基酸序列的比对。大写的氨基酸残基表示该位点的氨基酸残基在两个或多个序列中出现。
图42是SEQ ID NO：39、134和135中所述的氨基酸序列的比对。大写的氨基酸残基表示该位点的氨基酸残基在两个或多个序列中出现。
图43是使用多功能OS17酶生产有机化合物的几个途径的简图。
图44是通过乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A生产3-羟基丙酸的途径的简图。
图45是pMSD8、pET30a/acc1、pFN476和pET286构建体的简图。
图46包括了辅酶A硫酯的一个完整的离子色谱图和5个质谱图。图A是一个完整的离子色谱图，图解了乙酰辅酶A与4种有机酸辅酶A硫酯的分离：1＝辅酶A，2＝乳酰辅酶A，3＝乙酰辅酶A，4＝丙烯酰辅酶A，5＝丙酰辅酶A。图B是辅酶A的质谱图。图C是乳酰辅酶A的质谱图。图D是乙酰辅酶A的质谱图。图E是丙烯酰辅酶A的质谱图。图F是丙酰辅酶A的质谱图。
图47包括了离子色谱图和质谱图。图A是乳酰辅酶A和3-羟基丙酰辅酶A混合物的完整的离子色谱图。图A插图是在峰1下记录到的质谱图。图B是乳酰辅酶A的完整的离子色谱图。图B插图是在峰2下记录到的质谱图。在每个图中，峰1是3-羟基丙酰辅酶A，峰2是乳酰辅酶A。带有星号标记的峰经证实不是辅酶A的酯。
图48包括了离子色谱图和质谱图。图A是pEIITHrEI转染的大肠杆菌产生的培养液中辅酶A酯的完整的离子色谱图。图A插图是在峰1下记录到的质谱图。图B是未被pEIITHrEI转染的对照大肠杆菌产生的培养液中辅酶A酯的完整的离子色谱图。图B插图是在峰2下记录到的质谱图。在每个图中，峰1是3-羟基丙酰辅酶A，峰2是乳酰辅酶A。带有星号标记的峰经证实不是辅酶A的酯。
图49是编码具有丙二酸单酰辅酶A还原酶活性的多肽的核酸序列表(SEQ ID NO：140)。
图50是具有丙二酸单酰辅酶A还原酶活性的多肽的氨基酸序列表(SEQ ID NO：141)。
图51是编码具有丙二酸单酰辅酶A还原酶活性的多肽的一部分的核酸序列表(SEQ ID NO：142)。
图52是SEQ ID NO：141、143、144、145、146和147中所述的氨基酸序列的比对。
图53是SEQ ID NO：140、148、149、150、151和152中所述的核酸序列的比对。
图54是通过β-丙氨酸中间体生产3-羟基丙酸的一条途径的简图。
图55是通过β-丙氨酸中间体生产3-羟基丙酸的一条途径的简图。
图56是具有β-丙氨酰辅酶A脱氨酶活性的多肽的氨基酸序列表(SEQ ID NO：160)。
图57是一个具有β-丙氨酰辅酶A脱氨酶活性的多肽的氨基酸序列表(SEQ ID NO：161)。
图58是编码具有β-丙氨酰辅酶A脱氨酶活性的多肽的核酸序列表(SEQ ID NO：162)。
图59是能够编码具有β-丙氨酰辅酶A脱氨酶活性的多肽的核酸序列表(SEQ ID NO：163)。
发明详述
I、术语
核酸：此处使用的术语“核酸”既包括RNA，也包括DNA，如cDNA、基因组DNA和合成的(如化学合成的)DNA，但并不以此为限。核酸可以是双链的也可以是单链的。对于单链的核酸可以是有义链也可以是反义链。此外，核酸可以是环状的也可以是线状的。
分离的：此处所用的术语“分离的”对于核酸来说，是指一段自然存在的核酸，其与它在生物体内自然存在的基因组中直接相邻的两段序列(一个在5’端，一个在3’端)不直接相邻。举一个例子，但并不以此为限，分离的核酸可以是一个任意长度的重组DNA分子，条件是在自然存在的基因组中通常发现直接与该重组DNA分子侧接的核酸序列之一被移动或缺失了。因此，分离的核酸包括不依赖于其它序列而独立存在的重组DNA分子(如由PCR或限制性内切酶处理所产生的cDNA或基因组DNA片段)，以及整合进入载体、自我复制质粒、病毒(如逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒)或原核或真核生物基因组DNA的重组DNA，但并不以此为限。此外，分离的核酸还可以是作为一个杂交或融合的核酸序列的一部分的重组DNA分子。
此处所用的术语“分离的”对于核酸来说，还包括了任何非自然存在核酸，因为非自然存在的核酸序列不能在自然界中发现，因而在自然存在的基因组中不具有直接相邻的序列。例如，非自然存在核酸如改建的核酸可被认为是分离的核酸。改建的核酸可以利用普通的分子克隆或核酸化学合成技术来制得。分离的非自然存在核酸可以独立于其它序列，也可以整合到载体、自我复制质粒、病毒(如逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒)或原核或真核生物基因组DNA中。此外，非自然存在核酸还可以是作为一个杂交或融合的核酸序列的一部分的核酸分子。
对于本领域技术人员来说，显然，一个存在于数百到数百万其它核酸分子中的核酸，如在cDNA或基因组文库、或在含有基因组DNA限制性酶消化片段的凝胶切片中的核酸，不应视为分离的核酸。
外源：此处使用的术语“外源”是针对核酸和特定细胞来说的，是指不来源于自然界中所发现的该特定细胞的任何核酸。因此，非自然存在的核酸一旦被导入细胞，就可认为对这种细胞来说是外源的。自然存在的核酸对特定细胞来说也可以是外源的。例如，从某甲细胞中分离的一个完整的染色体一旦被导入某乙的细胞中，对某乙的细胞来说就是一种外源核酸。
杂交：此处使用的术语“杂交”是指一种检验两个核酸分子的核苷酸序列互补性的方法，其基础是互补的单链DNA和/或RNA之间具有形成双链体分子的能力。在本发明的范围之内，核酸杂交技术可用来获得分离的核酸。简单地说，任何与在SEQ ID NO：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162或163中所示的核酸序列具有一定同源性的核酸，都可用作探针，在中度或高度严格的条件下，通过杂交来识别相似的核酸。一旦识别后，该核酸就可以被纯化、测序和分析以确定它是否在上述的本发明的范围之内。
Southern或Northern杂交分析可分别用来鉴定与探针杂交的DNA或RNA序列。探针可以用生物素、地高辛、酶或放射性同位素如32P进行标记。待分析的DNA或RNA可以在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，然后转移到硝酸纤维素、尼龙或其它适合的膜上，再使用本领域所熟知的标准技术与探针进行杂交，如在Sambrook等(1989)第二版《分子克隆》第7.39-7.52节中所描述的技术(Sambrook et al.，(1989)Molecular Cloning，second edition，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，NY.)。通常，探针长度至少大约20个核苷酸。例如，一个对应于SEQ ID NO：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140或142中所示的20个核苷酸序列的探针，可以被用来鉴定一个相同或相似的核酸。此外，长于或短于20个核苷酸的探针也可以使用。
本发明还提供了长度为至少大约12个碱基(如至少大约13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、4000或5000个碱基长)并在杂交条件下与具有SEQ ID NO：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162或163所示序列核酸的有义链或反义链进行杂交的分离的核酸序列。杂交条件可以是中度或高度严格的杂交条件。
对于本发明来说，中度严格杂交条件意味着杂交在大约42℃进行，杂交液含25mM KPO4(pH7.4)、5X SSC、5X Denhart氏溶液、50μg/mL变性并超声过的鲑鱼精子DNA、50％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖以及1-15ng/mL探针(大约5×107cpm/μg)；而洗脱在大约50℃进行，洗脱液含有2X SSC和0.1％十二烷基硫酸钠。
高度严格杂交条件意味着杂交在大约42℃进行，杂交液含25mMKPO4(pH7.4)、5X SSC、5X Denhart氏溶液、50μg/mL变性并超声过的鲑鱼精子DNA、50％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖以及1-15ng/mL探针(大约5×107cpm/μg)；而洗脱在大约65℃进行，洗脱液含有0.2X SSC和0.1％十二烷基硫酸钠。
纯化的：此处使用的术语“纯化的”并不需要绝对的纯度，它更倾向于是一个相对的术语。因此，例如，一个纯化的多肽或核酸制剂可以是指，其中目的多肽或核酸的浓度分别比在生物体内自然环境中该多肽或核酸的浓度更高。例如，在一个多肽制剂中，如果该多肽的含量占该制剂中总蛋白含量的至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、98％或99％，则该多肽制剂可以被认为是纯化的。
转化的：一个“转化的”细胞是指其中已通过例如分子生物学技术导入了核酸分子的细胞。此处使用的术语“转化”涵盖了所有能将核酸分子导入细胞的技术，包括用病毒载体转染、接合、用质粒载体转化以及通过电穿孔、脂转染和微粒枪加速等方法导入裸DNA的方法，但并不以此为限。
重组的：一个“重组的”核酸是指一个具有(1)在其表达的生物体中不是自然存在的序列，或具有(2)将两个独立的、较短的序列通过人工组合而获得的序列的核酸。这种人工组合通常是通过化学合成，或更普遍地，通过对分离的核酸片段进行人工操作，例如采用遗传工程技术，来实现的。“重组”也被用于描述那些已经过人工操作的核酸分子，但它们中仍然含有与其被分离的生物体中所发现的相同的调节序列和编码区。
特异性结合因子：“特异性结合因子”是指能够特异性结合到任何在此描述的多肽上的因子，可以包括多克隆抗体、单克隆抗体(包括人源化单克隆抗体)和单克隆抗体的片段如Fab、F(ab’)2和Fv片段，以及任何能够特异性结合到这些多肽表位上的因子。
此处提供的多肽的抗体(或其片段)可用于纯化或鉴定这些多肽。此处提供的氨基酸和核酸序列使生产能够识别此处所述多肽的基于特异抗体的结合因子成为可能。
可以针对多肽、多肽的部分或其变体生产单克隆或多克隆抗体。在最佳的情况下，针对多肽抗原的一个或多个表位所产生的抗体将能够特异性检测该多肽。也就是说，针对一个特定多肽产生的抗体将识别和结合该特定多肽，而基本上不会识别和结合其它多肽。抗体特异性结合到特定多肽，可以通过任何一种标准的免疫分析方法进行确定，如Western印迹的方法(参见如Sambrook等编，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。
为了能够通过Western印迹确定一个给定的抗体制剂(如一种老鼠针对具有SEQ ID NO：2中所述氨基酸序列的多肽而产生的抗体制剂)特异性检测适当的多肽(如具有SEQ ID NO：2中所述氨基酸序列的多肽)，可以从细胞中提取总细胞蛋白，然后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。接着将分离的总细胞蛋白转移到膜(如硝酸纤维素)上，并将抗体制剂与膜共温育。在冲洗膜以除去非特异性结合的抗体后，可以利用结合有酶如碱性磷酸酶的适当的第二抗体(例如抗小鼠抗体)来检测特异性结合的抗体的存在，因为加入了5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮蓝四唑后，导致免疫定位的碱性磷酸酶产生深兰色的化合物。
适合用作免疫原的基本纯的多肽可以从转染的细胞、转化的细胞或野生型细胞中获得。最终制剂中的多肽的浓度，可以如通过使用Amicon过滤器装置浓缩等方式调整到每毫升几个微克的水平。此外，长度范围从全长到少至9个氨基酸残基的多肽都可用作免疫原。这些多肽可以从细胞培养液中生产，也可以使用标准方法进行化学合成，还可以通过将大的多肽切割为可以纯化的较小的多肽而获得。短到仅有9个氨基酸残基的多肽，当呈递到含有主要组织相容性复合物(MHC)分子如I类MHC和II类MHC分子的免疫系统中时，可以具有免疫原性。因此，含有任何本发明所述的氨基酸序列中的至少9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、900、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350或更多连续氨基酸残基的多肽，都可以用作生产抗体的免疫原。
针对任何本发明公开的多肽的单克隆抗体都可以按照Kohler&Milstein的经典方法(Nature 256：495(1975))或其衍生的方法，从鼠杂交瘤制备。
含有针对任何本发明公开的多肽的异源表位的抗体的多克隆抗血清，可以通过用多肽(或其片段)免疫适当的动物而制备，所述多肽可以是未修饰的，也可以通过修饰以增强免疫原性。一种用于兔的有效的免疫方案可在Vaitukaitis等的论文中发现(J.Clin.Endocrinol.Metab.33：988-991(1971))。
抗体片段可以用来代替完整的抗体，并且可以容易地在原核宿主细胞中表达。制造和使用单克隆抗体有免疫效应的部分(也被称做“抗体片段”)的方法已为人熟知，并包括在下列文献及其引用的文献中：Better & Horowitz(Methods Enzymol.178：476-496(1989))，Glockshuber等(Biochemistry29：1362-1367(1990))；美国专利5,648,237(“功能性抗体片段的表达”)；美国专利4,946,778 (“单链多肽结合分子”)；美国专利5,455,030(“使用单链多肽结合分子的免疫治疗”)。
可操作连接：只要第一个核酸序列与第二个核酸序列有功能上的关系，第一个核酸序列与第二个核酸序列就是“可操作连接”的。例如，一个启动子当其影响到一个编码序列的转录时，与该编码序列是可操作连接的。一般来说，可操作连接的DNA序列是紧邻的，并且在连接两个多肽编码区的必需区域，是在同一个阅读框内。
探针和引物：根据本发明提供的氨基酸和核酸序列，可以很容易地制备核酸探针和引物。“探针”是指一个带有可检测标记或报告分子的分离的核酸。典型的标记包括放射性同位素、配体、化学发光试剂和酶。关于标记的方法以及如何选择标记以适应不同目的的指南在下列文献中讨论：诸如《分子克隆：实验室手册》(Sambrook等编，Molecular Cloning：A Laboratory Manual第二版，1-3卷，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)和《精编现代分子生物学实验手册》(Ausubel等编，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(withperiodic updates)，1987)。
“引物”通常是具有10个或更多个核苷酸的核酸分子(例如具有约10到100个核苷酸之间的核酸分子)。引物可以通过核酸杂交与一个互补的靶核酸链退火，从而在引物和靶核酸链间形成杂合体，然后利用诸如DNA聚合酶的作用沿着靶核酸链延伸。通过例如聚合酶链式反应(PCR)或其它本领域已知的核酸扩增方法，可以使用引物对来扩增核酸序列。
制备及使用探针和引物的方法在许多参考文献中有描述，例如《分子克隆：实验室手册》(Sambrook等编，Molecular Cloning：A LaboratoryManual第二版，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，1989)、《精编现代分子生物学实验手册》(Ausubel等编，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing andWiley-Interscience，New York(with periodic updates)，1987))和《PCR方法与应用指南》(Innis等，PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications，Academic press：San Diego，1990)。PCR引物对可以从已知序列衍生而得，例如通过使用为此目的而编写的计算机程序，如Primer(Version 0.5，COPYRGT.1991，Whitehead Institute forBiomedical Research，Cambridge，Mass.)。特定的探针或引物的特异性随着长度而增加，这一特性为本领域技术人员所认同，但是探针或引物的长度范围可以从全长的序列到短至5个连续的核苷酸。因此，例如一个20个连续的核苷酸长的引物与靶退火的特异性，要比相应的一个仅有15个连续的核苷酸长的引物高。因此，为了获得较高的特异性，可以选择各种长度的探针或引物，包括例如10、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400、3450、3500、3550、3600、3650、3700、3750、3800、3850、3900、4000、4050、4100、4150、4200、4250、4300、4350、4400、4450、4500、4550、4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、5000、5050、5100、5150、5200、5250、5300、5350、5400、5450或更长的连续的核苷酸。
序列同一性百分数：一个特定的核酸或氨基酸序列与一个特定序列识别号所注明的序列之间的“序列同一性百分数”按照如下方法确定。首先，使用BLAST 2 Sequences(B12seq)程序将一核酸或氨基酸序列与一个特定序列识别号所述的序列进行比较，此程序来自于BLASTZ单机版，含有BLASTN 2.0.14版和BLASTP 2.0.14版。此单机版BLASTZ可以从Fish & Richardson网站(www.fr.com)或美国政府的国家生物技术信息中心网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)获得。解释如何使用B12seq程序的说明书可在随同BLASTZ的自述文件中找到。B12seq使用BLASTN或BLASTP算法在两个序列间进行比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。当比较两个核酸序列时，选项设置如下：-i设置为含有所比较的第一个核酸序列的文件(例如C：\seq1.txt)；-j设置为含有所比较的第二个核酸序列的文件(例如C：\seq2.txt)；-p设置为blastn；-o设置为任何所期望的文件名(例如C：\output.txt)；-q设置为-1；-r设置为2；以及所有其它选项保留为默认设置。例如，下列命令可用来产生一个包含了两个序列间比较的输出文件：C：\B12seq-i c：\seq1.txt-j c：\seq2.txt-pblastn-o c：\output.txt。如果所比较的两个序列具有同源性，则指定的输出文件中那些同源的区域将以比对的序列形式出现。如果所比较的两个序列不具有同源性，则指定的输出文件中将不出现比对的序列。
一旦比对后，通过计算在两个序列中出现相同核苷酸或氨基酸残基的位点的数目，可以确定匹配数。用匹配数除以被比较的序列(如SEQ ID NO：1)中所述序列的长度，或除以节段的长度(如被比较序列中所述序列内的100个连续的核苷酸或氨基酸残基)，再将所得到的数值乘以100，就得到序列同一性百分数。例如，一条核酸序列，当与SEQ ID NO：1中所述序列进行比对后，匹配数为1166，则该序列与SEQ ID NO：1中所述序列的序列同一性百分数为75.0％(即1166÷1554×100＝75.0)。需要注意的是，序列同一性百分数的值四舍五入到小数点后一位，例如，75.11、75.12、75.13和75.14舍到75.1，而75.15、75.16、75.17、75.18和75.19则入到75.2。还需要注意长度的数值总是整数。举另一个例子，一个靶序列，其中含有一个20个核苷酸长的区域，该区域与如下的被比较序列中的20个连续的核苷酸进行了比对，两者的序列同一性为75％(即15÷20×100＝75)。
              1                 20
靶序列：      AGGTCGTGTACTGTCAGTCA
              | || ||| |||| |||| |
被识别序列：  ACGTGGTGAACTGCCAGTGA
保守替代：在此所用的术语“保守替代”是指任何列于表1中的氨基酸替代。一般来说，保守替代对多肽的活性仅有一点或没有影响。使用标准程序，例如定点诱变或PCR等，对编码一条多肽的核苷酸序列进行操作，可以产生含有一个或多个保守替代的多肽。
表1
原始残基 保守替代
丙氨酸 丝氨酸
精氨酸 赖氨酸
天冬酰胺 谷氨酰胺；组氨酸
天冬氨酸 谷氨酸
半胱氨酸 丝氨酸
谷氨酰胺 天冬酰胺
谷氨酸 天冬氨酸
甘氨酸 脯氨酸
组氨酸 天冬酰胺；谷氨酰胺
异亮氨酸 亮氨酸；缬氨酸
亮氨酸 异亮氨酸；缬氨酸
赖氨酸 精氨酸；谷氨酰胺；谷氨酸
甲硫氨酸 亮氨酸；异亮氨酸
苯丙氨酸 甲硫氨酸；亮氨酸；酪氨酸
丝氨酸 苏氨酸
苏氨酸 丝氨酸
色氨酸 酪氨酸
酪氨酸 色氨酸；苯丙氨酸
缬氨酸 异亮氨酸；亮氨酸
II、代谢途径
本发明提供了与生产3-羟基丙酸及其它有机化合物(如1，3-丙二醇、丙烯酸、聚丙烯酸、丙烯酸酯、聚3-羟基丙酸和3-羟基丙酸酯)相关的方法和材料。具体地说，本发明提供了用于生产3-羟基丙酸及其它有机化合物，如1，3-丙二醇、丙烯酸、聚丙烯酸、丙烯酸酯、聚3-羟基丙酸、3-羟基丙酸酯等的分离的核酸分子、多肽、宿主细胞、方法和材料。
因此，本发明提供了几条代谢途径可用于从磷酸烯醇式丙酮酸生产有机化合物(图1-5、43-44、54和55)。如图1所示，乳酸可以被一种具有辅酶A转移酶(EC2.8.3.1)活性的多肽转化为乳酰辅酶A；产生的乳酰辅酶A可以被一种具有乳酰辅酶A脱水酶(EC4.2.1.54)活性的多肽(或多种多肽复合物如活化的E2α和E2β复合物)转化为丙烯酰辅酶A；产生的丙烯酰辅酶A可以被一种具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶(EC4.2.1.-)活性的多肽转化为3-羟基丙酰辅酶A(3-HP-COA)；以及产生的3-羟基丙酰辅酶A可以被一种具有辅酶A转移酶活性的多肽、一个具有3-羟基丙酰辅酶A水解酶(EC3.1.2.-)活性的多肽或一个具有3-羟基异丁酰辅酶A水解酶(EC3.1.2.4)活性的多肽转化为3-羟基丙酸。
具有辅酶A转移酶活性的多肽以及编码这些多肽的核酸可以从各种物种中获得，包括埃氏巨球菌、丙酸梭菌(Clostridium propionicum)、克氏梭菌(Clostridium kluyveri)和大肠杆菌(Escherichia coli)，但并不以此为限。例如在实施例1中描述的那样，编码具有辅酶A转移酶活性多肽的核酸可以从埃氏巨球菌中获得，并且其序列可以如SEQ IDNO：1所示。此外，具有辅酶A转移酶活性的多肽以及编码这些多肽的核酸还可以通过在此描述的方法获得。例如本发明提供的SEQ IDNO：1的变体可用于编码具有辅酶A转移酶活性的多肽。
具有乳酰辅酶A脱水酶活性的多肽(或多种多肽复合物如活化的E2α和E2β复合物的多肽)以及编码这些多肽的核酸可以从各种物种中获得，包括埃氏巨球菌和丙酸梭菌，但并不以此为限。例如在实施例2中描述的那样，编码具有乳酰辅酶A脱水酶活性的、由E1激活因子、E2α亚基和E2β亚基形成的多种多肽复合物的核酸可以从埃氏巨球菌中获得。编码E1激活因子的核酸可以含有如SEQ ID NO：9所示的序列；编码E2α亚基的核酸可以含有如SEQ ID NO：17所示的序列；以及编码E2β亚基的核酸可以含有如SEQ ID NO：25所示的序列。此外，具有乳酰辅酶A脱水酶活性的多肽(或多种多肽复合物的多肽)以及编码这些多肽的核酸可以通过在此描述的方法获得。例如本发明提供的SEQ ID NO：9、17和25的变体可用于编码具有乳酰辅酶A脱水酶活性的多种多肽复合物的多肽。
具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的多肽以及编码这些多肽的核酸可以从各种物种中获得，包括橙色绿屈挠菌(Chloroflexusaurantiacus)、皱摺假丝酵母(Candida rugosa)、深红螺菌(Rhodosprilliumrubrum)和荚膜红细菌(Rhodobacter capsulates)，但并不以此为限。例如在实施例3中描述的那样，编码具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性多肽的核酸可以从橙色绿屈挠菌中获得，其序列可以如SEQ IDNO：40所示。此外，具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的多肽以及编码这些多肽的核酸还可以通过在此描述的方法获得。例如本发明提供的SEQ ID NO：40的变体可用于编码具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的多肽。
具有3-羟基丙酰辅酶A水解酶活性的多肽以及编码这些多肽的核酸可以从各种物种中获得，包括皱摺假丝酵母(Candida rugosa)，但并不以此为限。具有3-羟基异丁酰辅酶A水解酶活性的多肽以及编码这些多肽的核酸可以从各种物种中获得，包括荧光假单胞菌(Psedomonas fluorescens)、大鼠(rattus)和智人(Homo sapiens)，但并不以此为限。例如，编码具有3-羟基异丁酰辅酶A水解酶活性多肽的核酸可以从智人中获得，并可以具有如GenBank_注册号U66669所示的序列。
在此所用的术语“具有酶活性的多肽”是指能催化其它物质进行某一化学反应的任何多肽，到反应完成时其自身并不被破坏或改变。通常一个具有酶活性的多肽催化一种或多种底物反应形成一种或多种产物。这些多肽可以具有任何种类的酶活性，包括与诸如脱水酶/水合酶、3-羟基丙酰辅酶A脱水酶/水合酶、辅酶A转移酶、乳酰辅酶A脱水酶、3-羟基丙酰辅酶A水解酶、3-羟基异丁酰辅酶A水解酶、聚羟酸合酶、辅酶A合成酶、丙二酸单酰辅酶A还原酶、β-丙氨酸脱氨酶和脂肪酶等酶的酶活性或与这些酶相关的酶活性，但并不以此为限。
如图2所示，乳酸可以被一种具有辅酶A合成酶(EC6.2.1.-)活性的多肽转化为乳酰辅酶A；产生的乳酰辅酶A可以被一种具有乳酰辅酶A脱水酶活性的多肽(或多种多肽复合物)转化为丙烯酰辅酶A；产生的丙烯酰辅酶A可以被一种具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的多肽转化为3-羟基丙酰辅酶A；以及产生的3-羟基丙酰辅酶A可以被一种具有聚羟酸合酶(EC2.3.1.-)活性的多肽转化为聚3-羟基丙酸。具有辅酶A合成酶活性的多肽以及编码这些多肽的核酸可以从各种物种中获得，包括大肠杆菌、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、啤酒酵母(Saccharomyces cervisiae)和肠沙门氏菌(Salmonellaenterica)，但并不以此为限。例如，编码具有辅酶A合成酶活性多肽的核酸可以从大肠杆菌中获得，并可以具有如GenBank_注册号U00006所示的序列。具有乳酰辅酶A脱水酶活性的多肽(或多种多肽复合物)以及编码这些多肽的核酸还可以通过在此描述的方法获得。具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的多肽以及编码这些多肽的核酸还可以通过在此描述的方法获得。具有聚羟酸合酶活性的多肽以及编码这些多肽的核酸可以从各种物种中获得，包括类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)、食酸丛毛单胞菌(Comamonas acidororans)、真养产碱杆菌(Ralstonia eutropha)和食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)，但并不以此为限。例如，编码具有聚羟酸合酶活性多肽的核酸可以从类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)中获得，并可以具有如GenBank_注册号X97200所示的序列。
如图3所示，乳酸可以被一种具有辅酶A转移酶活性的多肽转化为乳酰辅酶A；产生的乳酰辅酶A可以被一种具有乳酰辅酶A脱水酶活性的多肽(或多种多肽复合物)转化为丙烯酰辅酶A；产生的丙烯酰辅酶A可以被一种具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的多肽转化为3-羟基丙酰辅酶A；产生的3-羟基丙酰辅酶A可以被一种具有辅酶A转移酶活性的多肽、一个具有3-羟基丙酰辅酶A水解酶活性的多肽或一个具有3-羟基异丁酰辅酶A水解酶活性的多肽转化为3-羟基丙酸；以及产生的3-羟基丙酸可以被一种具有脂肪酶(EC3.1.1.-)活性的多肽转化为3-羟基丙酸酯。具有脂肪酶活性的多肽以及编码这些多肽的核酸可以从各种物种中获得，包括皱摺假丝酵母(Candidarugosa)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)和白色假丝酵母(Candidaalbicans)，但并不以此为限。例如，编码具有脂肪酶活性多肽的核酸可以从皱摺假丝酵母(Candida rugosa)中获得，并可以具有如GenBank_注册号A81171所示的序列。
如图4所示，乳酸可以被一种具有辅酶A合成酶活性的多肽转化为乳酰辅酶A；产生的乳酰辅酶A可以被一种具有乳酰辅酶A脱水酶活性的多肽(或多种多肽复合物)转化为丙烯酰辅酶A；以及产生的丙烯酰辅酶A可以被一种具有聚羟酸合酶活性的多肽转化为聚丙烯酸。
如图5所示，乳酸可以被一种具有辅酶A转移酶活性的多肽转化为乳酰辅酶A；产生的乳酰辅酶A可以被一种具有乳酰辅酶A脱水酶活性的多肽(或多种多肽复合物)转化为丙烯酰辅酶A；产生的丙烯酰辅酶A可以被一种具有辅酶A转移酶活性的多肽转化为丙烯酸；以及产生的丙烯酸可以被一种具有脂肪酶活性的多肽转化为丙烯酸酯。
如图44所示，乙酰辅酶A可以被一种具有乙酰辅酶A羧化酶活性的多肽转化为丙二酸单酰辅酶A；以及产生的丙二酸单酰辅酶A可以被一种具有丙二酸单酰辅酶A还原酶活性的多肽转化为3-羟基丙酸。具有乙酰辅酶A羧化酶活性的多肽以及编码这些多肽的核酸可以从各种物种中获得，包括大肠杆菌和橙色绿屈挠菌，但并不以此为限。例如，编码具有乙酰辅酶A羧化酶活性多肽的核酸可以从大肠杆菌中获得，并可以具有如GenBank_注册号M96394或U18997所示的序列。具有丙二酸单酰辅酶A还原酶活性的多肽以及编码这些多肽的核酸可以从各种物种中获得，包括橙色绿屈挠菌、金属硫化叶菌(Sulfolobusmetacillus)和布氏酸菌(Acidianus brierleyi)，但并不以此为限。例如，编码具有丙二酸单酰辅酶A还原酶活性多肽的核酸可以如在此描述的那样获得，其序列可以与SEQ ID NO：140所示的序列相似。此外，具有丙二酸单酰辅酶A还原酶活性的多肽以及编码这些多肽的核酸还可以通过在此描述的方法获得。例如本发明提供的SEQ ID NO：140的变体可用于编码具有丙二酸单酰辅酶A还原酶活性的多肽。
具有丙二酸单酰辅酶A还原酶活性的多肽可以利用NADPH作为辅酶。例如，具有SEQ ID NO：141所示的氨基酸序列的多肽具有丙二酸单酰辅酶A还原酶活性，在将丙二酸单酰辅酶A转化为3-羟基丙酸时利用NADPH作为辅酶。同样，具有丙二酸单酰辅酶A还原酶活性的多肽还可以利用NADH作为辅酶。具有丙二酸单酰辅酶A还原酶活性并利用NADPH作为辅酶的多肽可以转化为具有丙二酸单酰辅酶A还原酶活性并利用NADH作为辅酶的多肽。下列文献中的任何一种方法都可用来将以NADPH为辅酶的多肽转化为以NADH为辅酶的多肽：Eppink等，J.Mol.Biol.，292(1)：87-96(1999)，Hall和Tomsett，Microbiology，146(Pt 6)：1399-1406(2000)和Dohr等，Proc.Natl.Acad.Sci.，98(1)：81-86(2001)。例如，诱变可用于将SEQ ID NO：140所示的核酸序列编码的多肽转变成另一种多肽，当将丙二酸单酰辅酶A转化为3-羟基丙酸时，其利用NADH而不是NADPH为辅酶。
如图43所示，丙酸可以被一种具有辅酶A合成酶活性的多肽，如具有SEQ ID NO：39所示序列的多肽，转化为丙酰辅酶A；产生的丙酰辅酶A可以被一种具有脱氢酶活性的多肽，如具有SEQ ID NO：39所示序列的多肽，转化为丙烯酰辅酶A；以及产生的丙烯酰辅酶A可以有以下几种转化途径：1)被一种具有辅酶A转移酶活性或辅酶A水解酶活性的多肽转化为丙烯酸；2)被一种具有3-羟基丙酸脱水酶活性(也称为丙烯酰辅酶A水合酶或简称水合酶)的多肽，如具有SEQID NO：39所示序列的多肽，转化为3-羟基丙酰辅酶A；或3)被具有聚羟酸合酶活性的多肽转化为聚丙烯酸。产生的丙烯酸可以被一种具有脂肪酶活性的多肽转化为丙烯酸酯。产生的3-羟基丙酰辅酶A可以有两条转化途径：1)被一种具有辅酶A转移酶活性的多肽、一种具有3-羟基丙酰辅酶A水解酶(EC3.1.2.-)活性的多肽或一种具有3-羟基异丁酰辅酶A水解酶(EC3.1.2.4)活性的多肽转化为3-羟基丙酸；或2)被一种具有聚羟酸合酶(EC2.3.1.-)活性的多肽转化为聚3-羟基丙酸。
如图54所示，磷酸烯醇式丙酮酸可以被转化为β-丙氨酸。β-丙氨酸可以通过使用具有辅酶A转移酶活性的多肽转化为β-丙氨酰辅酶A。然后β-丙氨酰辅酶A可以通过使用具有β-丙氨酰辅酶A脱氨酶活性的多肽转化为丙烯酰辅酶A。丙烯酰辅酶A可再通过使用具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的多肽转化为3-羟基丙酰辅酶A；以及3-羟基丙酰辅酶A可以被一种具有谷氨酸脱氢酶活性的多肽转化为3-羟基丙酸。
如图55所示，可以按下述途径从β-丙氨酸制备3-羟基丙酸：首先将β-丙氨酸与具有4，4-氨基丁酸氨基转移酶活性的多肽作用产生丙二酸半醛。丙二酸半醛可以被一种具有3-羟基丙酸脱氢酶活性的多肽或一种具有3-羟基异丁酸脱氢酶活性的多肽转化为3-羟基丙酸。
III、核酸分子和多肽
本发明提供了分离的核酸，其含有SEQ ID NO：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162或163所示的完整的核酸序列。此外，本发明还提供了分离的核酸，其含有SEQ ID NO：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162或163所示的核酸序列的一部分。例如，本发明提供了分离的核酸，其含有的一段15个核苷酸的序列与SEQ ID NO：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162或163所示的核酸序列中任意15个核苷酸序列相同，包括起始于第一个核苷酸终止于第十五个核苷酸、起始于第二个核苷酸终止于第十六个核苷酸、起始于第三个核苷酸终止于第十七个核苷酸的序列等，但并不以此为限。人们会意识到，本发明还提供了分离的核酸，其含有长度大于15个核苷酸(如16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多的核苷酸)的核苷酸序列，并且该序列与SEQ ID NO：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162或163所示序列中任何部分的核苷酸序列相同。例如，本发明提供了分离的核酸，其含有的一段25个核苷酸的序列与SEQ ID NO：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162或163所示序列的任意25个核苷酸序列相同，包括起始于第一个核苷酸终止于第二十五个核苷酸、起始于第二个核苷酸终止于第二十六个核苷酸、起始于第三个核苷酸终止于第二十七个核苷酸的序列等，但并不以此为限。其它例子包括分离的核酸，它们含有长度为50或更多个核苷酸(如100、150、200、250、300或更多的核苷酸)的核苷酸序列，并且该序列与SEQ ID NO：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162或163所示序列中任何部分的核苷酸序列相同。这样的分离核酸可包括了那些含有图6、10、14、18、22、23、25、27、29、31、39、49或51中描述的每一行核酸序列所示的分离的核酸，因为这些图中描述的每一行序列，除了最后一行可能有例外之外，都提供了含有至少50个碱基的核苷酸序列。
此外，本发明还提供了分离的核酸，其含有SEQ ID NO：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162或163所示的核酸序列的变体。例如，本发明提供了被分离的核酸，其含有SEQ IDNO：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162或163所示的核酸序列，但是其中发生了单一插入、单一缺失、单一取代、多重插入、多重缺失、多重取代或其任何组合(如单一缺失伴随多重插入)。这些分离的核酸分子与SEQ ID NO：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162或163所示的核酸序列相比，具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性。
本发明提供了多个分离核酸的例子，所述分离核酸含有SEQ IDNO：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162或163所示的核酸序列的变体。例如，图8提供了SEQ ID NO：1所示的序列与其它3个核酸序列的比对。SEQ ID NO：1所示的序列的变体的例子包括但不限于图8提供的对SEQ ID NO：1所示序列的任何变体。图8提供了这样的变体，其中将在SEQ ID NO：1所示序列特定位点的核苷酸(或其缺失)与图8描述的其它3个核酸序列中任意一个在同样的比对位置的核苷酸(或其缺失)进行比较提供SEQ ID NO：1所示序列的特定变化表。例如图8所示，SEQ ID NO：1第49位的“a”可以被“c”取代。另如图8所示，SEQ ID NO：1第590位的“a”可以被“atgg”取代；“aaac”可以插入到SEQ ID NO：1第393位的“g”之前；或SEQ ID NO：1第736位的“gaa”可以缺失。人们会意识到SEQID NO：1所示的序列可以含有任何数量的变体以及变体类型的任何组合。例如，SEQ ID NO：1所示的序列可以含有图8所示的一个变体或一个以上(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100或更多)的变体。应该注意到图8提供的核酸序列可以编码具有辅酶A转移酶活性的多肽。本发明还提供了分离的核酸，其含有SEQ IDNO：1所示序列的部分的变体，如图8所示及在此描述的那样。
同样，图12提供了SEQ ID NO：9及其部分的变体；图16提供了SEQ ID NO：17及其部分的变体；图20提供了SEQ ID NO：25及其部分的变体；图32提供了SEQ ID NO：40及其部分的变体；以及图53提供了SEQ ID NO：140的变体。
本发明提供了分离的核酸，其含有编码SEQ ID NO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161所示的完整的氨基酸序列的核酸序列。此外，本发明还提供了分离的核酸，其含有编码SEQ ID NO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161所示的氨基酸序列的部分的核酸序列。例如，本发明提供了分离的核酸，其含有一段编码15个氨基酸序列的核酸序列，该段氨基酸序列与SEQ ID NO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161所示的氨基酸序列中任意15个氨基酸序列相同，包括起始于第1个氨基酸残基终止于第15个氨基酸残基、起始于第2个氨基酸残基终止于第16个氨基酸残基、起始于第3个氨基酸残基终止于第17个氨基酸残基的序列等，但并不以此为限。人们会意识到，本发明还提供了分离的核酸，其含有编码长度大于15个氨基酸残基(如16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多的氨基酸残基)的氨基酸序列的核酸序列，并且该氨基酸序列与SEQ ID NO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161所示的氨基酸序列中任意部分的氨基酸序列相同。例如，本发明提供了分离的核酸，其含有一段编码25个氨基酸残基编码的核酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161所示的氨基酸序列中的任意25个氨基酸序列相同，包括起始于第1个氨基酸残基终止于第25个氨基酸残基、起始于第2个氨基酸残基终止于第26个氨基酸残基、起始于第3个氨基酸残基终止于第27个氨基酸残基的序列等，但并不以此为限。其它例子包括但不限于分离的核酸，它们含有编码长度为50或更多个氨基酸残基(如100、150、200、250、300或更多的氨基酸残基)的氨基酸序列的核酸序列，并且该氨基酸序列与SEQ ID NO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161所示的氨基酸序列中的任意部分序列相同。这样的分离核酸可包括但不限于那些分离的核酸，它们含有编码图7、11、15、19、24、26、28、30或50中描述的每一行序列所示的氨基酸序列的核酸序列，因为这些图中描述的每一行序列，除了最后一行可能有例外之外，都提供了含有至少50个残基的氨基酸序列。
此外，本发明还提供了分离的核酸，其含有编码具有SEQ IDNO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161所示的氨基酸序列的变体的氨基酸序列的核酸序列。例如，本发明提供了分离的核酸，其含有一段核酸序列编码SEQ ID NO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161所示的氨基酸序列，但是这些氨基酸序列发生了单一插入、单一缺失、单一取代、多重插入、多重缺失、多重取代或其任何组合(如单一缺失伴随多重插入)。这些分离的核酸分子可含有一段核酸序列，其编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161所示的氨基酸序列相比，具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性。
本发明提供了多个分离核酸的例子，它们含有编码SEQ IDNO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161所示的氨基酸序列的变体的氨基酸序列的核酸序列。例如，图9提供了SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列与其它3个氨基酸序列的比对。SEQ ID NO：2所示序列的变体的例子包括但不限于图9提供的对SEQ ID NO：2所示序列的任何变体。图9提供了这样的变体，其中将在SEQ ID NO：2所示序列特定位点的氨基酸残基(或其缺失)与图9描述的其它3个氨基酸序列(即SEQ ID NO：6、7和8)中任意一个在同样的比对位置的氨基酸(或其缺失)进行比较提供SEQ ID NO：2所示序列的特定变化表。例如图9所示，SEQ ID NO：2第17位的“k”可以被“p”或“h”取代。另如图9所示，SEQ ID NO：2第125位的“v”可以被“i”或“f”取代。人们会意识到SEQ ID NO：2所示的序列可以含有任何数量的变体以及变体类型的任何组合。例如，SEQ ID NO：2所示的序列可以含有图9所示的一个变体或一个以上(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100或更多)的变体。应该注意到图9提供的氨基酸序列可以是具有辅酶A转移酶活性的多肽。
本发明还提供了分离的核酸，其所含的核酸序列编码的氨基酸序列含有SEQ ID NO：2所示序列部分的变体，如图9所示及在此描述的那样。
同样，图13提供了SEQ ID NO：10及其部分的变体；图17提供了SEQ ID NO：18及其部分的变体；图21提供了SEQ ID NO：26及其部分的变体；图33提供了SEQ ID NO：41及其部分的变体；图40、41和42提供了SEQ ID NO：39的变体；以及图52提供了SEQ ID NO：141及其部分的变体。
已经注意到，一个特定物种的密码子偏好性和密码子使用表可用于改造分离的核酸分子，以利用该特定物种的密码子偏好性。例如在此提供的分离的核酸可以设计成具有由特定的目的生物体偏好所使用的密码子。
本发明也提供了分离的核酸，其至少12个碱基长(如至少约13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、4000或5000个碱基长)，并且在杂交条件下，可以与具有SEQ ID NO：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162或163所示序列的核酸的有义或反义链杂交。杂交条件可以是中度或高度严格的杂交条件。
本发明提供了含有SEQ ID NO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161所示的完整的氨基酸序列的多肽。此外，本发明还提供了含有SEQ ID NO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161所示的氨基酸序列的部分的多肽。例如，本发明提供了多肽，其中含有一段15个氨基酸的序列，该段氨基酸序列与SEQ ID NO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161所示的氨基酸序列中的任何15个氨基酸序列相同，包括起始于第1个氨基酸残基终止于第15个氨基酸残基、起始于第2个氨基酸残基终止于第16个氨基酸残基、起始于第3个氨基酸残基终止于第17个氨基酸残基的序列等，但并不以此为限。人们会意识到，本发明还提供了多肽，它们含有长度大于15个氨基酸残基(如16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多的氨基酸残基)的氨基酸序列，并且该氨基酸序列与SEQ ID NO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161所示的氨基酸序列中的任何部分相同。例如，本发明提供了含有一段25个氨基酸残基的序列的多肽，该氨基酸序列与SEQ IDNO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161所示的氨基酸序列中的任何25个氨基酸序列相同，包括起始于第1个氨基酸残基终止于第25个氨基酸残基、起始于第2个氨基酸残基终止于第26个氨基酸残基、起始于第3个氨基酸残基终止于第27个氨基酸残基的序列等，但并不以此为限。其它例子包括但不限于含有长度为50或更多个氨基酸残基(如100、150、200、250、300或更多的氨基酸残基)的氨基酸序列的多肽，并且该氨基酸序列与SEQ ID NO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161所示的氨基酸序列中的任何部分序列相同。这样的多肽包括但不限于那些含有图7、11、15、19、24、26、28、30或50中描述的每一行序列所示的多肽，因为这些图中描述的每一行序列，除了最后一行可能有例外之外，都提供了含有至少50个残基的氨基酸序列。
此外，本发明还提供了多肽，其氨基酸序列是SEQ ID NO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161所示氨基酸序列的变体。例如，本发明提供了多肽，它们含有一段SEQ ID NO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161所示的氨基酸序列，但是这些氨基酸序列发生了单一插入、单一缺失、单一取代、多重插入、多重缺失、多重取代其任何组合(如单一缺失伴随多重插入)。这些多肽所含的氨基酸序列与SEQ ID NO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161所示的氨基酸序列相比，具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性。
本发明提供了多个多肽的例子，其氨基酸序列是SEQ ID NO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161所示氨基酸序列的变体。例如，图9提供了SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列与其它3个氨基酸序列的比对。SEQ ID NO：2所示序列的变体的例子包括但不限于图9提供的对SEQ ID NO：2所示序列的任何变体。图9提供了这样的变体，其中将在SEQ ID NO：2所示序列特定位点的氨基酸残基(或其缺失)与图9描述的其它3个氨基酸序列(即SEQ ID NO：6、7和8)中任意一个在同样的比对位置上的氨基酸(或其缺失)进行比较，可以提供SEQ ID NO：2所示序列的特定变化列表。例如图9所示，SEQ IDNO：2第17位的“k”可以被“p”或 “h”取代。另如图9所示，SEQ IDNO：2第125位的“v”可以被“i”或“f”取代。人们会意识到SEQ IDNO：2所示的序列可以含有任何数量的变体以及变体类型的任何组合。例如，SEQ ID NO：2所示的序列可以含有图9提供的一个变体或一个以上(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100或更多)的变体。应该注意到图9提供的氨基酸序列可以是具有辅酶A转移酶活性的多肽。
本发明还提供了多肽，它们所含的氨基酸序列是SEQ ID NO：2所示序列的部分的变体，如图9所示及在此描述的那样。
同样，图13提供了SEQ ID NO：10的变体及其部分；图17提供了SEQ ID NO：18的变体及其部分；图21提供了SEQ ID NO：26的变体及其部分；图33提供了SEQ ID NO：41的变体及其部分；图40、41、42提供了SEQ ID NO：39的变体；图52提供了SEQ ID NO：141的变体及其部分。
具有变体氨基酸序列的多肽可以保留酶活性。使用标准程序，例如定点诱变或PCR等，对编码一条多肽的核苷酸序列进行操作，可以产生这样的多肽。一种类型的修饰包括用具有同样生化性质的氨基酸残基替代一个或多个氨基酸残基。例如，一条多肽可以具有SEQ IDNO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161所示的氨基酸序列，其中带有一个或多个保守替代。
通过选择那些比表1所列的替代保守性更低的替代，可以获得更为大量的变化，也就是说，选择那些对维持(1)替代区域多肽骨架的结构，如片层或螺旋构象；(2)多肽靶位点的电荷或疏水性或(3)侧链的堆积影响区别更显著的残基。一般来说，预期能对多肽的功能产生最大变化的替代是下列几种情况：(1)亲水残基如丝氨酸或苏氨酸，取代疏水残基如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸，或被疏水残基取代；(2)半胱氨酸或脯氨酸取代任何其它残基或被任何其它残基取代；(3)侧链带正电的残基如赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代侧链带负电的残基如谷氨酸或天冬氨酸，或被侧链带负电的残基取代；或(4)带有大的侧链的残基如苯丙氨酸取代没有侧链的残基如甘氨酸，或被没有侧链的残基取代。这些氨基酸替代(或其他缺失或增加)的影响，对于具有酶活性的多肽来说，可以通过分析这些多肽催化作为相关天然多肽相同的底物转化为作为相关天然多肽相同的产物的能力来加以评估。因此，在本发明中提供了具有5、10、20、30、40、50或更少保守替代的多肽。
多肽和编码多肽的核酸可以通过标准的DNA诱变技术，如M13引物诱变，来产生。这些技术在《分子克隆：实验室手册》(第二版)第15章有详细描述(Sambrook等编，Molecular Cloning：A LaboratoryManual第二版，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，1989，第15章)。核酸分子的编码区可以有变化，以适应将要导入该分子的特定物种的密码子使用偏好。
或者，可以利用遗传密码的简并性来改变编码区的序列，以此使得当核酸序列基本改变时，它编码的多肽的氨基酸序列与天然的氨基酸序列仍保持一致或基本相似。例如，SEQ ID NO：2所示序列的第9个氨基酸残基是丙氨酸，其在可读框中由核苷酸三联体密码子GCT编码。因为遗传密码的简并性，其它3个核苷酸三联体密码子—GCA、GCC和GCG—也编码丙氨酸。因此，可读框中这个位点的核酸序列可以变为这3个密码子的任一种，而不影响所编码的多肽的氨基酸序列或多肽的性质。基于遗传密码的简并性，使用在此描述的标准DNA诱变技术，或通过核酸序列的合成，可以从在此公开的核酸序列衍生出核酸的变体。因此，本发明也包括了由于遗传密码的简并性而造成的编码相同多肽但核酸序列不同的核酸分子。
IV、制备3-羟基丙酸和其它有机酸的方法
在图1-5、43-44、54和55中描述的途径中的每一步骤都可以在细胞内(体内)或细胞外(体外，如一个容器或柱子中)进行。此外，还可以通过体内合成和体外合成相结合的方式生产有机酸产物。另外，体外合成步骤可以通过化学反应，也可以通过酶促反应。
例如，本发明提供的一种微生物可用于执行图1描述的步骤，或者含有指定酶活性多肽的提取物也可用于执行图1描述的步骤。此外，化学处理可用于执行图1-5、43-44、54和55中提供的转化。例如，丙烯酰辅酶A可以通过水解转化成丙烯酸。其它的化学处理包括通过转酯反应将丙烯酸转化为丙烯酸酯，但并不以此为限。
适合于作为生物转化的起始碳源包括碳水化合物和合成的中间体。细胞可利用来代谢生成丙酮酸的碳水化合物包括糖类如右旋葡萄糖、甘油三酯和脂肪酸。
此外，中间化学产物可用作起始物。例如乙酸和二氧化碳可被引入发酵培养基中。使用具有辅酶A合成酶活性的多肽、具有乙酰辅酶A羧化酶活性的多肽和具有丙二酸单酰辅酶A还原酶活性的多肽，可以顺序生产乙酰辅酶A、丙二酸单酰辅酶A和3-羟基丙酸。其它有用的中间化学起始物包括丙酸、丙烯酸、乳酸、丙酮酸和β-丙氨酸。
A、多肽的表达
在此描述的多肽可在一个宿主细胞中单独生产，也可在一个宿主细胞中混合生产。此外，具有特定酶活性的多肽可以是天然存在的也可以是非天然存在的。天然存在的多肽是任何具有在自然界中发现的氨基酸序列的多肽，包括野生型和多态性的多肽。这些天然存在的多肽可以从任何物种获得，包括动物(如哺乳动物)、植物、真菌和细菌物种，对此没有限制。非天然存在的多肽是任何具有在自然界中未发现的氨基酸序列的多肽。因此非天然存在的多肽可以是天然存在的多肽的突变体或改造的多肽。例如，一个具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的非天然存在的多肽可以是具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的天然存在的多肽的突变体，但它至少保留了部分3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性。多肽可以通过例如序列添加、缺失、替代或其组合来进行突变。
本发明提供了遗传修饰的细胞，可用于执行在此描述的代谢途径步骤中的一个或几个步骤，或该遗传修饰的细胞也可用于生产公开的多肽，以在随后用于体外反应。例如，在单个微生物中可以含有外源核酸，使其能够表达每一个执行图1、2、3、4、5、43、44、54或55所示步骤所必需的多肽。这样的细胞可以含有任何数量的外源核酸分子，注意到这一点很重要。例如，一个特定细胞可以含有6个外源核酸分子，每一个分别编码图1所示的将乳酸转化为3-羟基丙酸所必需的6个多肽之一；或者一个特定细胞可以内源性地产生将乳酸转化为丙烯酰辅酶A所必需的多肽，而同时含有外源的核酸，其能够编码将丙烯酰辅酶A转化为3-羟基丙酸所必需的多肽。
此外，单个外源核酸分子可以编码一个或一个以上多肽。例如，单个外源核酸分子可以含有编码3个不同多肽的序列。另外，在此描述的细胞可以含有特定外源核酸分子的单一拷贝或多个拷贝(如大约5、10、20、35、50、75、100或150个拷贝)。例如，一个特定的细胞可以含有大约50个拷贝的如图34、35、36、37、38或45所示的构建体。这些细胞也还可以含有一个以上特定的外源核酸分子。例如，一个特定细胞可以含有大约50个拷贝的外源核酸分子X，同时还含有大约75个拷贝的外源核酸分子Y。
在另一个实施方案中，在本发明范围内的一个细胞可以含有一个编码具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的多肽的外源核酸分子。这样的细胞可以具有任何水平的3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性。例如，一种含有编码具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的多肽的外源核酸分子的细胞，其3-羟基丙酰辅酶A脱水酶的比活可以是大于大约1毫克3-羟基丙酰辅酶A每克干细胞每小时(例如，大于大约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、350、400、500或更多毫克的3-羟基丙酰辅酶A每克干细胞每小时)。或者，对于具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的细胞，从1×106个细胞中获得的细胞提取物的比活可以大于大约1μg 3-羟基丙酰辅酶A/毫克总蛋白/10分钟(例如，大于大约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、350、400、500或更多μg3-羟基丙酰辅酶A/毫克总蛋白/10分钟)。
一个编码具有酶活性的多肽的核酸分子可以通过任何在此描述的方法识别或获得。例如，编码具有酶活性的多肽的核酸分子可以使用普通的分子克隆或化学核酸合成的步骤和技术包括PCR来识别或获得。此外，标准的核酸测序技术和基于遗传密码将核酸序列翻译成氨基酸序列的软件程序，可用于确定一个特定的核酸与已知酶活性的多肽是否具有任何序列同源性。序列比对软件如MEGALIGN_(DNASTAR，Madison，WI，1997)可用于比较不同的序列。此外，编码已知酶活性的多肽的核酸分子可以使用普通的分子克隆技术(如定点诱变)来进行突变。可能的突变包括但不限于缺失、插入和碱基替代以及缺失、插入和碱基替代的组合。另外，核酸和氨基酸数据库(如GenBank_)可用于识别编码具有酶活性的多肽的核酸序列。简而言之，任何与具有酶活性的多肽有一定同源性的氨基酸序列，或任何与编码具有酶活性多肽的序列有一定同源性的核酸序列，都可用作一个查询项来检索GenBank_。然后可以对被识别的多肽进行分析以确定它们是否表现出酶活性。
此外，核酸杂交技术也可用于识别和获得编码具有酶活性的多肽的核酸分子。简而言之，任何编码已知酶活性多肽的核酸分子或其片段都可用作探针在中度到高度严格条件下通过杂交来鉴定相似的核酸分子。然后，这种相似的核酸分子经过分离、测序和分析以确定编码的多肽是否具有酶活性。
表达克隆技术也可用于识别和获得编码具有酶活性的多肽的核酸分子。例如，一个已知可与一个特定酶活性的多肽相互作用的底物，可用于筛选含有此酶活性多肽的噬菌体展示文库。噬菌体展示文库可以按照别处描述的方法获得(Burritt等，Anal.Biochem.238：1-13(1990))，或从供货商如Novagen(Madison，WI)处获得。
此外，多肽测序技术也可用于识别和获得编码具有酶活性的多肽的核酸分子。例如，一个纯化的多肽可以通过凝胶电泳进行分离，其氨基酸序列通过例如氨基酸微量测序技术进行测定。测定后，其氨基酸序列可用于设计简并的寡核苷酸引物。简并的寡核苷酸引物通过PCR可用来获得编码该多肽的核酸。获得核酸后，可对其进行测序，克隆在合适的表达载体中，然后导入微生物。
有许多方法可用于将外源核酸分子导入细胞。事实上，对于那些本领域技术人员来说，将核酸导入微生物如细菌和酵母的许多方法是众所周知的。例如，热激、脂转染、电穿孔、接合、原生质体融合和微粒子注射(biolistic delivery)是常用的将核酸导入细菌和酵母细胞的方法。参见如Ito等，J.Bacterol.153：163-168(1983)；Durrens等，Curr.Genet.18：7-12(1990)及Becker和Guarente，Methods in Enzymology194：182-187(1991)。
本发明中一个特定细胞中所含的外源核酸分子可以以任何形式维持在细胞内。例如，外源核酸分子可以整合进细胞的基因组或保持游离状态。换句话说，本发明中的细胞可以是稳定的或过渡的转化子。再者，在此描述的微生物可以含有在此描述的特定的外源核酸分子的单一拷贝或多个拷贝(如大约5、10、20、35、50、75、100或150个拷贝)。
对于那些本领域技术人员来说，从外源核酸分子表达氨基酸序列的方法是众所周知的。这样的方法包括但不限于构建一个核酸，以使调控元件启动编码多肽的核酸分子的表达。一般来说，调控元件是在转录水平上调节其它DNA序列表达的DNA序列。因此，调控元件包括启动子、增强子等，但并不以此为限。任何类型的启动子都可用于从外源核酸分子表达氨基酸序列。启动子的例子包括组成型启动子、组织特异性启动子以及对特定刺激(如光、氧、化学浓度等)反应或无反应的启动子，但并不以此为限。对于那些本领域技术人员来说，在细胞如细菌和酵母中从外源核酸分子表达多肽的方法是众所周知的。例如，能够在大肠杆菌中表达外源多肽的核酸构建体是众所周知的。参见如Sambrook等，Molecular cloning：a laboratory manual，ColdSpring Harbour Laboratory Press，New York，USA，第二版(1989)。
B、通过宿主细胞生产有机酸和相关产物
在此提供的核酸和氨基酸序列可与细胞共同使用以生产3-羟基丙酸和/或其它有机化合物，如1，3-丙二醇、丙烯酸、聚丙烯酸、丙烯酸酯、3-羟基丙酸酯和聚3-羟基丙酸。这样的细胞可以来自任何物种，包括那些列于美国政府资助的国家卫生研究所(National Institute ofHealth)的分类学网页( www.ncbi.nlm.nih.gov)中的物种。细胞可以是真核细胞也可以是原核细胞。例如，本发明的遗传修饰的细胞可以是哺乳动物细胞(如人、鼠和牛的细胞)、植物细胞(如玉米、小麦、水稻和大豆细胞)、真菌细胞(如曲霉(Aspergillus)或根霉(Rhizopus)细胞)、酵母细胞或细菌细胞(如乳酸杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、芽孢杆菌(Bacillus)、埃希氏杆菌(Escherichia)和梭状芽孢杆菌(Clostridium)细胞)。本发明的细胞也可以是微生物。这里所用的术语“微生物”指任何微小的生物，包括但不限于细菌、藻类、真菌和原生动物。因此，大肠杆菌(E.coli)、啤酒酵母(S.cerevisiae)、乳克鲁维氏酵母(Kluveromyces lactis)、布蓝克氏假丝酵母(Candida blankii)、皱摺假丝酵母(Candida rugosa)和巴斯德毕赤氏酵母(Pichia postoris)都可被视为微生物并在此使用。
一般来说，本发明所用细胞是经过遗传修饰的，以便能够产生特定的有机化合物。在一个实施方案中，本发明提供了能够从磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)生产3-羟基丙酸(3-HP)的细胞。可被细胞利用来生产3-羟基丙酸的生物合成途径的例子示于图1-5、43-44、54和55。
一般来说，经过遗传修饰能够合成特定有机化合物的细胞含有一种或多种编码具有特定酶活性的多肽的外源核酸分子。例如，一个微生物可以含有编码具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的多肽的外源核酸。在这种情况下，丙烯酰辅酶A可以被转化为3-羟基丙酰辅酶A，并导致3-羟基丙酸的产生。可以注意到，在将编码具有酶活性的多肽的外源核酸分子引入细胞后，该细胞就可以催化正常情况下不能被该细胞产生的化合物的形成。或者，在将编码具有酶活性的多肽的外源核酸分子引入细胞后，该细胞也可以催化正常情况下能被该细胞产生的化合物的形成。在这种情况下，遗传修饰的细胞与没有经过遗传修饰的相似细胞相比，可以产生更多的化合物，或可以更有效地生产这种化合物。
在一个实施方案中，本发明提供了一种含有外源核酸分子的细胞，该核酸分子编码具有能导致3-羟基丙酸形成的酶活性的多肽。可以注意到产生的3-羟基丙酸可以从细胞中分泌出来，从而消除了破碎细胞膜以释放有机化合物的需要。一般来说，本发明的细胞产生的3-羟基丙酸的浓度为至少大约100mg/L(例如至少大约1g/L、5g/L、10g/L、25g/L、50g/L、75g/L、80g/L、90g/L、100g/L或120g/L)。确定一个特定细胞的有机化合物如3-羟基丙酸的产量，可以采取多种方法。参见如Applied Environmental Microbiology 59(12)：4261-4265(1993)。一般来说，本发明范围内的细胞如微生物可代谢己糖碳源如葡萄糖。然而，细胞也可代谢许多不同碳源，如戊糖(例如核糖、阿拉伯糖、木糖或来苏糖)、脂肪酸、乙酸或甘油。换句话说，本发明范围内的细胞可以利用各种不同的碳源。
正如在此所描述的本发明范围内的细胞可以含有外源核酸分子，它编码具有酶活性的多肽，而该酶活性可以导致3-羟基丙酸或其它有机化合物如1，3-丙二醇、丙烯酸、聚丙烯酸、丙烯酸酯、3-羟基丙酸酯和聚3-羟基丙酸的形成。对于那些本领域技术人员来说，鉴定细胞是否含有外源核酸的方法是众所周知的。这些方法包括但不限于PCR和核酸杂交技术如Northern和Southern分析(参见在此所述的方法)。在某些情况下，利用免疫组织化学和生物化学技术，通过检测由特定核酸分子编码的多肽的表达，也可确定一个细胞内是否含有该特定核酸。例如，对一种多肽具有特异性的抗体可用于确定在特定细胞中是否含有编码这种多肽的核酸。此外，利用生化技术，通过检测具有酶活性的多肽表达而产生的有机产物，可以确定在细胞中是否含有编码该多肽的特定核酸分子。例如，将编码一个具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的多肽的外源核酸导入到一个在正常情况下不表达该多肽的细胞中，然后检测到了3-羟基丙酸，不仅表明在细胞中含有被导入的外源核酸分子，而且表明这种由被导入的外源核酸分子所编码的多肽得到了表达。对于那些本领域技术人员来说，检测特定的酶活性或特定有机产物的存在的方法是众所周知的。例如，检测有机化合物如3-羟基丙酸存在的方法如他文所述。参见Sullivan和Clarke，J.Assoc.Offic.Agr.Chemists，38：514-518(1955)。
C、具有减少的多肽活性的细胞
本发明还提供了具有减少的多肽活性的遗传修饰细胞。在此所用的术语“减少的”是指一个细胞或特定的多肽比相同物种的可比较细胞中测定的活性水平低。例如，如果可比较的微生物中至少具有一定的酶活性X，那么一个不具有酶活性X的特定微生物可以被视为具有减少的酶活性X。值得注意的是，细胞可使任何种类的多肽活性减少，包括但不限于酶、转录因子、转运蛋白、受体、信号分子等。例如，细胞可以含有一种外源核酸分子，该核酸分子中具有丙酮酸脱羧酶活性或醇脱氢酶活性的多肽的调节和/或编码序列已被破坏。破坏丙酮酸脱羧酶和/或醇脱氢酶的表达可以导致乳酸以及从乳酸产生的产物，如3-羟基丙酸、1，3-丙二醇、丙烯酸、聚丙烯酸、丙烯酸酯、3-羟基丙酸酯和聚3-羟基丙酸的积累。另外还可注意到，减少的多肽活性可能是较低的多肽浓度、较低的多肽比活性或二者结合的结果。有许多不同的方法可用于使细胞具有减少的多肽活性。例如，可使用常用的诱变或剔除技术对细胞进行改造，使其具有破坏的调控序列或多肽编码序列。参见如Methods in Yeast Genetics(1997版)，Adams，Gottschling，Kaiser和Sterns，Cold Spring Harbor Press(1998)。或者，反义技术也可用于减少特定多肽的活性。例如，细胞经改造后可使其带有一个编码反义分子的cDNA，从而阻止了多肽的翻译。在此所用的术语“反义分子”涵盖了任何含有与内源多肽的编码链相对应的序列的核酸分子或核酸类似物(如肽核酸)。反义分子也可以含有两侧的序列(如调控序列)。因此，反义分子可以是核酶或反义寡核苷酸。核酶可以具有任何一般的结构，包括但不限于发卡、锤头或斧头结构，只要该分子切割RNA。此外，基因沉默也可用于减少特定多肽的活性。
具有减少的多肽活性的细胞可以使用多种方法进行鉴定。如象那些在本发明中描述的酶活分析方法可用于鉴定具有减少的酶活性的细胞。
具有(1)SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列(OS17多肽)或(2)与SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列具有至少约60％序列同一性的氨基酸序列的多肽，可以具有3个功能结构域：具有辅酶A合成酶活性的结构域、具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的结构域和具有辅酶A还原酶活性的结构域。这样的多肽可以通过突变和/或缺失结构域来进行选择性修饰，从而使一或两种酶活性减少。减少OS17多肽的脱水酶活性可以导致从丙酰辅酶A生成丙烯酰辅酶A。然后丙烯酰辅酶A可与具有辅酶A水解酶活性的多肽作用以从丙酸生产丙烯酸(图43)。同样，使用例如具有减少的还原酶活性的OS17多肽，可以从3-羟基丙酸生产丙烯酰辅酶A。
D、通过体外技术生产有机酸和相关产物
此外，具有酶活性的纯化的多肽可以单独或与细胞共同使用以生产3-羟基丙酸或其它有机化合物如1，3-丙二醇、丙烯酸、聚丙烯酸、丙烯酸酯、3-羟基丙酸酯和聚3-羟基丙酸。例如，含有基本上纯的具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的多肽的制剂，可用于催化一种3-羟基丙酸的前体，3-羟基丙酰辅酶A的形成。另外，含有具酶活性的多肽的无细胞提取物可以单独或与纯化的多肽和/或细胞共同使用以生产3-羟基丙酸。例如，含有具有辅酶A转移酶活性的多肽的无细胞提取物可用于产生乳酰辅酶A，而含有对催化乳酰辅酶A生成3-羟基丙酸反应所必需的酶活性多肽的微生物可用于生产3-羟基丙酸。有多种方法可用于产生无细胞提取物。例如渗透压冲击、超声和/或反复冻融，然后过滤和/或离心，可用于从完整细胞产生无细胞提取物。
值得注意的是，细胞、纯化的多肽和/或无细胞提取物均可用于生产3-羟基丙酸，而3-羟基丙酸经过化学处理又可生产其它化合物。例如，使用微生物生产3-羟基丙酸，而利用化学方法修饰3-羟基丙酸产生衍生物如聚3-羟基丙酸或3-羟基丙酸酯。同样，还可利用化学方法生产特定化合物，即通过使用在此描述的细胞、基本纯的多肽和/或无细胞提取物，又可将该特定化合物转化为3-羟基丙酸或其它有机化合物(如1，3-丙二醇、丙烯酸、聚丙烯酸、丙烯酸酯、3-羟基丙酸酯和聚3-羟基丙酸)。例如，使用化学方法生产丙烯酰辅酶A，然后使用微生物将丙烯酰辅酶A转化为3-羟基丙酸。
E、细胞发酵生产有机酸
一般来说，通过提供一株生产细胞如微生物，然后在培养基中培养该微生物来生产3-羟基丙酸。在通常情况下，培养基的成分和/或培养条件可以使微生物生长到足够的密度并有效地生产3-羟基丙酸。对于大规模的生产工艺，可以采用例如下述文献中所述的任何方法(《工业微生物和生物技术手册》第二版，A.L.Demain和J.E.Davies编，ASM出版社；和《发酵技术原理》，P.F.Stanbury和A.Whitaker，Pergamon)。简而言之，将特定的微生物接种到含有适当培养基和例如葡萄糖碳源的大罐(如100加仑、200加仑、500加仑或更大的罐)中。接种后，使微生物温育以让生物量产生。一旦达到所需的生物量后，可以将含有微生物的培养液转移到第二个罐中。第二个罐可以是任意大小的。例如第二个罐可以大于、小于或等同于第一个罐的大小。一般来说，第二个罐大于第一个罐，以便在第一个罐的培养液中可以添加培养基。此外，第二个罐中的培养基可以与第一个罐中所用的培养基相同或不同。例如第一个罐中含有带木糖的培养基，而第二个罐中含有带葡萄糖的培养基。
转移培养液后，使微生物温育以让3-羟基丙酸生产。生产后，可以使用多种方法来分离3-羟基丙酸。例如，常用的分离技术可用于从培养液中去除生物质，常用的分离程序(如抽提、蒸馏和离子交换步骤)可用于从无微生物的培养液中获得3-羟基丙酸。此外，3-羟基丙酸在刚一产生时就可以分离，或在产物生产阶段结束后从培养液中分离。
F、从公开的生物合成途径生产的产物
从图1-5、43-44、54和55提供的任何步骤生产的有机化合物，可以被化学转化为其它有机化合物。例如，3-羟基丙酸可以加氢生成1，3-丙二醇，它是一种有价值的聚酯单体。可以采用如对琥珀酸和/或乳酸进行加氢的任何方法来对有机酸如3-羟基丙酸进行加氢。例如，可以使用金属催化剂为3-羟基丙酸加氢。另一个例子，3-羟基丙酸可以脱水形成丙烯酸。可以使用多种方法进行脱水反应。例如，3-羟基丙酸在存在催化剂(如金属或无机酸催化剂)的情况下可以通过加热形成丙烯酸。丙二醇也可通过在体内或体外使用具有氧化还原酶活性(如EC1.1.1.-类的酶)的多肽来生产。
V、用于产生能从磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)生产3-羟基丙酸(3-HP)的生物合成途径的方法的概述
本发明提供了通过使用生物合成途径从磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)生产3-羟基丙酸(3-HP)和相关产物的方法。解释性的例子包括通过乳酸中间体、丙二酸单酰辅酶A中间体和β-丙氨酸中间体生产3-羟基丙酸的方法。
A、通过乳酸中间体生产3-羟基丙酸的生物合成途径
构建了一条可用于从磷酸烯醇式丙酮酸生产3-羟基丙酸的生物合成途径(图1)。在该途径中使用了几种在此所述的克隆和表达的多肽。埃氏巨球菌(M.Elsdenii)细胞(ATCC17753)被用作基因组DNA的来源。使用引物鉴定和克隆了编码具有辅酶A转移酶活性的多肽的核酸序列(SEQ ID NO：1)。然后对多肽的酶活性进行了测试，发现其具有辅酶A转移酶活性。
同样，使用PCR引物鉴定了埃氏巨球菌基因组DNA中编码E1激活因子、E2α亚基和E2β亚基多肽的核酸序列(分别为SEQ ID NO：9、17和25)。这些多肽随后显示具有乳酰辅酶A脱水酶活性。
以橙色绿屈挠菌细胞(ATCC 29365)为基因组DNA的来源。通过最初的克隆鉴定了OS17(SEQ ID NO：129)和OS19(SEQ ID NO：40)的核酸序列。随后的分析表明OS17编码了一条具有辅酶A合成酶活性、脱水酶活性和脱氢酶活性(丙酰辅酶A合成酶)的多肽。随后的分析还表明OS19编码了具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性(也称为丙烯酰辅酶A水合酶活性)的多肽。
构建了几个在大肠杆菌中使用的操纵子。这些操纵子可以在细菌细胞中生产3-羟基丙酸。其它的实验在酵母中表达了这些多肽，也可用于生产3-羟基丙酸。
B、通过丙二酸单酰辅酶A中间体生产3-羟基丙酸的生物合成途径
构建了另一条可用于从磷酸烯醇式丙酮酸生产3-羟基丙酸的生物合成途径被构建。这条途径使用了一条从大肠杆菌中分离的具有乙酰辅酶A羧化酶活性的多肽(实施例9)，和一条从橙色绿屈挠菌中分离的具有丙二酸单酰辅酶A还原酶活性的多肽(实施例10)。这两个多肽的组合可以从乙酰辅酶A生产3-羟基丙酸(图44)。
将编码具有丙二酸单酰辅酶A还原酶活性的多肽的核酸序列(SEQ ID NO：140)克隆、测序和表达。具有丙二酸单酰辅酶A还原酶活性的多肽然后用于生产3-羟基丙酸。
C、通过β-丙氨酸中间体生产3-羟基丙酸的生物合成途径
一般来说，原核生物和真核生物通过EMP途径将葡萄糖代谢为磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)，它是碳代谢中的一种中心代谢物。从葡萄糖产生的磷酸烯醇式丙酮酸可以羧化为草酰乙酸，也可以转化为丙酮酸。从磷酸烯醇式丙酮酸到草酰乙酸的羧化反应可以被具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的多肽、具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶活性的多肽或具有磷酸烯醇式丙酮酸转羧基酶活性的多肽所催化。具有丙酮酸激酶活性的多肽可以将磷酸烯醇式丙酮酸转化为丙酮酸，丙酮酸又可以被具有丙酮酸羧化酶活性的多肽转化为草酰乙酸。
从磷酸烯醇式丙酮酸或丙酮酸产生的草酰乙酸都可作为前体生产天冬氨酸。这个转化可以由具有天冬氨酸氨基转移酶活性的多肽催化，该多肽可以从谷氨酸上转移一个氨基到草酰乙酸上。在此反应中消耗的谷氨酸可以通过具有谷氨酸脱氢酶活性的多肽或者具有4，4-氨基丁酸氨基转移酶活性的多肽的作用而得到再生。天冬氨酸脱羧生成β-丙氨酸的反应由具有天冬氨酸脱羧酶活性的多肽催化。通过这个生化过程产生的β-丙氨酸可以通过两个可能的途径转化为3-羟基丙酸。这两个途径见图54和55。
这两个途径中包含的生产β-丙氨酸的步骤可以是相同的。这些步骤可以通过宿主细胞中能将磷酸烯醇式丙酮酸转化为β-丙氨酸的内源性多肽来执行，也可以通过重组DNA技术使用已知的多肽，如具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(EC4.1.1.32)活性、天冬氨酸氨基转移酶(EC2.6.1.1)活性和天冬氨酸α-脱羧酶(EC4.1.1.11)活性的多肽来执行。
如图54所示，具有辅酶A转移酶活性的多肽(如具有SEQ ID NO：2所示序列的多肽)可用于将β-丙氨酸转化为β-丙氨酰辅酶A。β-丙氨酰辅酶A可以被具有β-丙氨酰辅酶A脱氨酶活性的多肽(如具有SEQID NO：160所示序列的多肽)转化为丙烯酰辅酶A。丙烯酰辅酶A可以被具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的多肽(如具有SEQ ID NO：40所示序列的多肽)转化为3-羟基丙酰辅酶A。3-羟基丙酰辅酶A可以被具有辅酶A转移酶活性的多肽(如具有SEQ ID NO：2所示序列的多肽)转化为3-羟基丙酸。
如图55所示，β-丙氨酸可以被具有4，4-氨基丁酸氨基转移酶(EC2.6.1.19)活性的多肽转化为丙二酸半醛。丙二酸半醛可以被具有3-羟基丙酸脱氢酶(EC1.1.1.59)活性的多肽或具有3-羟基异丁酸脱氢酶活性的多肽转化为3-羟基丙酸。
实施例
实施例1、编码具有辅酶A转移酶活性的多肽的核酸分子的克隆
将埃氏巨球菌细胞(ATCC17753)在1053梭状芽孢杆菌强化培养基中于37℃在滚管中厌氧培养12-14小时，从中分离基因组DNA。细胞培养后，将其沉淀，用5mL10mM Tris溶液洗涤，再沉淀。将收集的细胞重悬浮于1mL的Gentra细胞悬浮液中，加入14.2mg溶菌酶和4μL20mg/mL的蛋白酶K溶液。细胞悬浮液于37℃保温30分钟。使用Gentra基因组DNA分离试剂盒按照说明书中的方法分离基因组DNA。将沉淀的基因组DNA搅出，空气干燥10分钟。使基因组DNA悬浮于500μL10mM Tris溶液中，4℃保存。
基于乙酰辅酶A转移酶和丙酰辅酶A转移酶的保守序列设计了两个简并的正向PCR引物(CoAF1和CoAF2)和三个简并的反向PCR引物(CoAR1、CoAR2和CoAR3)(CoAF15’-GAAWSCGGYSCNATYGGYGG-3’，SEQ ID NO：49；CoAF2 5’-TTYTGYGGYRSBTTYACBGCWGG-3’，SEQ ID NO：50；CoAR15’-CCWGCVGTRAAVSYRCCRCARAA-3’，SEQ ID NO：51；CoAR25’-AARACDSMRCGTTCVGTRATRTA-3’，SEQ ID NO：52；CoAR35’-TCRAYRCCSGGWGCRAYTTC-3’，SEQ ID NO：53)。在PCR中使用了所有逻辑组合的引物和Taq聚合酶(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)，并在每μL反应混合物中加入1ng基因组DNA。在PCR过程中使用了递减程序(touchdown program)，在59℃退火4个循环，57℃退火4个循环，55℃退火4个循环和52℃退火18个循环。每一循环中94℃变性30秒和72℃延伸3分钟。起始时在94℃预变性2分钟，结束时在72℃最后延伸4分钟。退火的时间设置为45秒。反应中使用的PCR引物的量比常规PCR中的引物量高2-8倍，这取决于引物3’末端的简并性。此外，使用每个单独引物分开进行了PCR反应，以鉴定从单一简并引物获得的PCR产物。各个PCR产物(25μL)用1％TAE(Tris-乙酸-EDTA)的琼脂糖凝胶进行电泳分离。
CoAF1-CoAR2、CoAF1-CoAR3、CoAF2-CoAR2和CoAF2-CoAR3组合分别产生了423、474、177和228bp的带。这些带大小与基于其它辅酶A转移酶序列所得的大小相匹配。在使用单一引物的对照反应中没有观察到带。使用Qiagen凝胶抽提试剂盒(Qiagen Inc.，Valencia，CA)分离和纯化了CoAF1-CoAR3片段(474bp)。4μL被纯化的带被连接到pCRII载体中，并通过热激使用TOPO克隆程序(Invitrogen，Carlsbad，CA)转化到TOP10大肠杆菌细胞中。转化液涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素(Amp)和50μg/mL5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖吡喃糖苷(X-gal)的LB培养基上。将单一的白色菌落涂布到新鲜的培养基平板上，使用CoAF1和CoAR3引物进行PCR反应来进行筛选，以证实插入片段的存在。
使用QiaPrep Spin微量制备试剂盒(Qiagen，Inc.)提取质粒DNA，鉴定后用M13R和M13F引物进行测序。序列分析的结果表明CoAF1-CoAR3片段与乙酰辅酶A转移酶序列具有序列相似性。
为获得完整的编码序列进行了基因组步查法(genome walking)。利用了474bp位于简并引物内部的部分CoAF1-CoAR3片段序列设计了下列用于基因组步查的上游和下游方向引物：COAGSP1F5’-GAATGTTTACTTCTGCGGCACCTTCAC-3’，SEQ ID NO：54；COAGSP2F5’-GACCAGATCACTTTCAACGGTTCCTATG-3’，SEQ IDNO：55；COAGSP1R5’-GCATAGGAACCGTTGAAAGTGATCTGG-3’，SEQ ID NO：56；和 COAGSP2R5’-GTTAGTACCGAACTTGCTGACGTTGATG-3’，SEQ ID NO：57。COAGSP1F和COAGSP2F引物面向下游，而COAGSP1R和COAGSP2R引物面向上游。此外，COAGSP2F和COAGSP2R引物嵌套于COAGSP1F和COAGSP1R引物之内。使用通用的基因组步查试剂盒(ClonTech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)来进行基因组步查，除了使用NruI、ScaI和HincII酶来产生其他文库以外。使用Perkin Elmer2400热循环仪进行第一轮PCR，94℃2秒、72℃3分钟，共7个循环，然后94℃2秒、65℃3分钟，共36个循环，最后65℃延伸4分钟。第二轮PCR采用94℃2秒、72℃3分钟，共5个循环，然后94℃2秒、65℃3分钟，共20个循环，最后65℃延伸4分钟。第一和第二轮PCR产物(20μL)在1％TAE的琼脂糖凝胶上进行电泳分离。使用StuI产生的文库获得反方向的扩增产物。从该文库获得的1.5Kb的第二轮产物被凝胶纯化、克隆和测序。序列分析表明从基因组步查得到的序列与CoAF1-CoAR3片段重叠，并与其它序列如乙酰辅酶A转移酶序列具有序列相似性(图8-9)。
使用下列PCR程序设置，从埃氏巨球菌染色体DNA经PCR扩增了编码辅酶A转移酶(丙酰辅酶A转移酶-或者pct)的核酸：95℃变性30秒、50℃退火30秒和72℃延伸3分钟(每循环增加2秒)，25个循环。所用的引物被命名为PCT-1.114(5’-ATGAGAAAAGTAGAAATCATTAC-3’；SEQ ID NO：58)和PCT-2.2045(5’-GGCGGAAGTTGACGATAATG-3’；SEQ ID NO：59)。使用QiagenPCR纯化试剂盒(Qiagen Inc.，Valencia，CA)纯化了所得的PCR产物(从琼脂糖凝胶电泳判断大约为2kb)。纯化的产物使用Perfectly Blunt克隆试剂盒(Novagen，Madison，WI)连接到pETBlue-1。把连接反应液转化NovaBlue化学感受态细胞(Novagen，Madison，WI)，涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素、40μg/mL IPTG和40μg/mLX-Gal的LB平板上。将白色菌落分离，并通过限制性酶切作图来筛选插入片段的存在。具有正确的限制性酶切图谱的分离的克隆从两端测序以验证连接点的序列，所用引物为pETBlueUP和pETBlueDOWN(Novagen)。
将质粒转化入Tuner(DE3)pLacI化学感受态细胞(Novagen，Madison，WI)，并检测构建体的表达情况。简而言之，过夜培养达到饱和的培养物在第二天早上用含有适当抗生素的新鲜LB培养基稀释20倍，37℃通气培养至OD600为大约0.6。培养物中加入IPTG至终浓度为100μM进行诱导，继续于37℃通气培养2小时。在诱导前和诱导后2小时取样进行SDS-PAGE分析。在IPTG处理后的样品中观察到了具有预期分子量的带(从序列预测的分子量为55,653道尔顿)。在所含质粒缺少编码转移酶的核酸的细胞中，没有观察到这条带。
为评估酶活性而制备了无细胞提取物。简单地说，离心收集细胞，超声破碎。然后将超声破碎的细胞悬浮液离心以除去细胞碎片，并将上清液用于分析。
转移酶活性按下述方法测定：所用的反应混合液含100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)、200mM乙酸钠、1mM二硫双硝基苯甲酸盐(DTNB)、500μM草酰乙酸、25μM辅酶A酯底物和3μg/mL柠檬酸合成酶。辅酶A转移酶如果存在，就可从辅酶A酯将辅酶A转移到乙酸上生成乙酰辅酶A。加入的柠檬酸合成酶将草酰乙酸和乙酰辅酶A缩合形成柠檬酸和游离的辅酶A。游离的辅酶A与DTNB结合，形成的复合物可以通过在412nm处光密度的变化来测定。使用下列底物测定辅酶A转移酶的活力：乳酰辅酶A、丙酰辅酶A、丙烯酰辅酶A和3-羟基丙酰辅酶A。使用下列公式计算每mg蛋白的单位数：
(ΔE/min×Vf×稀释倍数)/(Vs×14.2)＝U/mL其中ΔE/min是在412nm处每分钟吸光值的变化，Vf是反应的终体积，以及Vs是所加样品的体积。无细胞提取物的总蛋白浓度是大约1mg/mL，所以U/mL等于U/mg蛋白。
从含有编码辅酶A转移酶的核酸的细胞得到的无细胞提取物表现出了辅酶A转移酶活性(表2)。使用乳酰辅酶A、丙酰辅酶A、丙烯酰辅酶A和3-羟基丙酰辅酶A底物均测定到了辅酶A转移酶活性(表2)。最高的辅酶A转移酶活性是以乳酰辅酶A和丙酰辅酶A为底物时测定到的。
表2
底物  U/mg
乳酰辅酶A  211
丙酰辅酶A  144
丙烯酰辅酶A  118
3-羟基丙酰辅酶A  110
进行了下列分析以检测辅酶A转移酶活性是否可以利用同样的辅酶A供体作为受体。具体地说，对辅酶A转移酶活性的评估使用了Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MassSpectrometry(MALDI-TOFMS)Voyager RP工作站(PerSeptiveBiosystems)。分析了下列5个反应：
1、
2、
3、
4、
5、
MALDI-TOF MS用于同时测定产物辅酶A酯的出现和供体辅酶A酯的消失。分析缓冲液含有50mM磷酸钾(pH7.0)、1mM辅酶A酯和100mM相应的有机酸盐。加入按前述方法制备的无细胞提取物的蛋白至终浓度为0.005mg/mL。以从缺少含有编码辅酶A转移酶的核酸的构建体的细胞中制得的无细胞提取物进行对照反应。在每一个反应中，无细胞提取物最后加入以起始反应。反应在室温进行，加入1倍体积10％三氟乙酸(TFA)终止反应。在MALDI-TOF MS分析前，反应混合物先用Sep Pak Vac C1850mg柱(Waters，Inc.)纯化。柱子加入1mL甲醇进行调节，并用1mL0.1％的TFA洗两次平衡。柱子上样后，弃去穿透液。然后用1mL0.1％的TFA洗两次。样品用200μL40％乙腈、0.1％TFA洗脱。真空离心以除去乙腈。将样品与含有110mM芥子酸的0.1％TFA、67％乙腈的溶液1∶1混合，从而获得可用于MALDI-TOF MS分析的样品。样品进行空气干燥。
在第一个反应中，对照样品在分子量对应于乳酰辅酶A(分子量841)处出现一个主峰，此外在分子量对应于乙酰辅酶A(分子量811)处出现一个次峰。这个次峰经确定是合成乳酰辅酶A时剩余的乙酰辅酶A。第一个反应样品中含有转化有编码辅酶A转移酶的质粒的细胞的无细胞提取物，其中乳酰辅酶A完全转化为乙酰辅酶A。没有观察到乳酰辅酶A的峰。这个结果表明辅酶A转移酶活性可以将辅酶A从乳酰辅酶A转移到乙酸上形成乙酰辅酶A。
在第二个反应中，对照样品在分子量对应于丙酰辅酶A(分子量825)处出现一个主峰。第二个反应样品中含有转化有编码辅酶A转移酶的质粒的细胞的无细胞提取物，在分子量对应于乙酰辅酶A(分子量811)处出现一个主峰。没有观察到丙酰辅酶A的峰。这个结果表明辅酶A转移酶活性可以将辅酶A从丙酰辅酶A转移到乙酸上形成乙酰辅酶A。
在第三个反应中，对照样品在分子量对应于乙酰辅酶A(分子量811)处出现一个主峰。第三个反应样品中含有转化有编码辅酶A转移酶的质粒的细胞的无细胞提取物，在分子量对应于乳酰辅酶A(分子量841)处出现一个峰。对应于乙酰辅酶A的峰没有消失。事实上，这两个峰的大小比例为大约1∶1。观察到对应于乳酰辅酶A的峰的出现表明辅酶A转移酶活性催化了第三个反应。
在第四个反应中，对照样品在分子量对应于丙烯酰辅酶A(分子量823)处出现一个主峰。第四个反应样品中含有转化有编码辅酶A转移酶的质粒的细胞的无细胞提取物，在分子量对应于乳酰辅酶A(分子量841)处出现一个主峰。这个结果表明辅酶A转移酶活性催化了第四个反应。
在第五个反应中，氘化的乳酰辅酶A用于检测辅酶A从乳酸到3-羟基丙酸的转移，因为乳酸和3-羟基丙酸分子量相同，它们各自的辅酶A酯分子量也相同。在使用MALDI-TOF MS时利用氘化的乳酰辅酶A使乳酰辅酶A和3-羟基丙酰辅酶A之间产生差别。对照样品在分子量从841到845间出现一组扩散的峰，这是由于有不同量的氢原子被氘原子取代。另外，在分子量对应于乙酰辅酶A(分子量811)处观察到一个明显的峰。这个峰经确定是合成乳酰辅酶A时剩余的乙酰辅酶A。第五个反应样品中含有转化有编码辅酶A转移酶的质粒的细胞的无细胞提取物，与在分子量从841到845间出现一组峰相反，在分子量对应于3-羟基丙酰辅酶A(分子量841)处出现一个主峰。这个结果表明辅酶A转移酶活性催化了第五个反应。
实施例2、编码具有乳酰辅酶A脱水酶活性的多种多肽复合物的核酸分子的克隆
下列方法用于克隆E1激活因子多肽。简单地说，基于E1激活因子蛋白类似物的保守序列设计了4个简并的正向PCR引物和5个简并的反向PCR引物(E1F15’-GCWACBGGYTAYGGYCG-3’，SEQ IDNO：60；E1F25’-GTYRTYGAYRTYGGYGGYCAGGA-3’，SEQ ID NO：61；E1F35’-ATGAACGAYAARTGYGCWGCWGG-3’，SEQ ID NO：62；E1F45’-TGYGCWGCWGGYACBGGYCGYTT-3’，SEQ ID NO：63；E1R1 5’-TCCTGRCCRCCRAYRTCRAYRAC-3’，SEQ ID NO：64；E1R2 5’-CCWGCWGCRCAYTTRTCGTTCAT-3’，SEQ ID NO：65；E1R3 5’-AARCGRCCVGTRCCWGCWGCRCA-3’，SEQ ID NO：66；E1R4 5’-GCTTCGSWTTCRACRATGSW-3’，SEQ ID NO：67；和E1R5 5’-GSWRATRACTTCGCWTTCWGCRAA-3’，SEQ ID NO：68)。
在PCR中使用了所有逻辑组合的引物和Taq聚合酶(RocheMolecular Biochemicals，Indianapolis，IN)，并在每μL反应混合物中加入1ng基因组DNA。在PCR过程中使用了递减程序，在60℃退火4个循环，58℃退火4个循环，56℃退火4个循环，和54℃退火18个循环。每一循环中94℃变性30秒和72℃延伸3分钟。起始时在94℃预变性2分钟，结束时在72℃最后延伸4分钟。退火的时间设置为45秒。反应中使用的PCR引物的量比典型的PCR反应中的引物量高2-10倍，这取决于引物3’末端的简并性的量。此外，使用每个单独引物分开进行了PCR反应，以鉴定从单一简并引物获得的PCR产物。PCR产物(25μL)用1％TAE(Tris-乙酸-EDTA)的琼脂糖凝胶进行电泳分离。
E1F2-E1R4、E1F2-E1R5、EIF3-E1R4、E1F3-E1R5和E1F4-E1R4R2组合分别产生了195、207、144、156和144bp的带。这些带的大小与基于其它物种的E1激活因子序列所预期的大小相匹配。在使用单一引物的对照反应中没有观察到带。使用Qiagen凝胶抽提试剂盒(Qiagen Inc.，Valencia，CA)分离和纯化了E1F2-E1R5片段(207bp)。将纯化的带(4μL)连接到pCRII载体中，通过热激使用TOPO克隆程序(Invitrogen，Carlsbad，CA)转化到TOP10大肠杆菌细胞中。转化液涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mLX-gal的LB培养基平板上。把单一的白色菌落涂到新鲜的培养基平板上，使用E1F2和E1R5引物在PCR反应中进行筛选，以证实插入片段的存在。使用QiaPrep Spin微量制备试剂盒(Qiagen，Inc.)从多个克隆中提取质粒DNA，定量后用M13R和M13F引物进行DNA测序。序列分析发现了一个编码多肽的核酸序列，并发现E1F2-E1R5片段与E1激活因子序列具有序列相似性(图12-13)。
为获得E2α和β亚基完整的编码序列使用了基因组步查法。简单地说，利用了207bp位于E1F2和E1R5简并引物内部的部分E1F2-E1R5片段序列设计了用于基因组步查的4个上游和下游方向引物：E1GSP1F5’-ACGTCATGTCGAAGGTACTGGAAATCC-3’，SEQ ID NO：69；E1GSP2F 5’-GGGACTGGTACTTCAAATCGAAGCATC-3’，SEQ IDNO：70；E1GSP1R 5’-TGACGGCAGCGGGATGCTTCGATTTGA-3’，SEQID NO：71；和E1GSP2R 5’-TCAGACATGGGGATTTCCAGTACCTTC-3’，SEQ ID NO：72。E1GSP1F和E1GSP2F引物面向下游，而E1GSP1R和E1GSP2R引物面向上游。此外，E1GSP2F和E1GSP2R引物嵌套于E1GSP1F和E1GSP1R引物之内。
使用通用的基因组步查试剂盒(ClonTech Laboratories，Inc.，PaloAlto，CA)来进行基因组步查，除了使用NruI、ScaI和HincII酶来产生文库以外。使用Perkin Elmer2400热循环仪进行第一轮PCR，94℃2秒、72℃3分钟，共7个循环，然后94℃2秒、65℃3分钟，共36个循环，最后65℃延伸4分钟。第二轮PCR采用94℃2秒、72℃3分钟，共5个循环，然后94℃2秒、65℃3分钟，共20个循环，最后65℃延伸4分钟。第一和第二轮PCR产物(20μL)在1％TAE的琼脂糖凝胶上进行电泳分离。使用StuI产生的文库获得了正向与反向的扩增产物。第二轮从StuI文库获得的大约1.5kb的正向产物和大约3kb的反向产物片段被凝胶纯化、克隆和测序。序列分析表明从基因组步查得到的序列与E1F2-E1R5片段重叠。
为了获得其他序列进行了第二次基因组步查，第一轮引物为：E1GSPF5 5’-CCGTGTTACTTGGGAAGGTATCGCTGTCTG-3’，SEQ IDNO：73 ，和第二轮引物为：E1GSPF6 5’-GCCAATGAAGGAGGAAACCACTAATGAGTC-3’，SEQ ID NO：74。使用NruI、ScaI和HincII文库来进行基因组步查。此外，在PCR中使用了ClonTech的Advantage-Genomic聚合酶。在Perkin Elmer2400热循环仪上进行第一轮PCR，94℃预变性2分钟，然后94℃2秒、72℃3分钟，共7个循环，接着94℃2秒、65℃3分钟，共36个循环，最后65℃延伸4分钟。第二轮PCR采用94℃2秒、72℃3分钟，共5个循环，然后94℃2秒、65℃3分钟，共20个循环，最后65℃延伸4分钟。第一和第二轮PCR产物(20μL)在1％TAE的琼脂糖凝胶上进行电泳分离。从HincII文库的第二轮PCR中获得大约1.5kb扩增产物。这条带被凝胶纯化、克隆和测序。序列分析表明它与从前面基因组步查得到的序列片段重叠。此外，序列分析还发现了一个编码E2α亚基的核酸序列，它与其它序列具有序列相似性(图16-17)。进一步，序列分析表明编码E2β亚基的核酸序列与其它序列具有序列相似性(图20-21)。
进一步的PCR和序列分析揭示了在含有乳酰辅酶A脱水酶编码序列的区域内多肽编码序列的次序。具体地说，E1GSP1F与COAGSP1R引物对和COAGSP1F与E1GSP1R引物对用来扩增同时编码辅酶A转移酶和E1激活因子多肽的片段。简单地说，以埃氏巨球菌基因组DNA(1ng)为模板，在Perkin Elmer 2400热循环仪上，使用长模板聚合酶(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)进行PCR。所用的PCR程序为：94℃预变性2分钟；然后94℃30秒、61℃45秒和72℃6分钟，共29个循环；最后72℃延伸10分钟。两个PCR产物(20μL)在1％TAE的琼脂糖凝胶上进行电泳分离。使用COAGSP1F和E1GSP1R引物对获得了一个大约1.5kb的扩增产物。该产物被凝胶纯化、克隆和测序(图22)。
含有乳酰辅酶A脱水酶编码序列的埃氏巨球菌操纵子的组织结构经确定，它含有下述多肽的编码序列，按次序分别是：辅酶A转移酶(图6)、ORFX(图23)、乳酰辅酶A脱水酶的E1激活因子蛋白(图10)、乳酰辅酶A脱水酶的E2α亚基(图14)、乳酰辅酶A脱水酶的E2β亚基(图18)和辅酶A脱氢酶的截段(图25)。
从染色体DNA上通过PCR扩增了埃氏巨球菌的乳酰辅酶A脱水酶(或1cd)基因，PCR程序为：94℃预变性2分钟；然后94℃30秒、47℃45秒和72℃3分钟，共7个循环；接着94℃30秒、54℃45秒和72℃3分钟，共25个循环，以及最后72℃延伸7分钟。使用的引物对为：OSNBE1F5’-GGGAATTCCATATGAAAACTGTGTATACTCTC-3’，SEQ ID NO：75和OSNBE1R 5’-CGACGGATCCTTAGAGGATTTCCGAGAAAGC-3’，SEQ ID NO：76。大约3.2kb的扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上分离，从胶上切下，然后用Qiagen凝胶抽提试剂盒(Qiagen Inc.，Valencia，CA)纯化。纯化的产物用NdeI和BamHI限制性内切酶消化，连入用同样酶消化的pET11a载体(Novagen)。把连接反应液转化NovaBlue化学感受态细胞(Novagen)，然后涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂平板上。单一的菌落被分离，通过限制性酶切作图来筛选插入片段的存在。具有正确的限制性酶切图谱的分离的克隆从两端测序以验证连接点的序列，所用引物为Novagen引物(T7启动子引物#69348-3和T7终止子引物#69337-3)。
将有正确插入片段的质粒转化入Tuner(DE3)pLacI化学感受态细胞(Novagen，Madison，WI)。按下述方法检测该构建体的表达情况。过夜培养达到饱和的培养物在第二天早上用含有适当抗生素的新鲜LB培养基稀释20倍。培养物37℃下通气培养至OD600为大约0.6。加入IPTG至终浓度为100μM进行诱导，继续于37℃通气培养2小时。在诱导前和诱导后2小时取样进行SDS-PAGE分析。观察到了具有预期分子量的带(从序列预测的E1亚基分子量为27,024道尔顿，E2α亚基分子量为48,088道尔顿，E2β亚基分子量为42,517道尔顿)。在所含质粒缺少编码乳酰辅酶A脱水酶的这3个组分的核酸的细胞中，没有观察到这些带。
无细胞提取物的制备：细胞在密封的血清瓶中37℃过夜培养，然后使用厌氧技术加入IPTG至1mM进行诱导，并在37℃下继续培养2小时。在严格的厌氧条件下离心收集细胞并超声破壁。超声后的细胞悬浮液离心除去细胞碎片，上清液用于分析。细胞悬浮/超声所用缓冲液为50mM Tris-HCl(pH7.5)、200μMATP，7mM MgSO4、4mMDTT、1mM连二亚硫酸和100μM NADH。
使用MALDI-TOF MS检测脱水酶活性。分析所用缓冲液同前述，加入1mM乳酰辅酶A或1mM乙酰辅酶A以及大约5mg/mL无细胞提取物。在MALDI-TOF MS分析前，样品预先用Sep Pak Vac C18柱(Waters，Inc.)纯化，如实施例1所述。分析了下列两个反应：
1、丙烯酰辅酶A→乳酰辅酶A
2、乳酰辅酶A→丙烯酰辅酶A
在第一个反应中，对照样品在分子量对应于丙烯酰辅酶A(分子量823)处出现一个峰。第一个反应样品中含有转化有编码脱水酶的质粒的细胞的无细胞提取物，在分子量对应于乳酰辅酶A(分子量841)处出现一个主峰。这个结果表明脱水酶活性可以将丙烯酰辅酶A转化为乳酰辅酶A。
为了检测对乳酰辅酶A的脱水酶活性，第二个反应在80％的D2O中进行。对照样品在分子量对应于乳酰辅酶A(分子量841)处出现一个峰。第二个反应样品中含有转化有编码脱水酶的质粒的细胞的无细胞提取物，可以发现乳酰辅酶A的峰位移到了氘化的形式。这个结果表明脱水酶对乳酰辅酶A有活性。此外，这两个反应的结果表明脱水酶可以从两个方向催化乳酰辅酶A←→丙烯酰辅酶A的反应。实施例3、编码具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的多肽的核酸分子的克隆
从橙色绿屈挠菌细胞(ATCC 29365)中分离基因组DNA。简单地说，使用Innova 4230摇床(New Brunswick Scientific；Edison，NJ)，将橙色绿屈挠菌细胞在50mL 920 Chloroflexus培养基中(Falcon 2070聚丙烯管)于50℃培养，使用内部光源。细胞培养后，将其沉淀，用5mL 10mM Tris溶液洗涤，再沉淀收集。从收集的细胞中使用Gentra基因组“Puregene”DNA分离试剂盒(Gentra Systems；Minneapolis，MN)分离基因组DNA。简单地说，将收集的细胞重悬浮于1mL Gentra细胞悬浮液中，加入14.2mg溶菌酶和4μL20mg/mL的蛋白酶K溶液。细胞悬浮液于37℃保温30分钟。3500xg离心25分钟回收沉淀的基因组DNA，空气干燥10分钟。将基因组DNA悬浮于300μL10mM Tris溶液中，4℃保存。
在PCR扩增反应中使用了基因组DNA作为模板，基于巴豆酸酶类似物的保守区和橙色绿屈挠菌的密码子使用表设计了引物。简单地说，设计了两个简并的正向PCR引物(CRF1和CRF2)和三个简并的反向PCR引物(CRR1、CRR2和CRR3)(CRF15’-AAYCGBCCVAARGCNCTSAAYGC-3’，SEQ ID NO：77；CRF25’-TTYGTBGCNGGYGCNGAYAT-3’，SEQ ID NO：78；CRR15’-ATRTCNGCRCCNGCVACRAA-3’，SEQ ID NO：79；CRR25’-CCRCCRCCSAGNGCRWARCCRTT-3’，SEQ ID NO：80；和CRR35’-SSWNGCRATVCGRATRTCRAC-3’，SEQ ID NO：81)。
在PCR中使用了所有逻辑组合的引物和Taq聚合酶(RocheMolecular Biochemicals，Indianapolis，IN)，并在每μL反应混合物中加入1ng基因组DNA。在PCR过程中使用了递减程序，在61℃退火4个循环，59℃退火4个循环，57℃退火4个循环，55℃退火4个循环，和52℃退火16个循环。每一循环中94℃变性30秒和72℃延伸3分钟。起始时在94℃预变性2分钟，结束时在72℃最后延伸4分钟。退火的时间设置为45秒。反应中使用的PCR引物的量比常规PCR中的引物量高4-12倍，这取决于引物3’末端的简并性。此外，使用每个单独引物分开进行了PCR反应，以鉴定从单一简并引物获得的扩增产物。PCR产物(25μL)用1％TAE(Tris-乙酸-EDTA)的琼脂糖凝胶进行电泳分离。
CRF1-CRR1和CRF2-CRR2组合分别产生了大约120bp和大约150bp的独特的带。这些带大小与基于其它物种的巴豆酸酶基因所预期的大小相匹配。在使用单一引物的对照反应中没有观察到120bp或150bp的带。使用Qiagen凝胶抽提试剂盒(Qiagen Inc.，Valencia，CA)分离纯化了这两个片段(即120bp和150bp的带)。把各个纯化的片段(4μL)连接到pCRII载体中，然后通过热激法使用TOPO克隆程序(Invitrogen，Carlsbad，CA)转化到TOP10大肠杆菌细胞中。将转化液涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素(Amp)和50μg/mLX-gal的LB培养基平板上。使单一的白色菌落转移涂布到新鲜的培养基上，使用CRF1与CRR1引物对和CRF2与CRR2引物对在PCR反应中进行筛选，以证实所需插入片段的存在。使用QiaPrep Spin微量制备试剂盒(Qiagen，Inc.)从带有所需插入片段的多个菌落提取质粒DNA，定量鉴定后用M13R和M13F引物进行DNA测序。序列分析的结果表明大约150bp的PCR产物中存在于两个不同的克隆中。每一个都与巴豆酸酶和脱水酶序列具有序列相似性。这两个克隆分别命名为OS17(157bp的PCR产物)和OS19(151bp的PCR产物)。
为获得OS17完整的编码序列使用了基因组步查法。简单地说，利用了157bp位于CRF2和CRR2简并引物内部的部分CRF1-CRR2片段序列设计了用于基因组步查的上游和下游方向引物：OS17F15’-CGCTGATATTCGCCAGTTGCTCGAAG-3’，SEQ ID NO：82；OS17F25’-CCCATCTTGCTTTCCGCAAGATTGAGC-3’，SEQ ID NO：83；OS17F35’-CAATGGCCCTGCCGAATAACGCCCATCT-3’，SEQ ID NO：84；OS17R15’-CTTCGAGCAACTGGCGAATATCAGCG-3’，SEQ IDNO：85；OS17R25’-GCTCAATCTTGCGGAAAGCAAGATGGG-3’，SEQID NO：86；和OS17R35’-AGATGGGCGTTATTCGGCAGGGCCATTG-3’，SEQ ID NO：87。OS17F1、OS17F3和OS17F2引物面向下游，而OS17R2、OS17R3和OS17R1引物面向上游。
使用通用的基因组步查试剂盒(ClonTech Laboratories，Inc.，PaloAlto，CA)来进行基因组步查，除了使用NruI、FspI和HincII酶来产生文库以外。使用Perkin Elmer 2400热循环仪进行第一轮PCR，94℃2秒和72℃3分钟，共7个循环，然后94℃2秒和66℃3分钟，共36个循环，最后66℃延伸4分钟。第二轮PCR采用94℃2秒和72℃3分钟，共5个循环，然后94℃2秒和66℃3分钟，共20个循环，最后66℃延伸4分钟。第一和第二轮扩增产物(5μL)在1％TAE的琼脂糖凝胶上进行电泳分离。在第二轮PCR后，使用FspI文库和OS17R1引物获得反方向的约0.4kb的扩增产物，而使用HincII文库和OS17F2引物获得正方向的约0.6kb的扩增产物。使这些PCR产物克隆和测序。
序列分析表明从基因组步查得到的序列与CRF2-CRR2片段重叠，并与巴豆酸酶和脱水酶序列具有序列相似性。
为了获得更多的序列进行了第二次基因组步查，为此设计了6个引物：OS17F45’-AAGCTGGGTCTGATCGATGCCATTGCTACC-3’，SEQ ID NO：88；OS17F55’-CTCGATTATCGCCCATCCACGTATCGAG-3’，SEQ ID NO：89；OS17F65’-TGGATGCAATCCGCTATGGCATTATCCACG-3’，SEQ ID NO：90；OS17R45’-TCATTCAGTGCGTTCACCGGCGGATTTGTC-3’，SEQ IDNO：91；OS17R55’-TCGATCCGGAAGTAGCGATAGCGTTCGATG-3’，SEQ ID NO：92；和OS17R65’-CTTGGCTGCAATCTCTTCGAGCACTTCAGG-3’，SEQ ID NO：93。OS17F4、OS17F5和OS17F6引物面向下游，而OS17R4、OS17R5和OS17R6引物面向上游。
第二次基因组步查采用与第一次基因组步查同样的方法。第二轮基因组步查后，使用HincII文库和OS17R5引物获得反方向的约2.3kb的扩增产物，而使用PvuII文库和OS17F5引物获得正方向的约0.6kb的扩增产物。把这些PCR产物克隆和测序。序列分析表明从第二次基因组步查得到的序列与第一次基因组步查得到的序列重叠。另外，序列分析表明序列有3572bp。
BLAST检索的结果表明，由该序列编码的多肽与具有3种不同活性的多肽具有序列相似性。具体地说，OS17编码的多肽的前段与辅酶A合成酶具有序列相似性，中间区域与烯脂酰辅酶A脱水酶具有序列相似性，以及后段与辅酶A还原酶具有序列相似性。
使用了4条引物进行第三次基因组步查：OS17UP-6 5’-CATCAGAGGTAATCACCACTCGTGCA-3’，SEQ ID NO：94；OS17UP-75’-AAGTAGTAGGCCACCTCGTCGCCATA-3’，SEQ ID NO：95；OS17DN-15’-GCCAATCAGGCGCTGATCTATGTTCT-3’，SEQ IDNO：96；和OS17DN-25’-CAGATCTATGTTCTGGCCTCGGAGGT-3’，SEQ ID NO：97。OS17UP-6和OS17UP-7引物面向上游，而OS17DN-1和OS17DN-2引物面向下游。使用NruI文库和OS17UP-7引物在第三次基因组步查中获得了约1.2kb的反向扩增产物。此外使用HincII和FspI文库和OS17DN-2引物分别获得了约4kb和约1.1kb的正向扩增产物。序列分析发现了一个编码多肽的核酸序列(图27-28)。OS17的完整基因有5466个核苷酸，编码一条1822个氨基酸的多肽。OS17多肽的分子量从序列计算为201,346(pI＝5.71)。
BLAST检索分析表明，OS17核酸的产物具有3种不同的活性，这是基于：1)OS17序列的前段与辅酶A合成酶具有序列相似性；2)OS17序列的中间区域与3-羟基丙酰辅酶A脱水酶具有序列相似性；和3)OS17序列的后段与辅酶A还原酶具有序列相似性。因此，OS17克隆表现为编码单个酶，该酶能够催化3个不同的反应，将3-羟基丙酸直接转化为丙酰辅酶A：3-羟基丙酸→3-羟基丙酰辅酶A→丙烯酰辅酶A→丙酰辅酶A。
从橙色绿屈挠菌染色体DNA上通过PCR扩增了OS17基因，PCR条件为：94℃预变性3分钟；然后94℃变性30秒、54℃退火30秒和68℃延伸6分钟，共25个循环；最后68℃延伸10分钟。使用的引物对为：OS17F 5’-GGGAATTCCATATGATCGACACTGCG-3’，SEQID NO：136和OS17R 5’-CGAAGGATCCAACGATAATCGGCTCAGCAC-3’，SEQ ID NO：137。产生的PCR产物(约5.6kb)用Qiagen PCR纯化试剂盒(Qiagen Inc.，Valencia，CA)纯化。纯化的产物用NdeI和BamHI限制性内切酶消化，80℃加热20分钟使酶失活，然后用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化，连接到预先用NdeI和BamHI限制性内切酶消化的pET11a载体(Novagen，Madison，WI)。将连接反应液转化NovaBlue化学感受态细胞(Novagen，Madison，WI)，然后涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂平板上。使用OS17F和OS17R引物，按照上述条件直接从克隆细胞中PCR扩增OS17DNA，来逐一筛选转化子。从能够产生5.6kb产物的克隆中使用QiaPrep Spin微量制备试剂盒(Qiagen，Inc.)纯化质粒。得到的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，并诱导OS17多肽的表达。根据SDS凝胶电泳的结果，OS17多肽的表观分子量为大约190,000道尔顿。
OS17多肽功能的分析：1mL过夜培养的BL21-DE3/pET11a-OS17细胞接种到100mL培养液中培养。当生长达到OD为0.5-0.6时，加入100μMIPTG诱导。诱导2.5小时后，在水平离心机中8000rpm离心收集细胞。细胞用10mMTris-HCl(pH7.8)洗涤，并在1000psi压力下两次通过French Press破壁。15,000rpm离心除去细胞碎片。OS17多肽的活性用分光光度法测定，以及在酶促转化过程中形成的产物用LC/MS检测。分析混合液如下(J.Bacteriol.，181：1088-1098(1999))：
试剂                      体积                  终浓度
Tris-HCl
                          10μL                 50μM
(1000mM，pH7.8)
MgCl2(100mM)             10μL                 5μM
ATP(30mM)                 20μL                 3μM
KCl(100mM)                20μL                 10μM
CoASH(5mM)                20μL                 0.5μM
NAD(P)H                   20μL                 0.5μM
3-羟基丙酸                2μL                  1μM
蛋白提取
(7mg/mL)                  20(40)μL             140μg
去离子水                  78(58)μL
合计                      200μL
通过在340nm处检测NAD(P)H的消失来测定反应的起始速度。以3-羟基丙酸为底物来测定OS17多肽的活性。使用实施例1中所述的公式来计算每mL总蛋白中的活力单位数。表达的OS17多肽的活力经计算为0.061U/mL总蛋白。使用Sep Pak Vac柱(Waters)纯化反应产物。柱子用1mL甲醇进行调节，然后用0.5mL0.1％的TFA再洗两次。样品用200μL40％乙腈、0.1％TFA洗脱。通过真空离心除去样品中的乙腈。用LC/MS分析反应产物。
使用Waters/Micromass ZQ LC/MS仪来分析上述反应中的硫酯，即丙酰辅酶A、丙烯酰辅酶A和3-羟基丙酰辅酶A，该仪器连有一台Waters 2690液相色谱仪，在色谱仪与单个四极质谱仪间串联放置一个Waters 996发光二极管阵列(PDA)。使用4.6×150mm YMCods-AQ(3μm微粒，120_孔径)反相色谱柱在室温下进行液相色谱(LC)分离。使用缓冲液A(25mM乙酸铵，0.5％乙酸)和线性梯度的缓冲液B(乙腈，0.5％乙酸)洗脱辅酶A的酯。所用流速为0.25mL/min，在200nm到400nm间监测发光二极管阵列紫外(UV)吸收值。基于目的分析物的质子化分子离子([M+H]+)的产生和特征性片段离子的形成，对电喷射质谱(MS)系统的所有参数进行最适化和选择。在使用ESI-MS检测正离子状态的辅酶A和有机酸辅酶A硫酯时，仪器参数设置如下：提取器：1V；RF透镜：0V；源温度：100℃；去溶剂化温度：300℃；去溶剂化气体：500L/小时；锥体气体：40L/小时；低质量分辨率：13.0；高质量分辨率：14.5；离子能量：0.5；放大倍数：650。荷质比(m/z)和分子量的不确定度为±0.01％。
从表达OS17多肽的菌株中获得的酶分析混合物表现出丙酰辅酶A、丙烯酰辅酶A和3-羟基丙酰辅酶A的峰，其中丙酰辅酶A的峰为主峰。使用带有不含插入片段的pET11a载体的对照菌株，酶分析混合物中没有这些峰。这些结果表明，OS17多肽具有辅酶A合成酶、辅酶A脱水酶和脱氢酶活性。
为获得OS19完整的编码序列也使用了基因组步查法。简单地说，利用了位于简并引物内部的部分151bp的CRF2-CRR2片段序列设计了用于基因组步查的上游和下游方向引物：OS19F15’-GGCTGATATCAAAGCGATGGCCAATGC-3’，SEQ ID NO：98；OS19F25’-CCACGCCTATTGATATGCTCACCAGTG-3’，SEQ ID NO：99；OS19F35’-GCAAACCGGTGATTGCTGCCGTGAATGG-3’，SEQ ID NO：100；OS19R15’-GCATTGGCCATCGCTTTGATATCAGCC-3’，SEQ IDNO：101；OS19R2 5’-CACTGGTGAGCATATCAATAGGCGTGG-3’，SEQID NO：102 ；和OS19R35’-CCATTCACGGCAGCAATCACCGGTTTGC-3’，SEQ ID NO：103。OS19F1、OS19F2和OS19F3引物面向下游，而OS19R1、OS19R2和OS19R3引物面向上游。
使用FspI文库和OS19R1引物获得一个约0.25kb的扩增产物，而使用PvuII文库和OS19R1引物获得约0.65kb的扩增产物，此外，使用PvuII文库和OS19F3引物获得约0.4kb的扩增产物。使PCR产物克隆和测序。序列分析表明从基因组步查得到的序列与CRF2-CRR2片段重叠，并与巴豆酸酶和脱水酶序列具有序列相似性。所得到的序列占据了编码序列的大部分，包括起始密码子。
为了获得更多的序列进行了第二次基因组步查，使用了两个引物：OS19F75’-TCATCATCGCCAGTGAAAACGCGCAGTTCG-3’，SEQID NO：104；和OS19F8 5’-GGATCGCGCAAACCATTGCCACCAAATCAC-3’，SEQ ID NO：105。OS19F7和OS19F8引物面向下游。
使用PvuII文库获得了一个约0.7kb的扩增产物，将该PCR产物克隆和测序。序列分析表明从第二次基因组步查得到的序列与第一次基因组步查得到的序列重叠，并含有终止密码子。全长的OS19克隆发现与其它序列如巴豆酸酶和烯脂酰辅酶A脱水酶序列具有序列相似性(图32-33)。
OS19克隆发现编码了一条具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶，也称为丙烯酰辅酶A脱水酶活性的多肽。从橙色绿屈挠菌染色体DNA上通过PCR扩增了编码OS19脱水酶的核酸，PCR条件为：94℃预变性3分钟；然后94℃变性30秒、56℃退火30秒和68℃延伸1分钟，共25个循环；以及最后68℃延伸5分钟。使用的引物对为：OSACH35’-ATGAGTGAAGAGTCTCTGGTTCTCAGC-3’，SEQ IDNO：106；和OSACH25’-AGATCGCAATCGCTCGTGTATGTC-3’，SEQID NO：107。
产生的PCR产物(约1.2kb)通过琼脂糖凝胶电泳分离，并用QiagenPCR纯化试剂盒(Qiagen Inc.，Valencia，CA)纯化。纯化的产物使用高效平末端克隆试剂盒(Novagen，Madison，WI)连接到pETBlue-1中。用连接反应液转化NovaBlue化学感受态细胞(Novagen，Madison，WI)，然后涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素、40μg/mL IPTG和40μg/mLX-Gal的LB琼脂平板上。把白色的菌落分离，通过限制性酶切作图来筛选插入片段的存在。具有正确的限制性酶切图谱的分离的克隆从两端测序以验证连接点的序列，所用引物为pETBlueUP和pETBlueDOWN引物(Novagen)。
将含有OS19脱水酶编码序列的质粒转化入Tuner(DE3)pLacI化学感受态细胞(Novagen，Madison，WI)，然后检测构建体的表达情况。简而言之，过夜培养达到饱和的培养液在第二天早上用含有适当抗生素的新鲜LB培养基稀释20倍，37℃、250rpm培养至OD600为大约0.6。加入IPTG至终浓度为1mM进行诱导，继续于37℃、250rpm培养2小时。在诱导前和诱导后2小时取样进行SDS-PAGE分析。观察到了具有预期分子量的带(从序列预测的分子量为27,336道尔顿)。在所含质粒缺少编码脱水酶的核酸的细胞中，没有观察到这条带。
按照前述方法从生长细胞制备无细胞提取物。离心收集细胞，超声破壁；超声的细胞悬浮液离心以除去细胞碎片，上清液用于酶活分析。使用MALDI-TOF MS测定了3-羟基丙酰辅酶A脱水酶催化下列3个反应的能力：
1、丙烯酰辅酶A→3-羟基丙酰辅酶A
2、3-羟基丙酰辅酶A→丙烯酰辅酶A
3、巴豆酰辅酶A→3-羟基丁酰辅酶A
分析混合液含有50mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM辅酶A的酯和大约1μg无细胞提取物。反应在室温进行，加入1倍体积的10％三氟乙酸(TFA)终止反应。在MALDI-TOF MS分析前反应混合物先用SepPak Vac C18 50mg柱(Waters，Inc.)纯化。柱子用1mL甲醇进行调节，然后用1mL0.1％的TFA洗两次来平衡。柱子上样后，弃去穿透液，然后用1mL0.1％的TFA洗两次。样品用200μL40％乙腈、0.1％TFA洗脱。真空离心以除去乙腈。将样品与110mM芥子酸的0.1％TFA、67％乙腈的溶液1∶1混合，从而获得可用于MALDI-TOF MS分析的样品。让样品进行空气干燥。
使用MALDI-TOF MS技术检测到3-羟基丙酰辅酶A脱水酶催化了丙烯酰辅酶A转化为3-羟基丙酰辅酶A。在第一个反应中，对照样品在分子量对应于丙烯酰辅酶A(分子量823)处出现一个大峰。第一个反应样品中含有转化有编码3-羟基丙酰辅酶A脱水酶的质粒的细胞的无细胞提取物，在分子量对应于3-羟基丙酰辅酶A(分子量841)处出现一个主峰。这个结果表明3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性催化了第一个反应。
为了检测从3-羟基丙酰辅酶A到丙烯酰辅酶A的转化，第二个反应在80％的D2O中进行。第二个反应样品中含有转化有编码3-羟基丙酰辅酶A脱水酶的质粒的细胞的细胞提取物，可以发现氘整合到了3-羟基丙酰辅酶A分子中。这个结果表明3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性催化了第二个反应。此外，第一和第二个反应的结果表明3-羟基丙酰辅酶A脱水酶可以从两个方向催化3-羟基丙酰辅酶A←→丙烯酰辅酶A的反应。值得注意的是在第一和第二个反应中都观察到了位于分子量811处的一个峰，它来自于从3-羟基丙酸和乙酰辅酶A合成3-羟基丙酰辅酶A时剩余的乙酰辅酶A。
评估巴豆酰辅酶A到3-羟基丁酰辅酶A的转化的分析也在80％的D2O中进行。在第三个反应中，对照样品在分子量对应于巴豆酰辅酶A(分子量837)处出现一个主峰。这个结果表明巴豆酰辅酶A没有转化为其它产物。第三个反应样品中含有用编码3-羟基丙酰辅酶A脱水酶的质粒转化的细胞的无细胞提取物，在分子量对应于氘化的3-羟基丁酰辅酶A(分子量855到857)处出现一组扩散的峰。这个结果表明3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性催化了第三个反应。
为了证实3-羟基丙酰辅酶A脱水酶的特异性，进行了一系列对照反应。在含和不含3-羟基丙酰辅酶A脱水酶时，向100mM Tris(pH7.0)的反应混合物中加入1mM乳酰辅酶A。在两种情况下，观察到的主峰具有对应于乳酰辅酶A的分子量(分子量841)。这个结果表明乳酰辅酶A不受3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性存在的影响，即使是有D2O存在的情况下，这意味着3-羟基丙酰辅酶A脱水酶不附着位于α碳位置的羟基。在80％的D2O的反应混合物中含有3-羟基丙酰辅酶A，加入3-羟基丙酰辅酶A脱水酶后引起了位移。在不含3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性时，除了分子量为811的峰以外，还观察到了对应于3-羟基丙酰辅酶A的峰。分子量811的峰是由于合成3-羟基丙酰辅酶A时剩余的乙酰辅酶A。在含有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性时，观察到了对应于氘化的3-羟基丙酰辅酶A(分子量842)的峰，这是由于在从3-羟基丙酰辅酶A到丙烯酰辅酶A的反应及逆反应的过程中羟基的交换。这些对照反应表明，3-羟基丙酰辅酶A脱水酶对3-羟基丙酰辅酶A有活性，对乳酰辅酶A没有活性。此外，这些结果还表明丙烯酰辅酶A反应的产物是3-羟基丙酰辅酶A而不是乳酰辅酶A。
实施例4、操纵子#1的构建
构建了下述操纵子，它可用于在大肠杆菌中生产3-羟基丙酸(图34)。简单地说，该操纵子克隆在pET-11a表达载体(Novagen，Madison，WI)中，置于T7启动子控制之下。pET-11a表达载体是一个5677bp的质粒，使用NdeI限制性内切酶位点的ATG序列作为插入的下游序列的起始密码子。
使用PCR方法从埃氏巨球菌基因组DNA扩增了编码辅酶A转移酶和乳酰辅酶A脱水酶的核酸分子。用于扩增辅酶A转移酶编码序列的两种引物为：OSNBpctF5’-GGGAATTCCATATGAGAAAAGTAGAAATCATTACAGCTG-3’，SEQID NO：108和OSCTE-25’-GAGAGTATACACAGTTTTCACCTCCTTTACAGCAGAGAT-3’，SEQ ID NO：109；而用于扩增乳酰辅酶A脱水酶编码序列的两种引物为：OSCTE-15’-ATCTCTGCTGTAAAGGAGGTGAAAACTGTGTATACTCTC-3’，SEQID NO：110和OSEBH-25’-ACGTTGATCTCCTTGTACATTAGAGGATTTCCGAGAAAGC-3’，SEQ ID NO：111。使用PCR方法从橙色绿屈挠菌基因组DNA扩增了编码3-羟基丙酰辅酶A脱水酶的核酸分子，所用两种引物为：OSEBH-15’-GCTTTCTCGGAAATCCTCTAATGTACAAGGAGATCAACGT-3’，SEQID NO：112和OSHBR5’-CGACGGATCCTCAACGACCACTGAAGTTGG-3’，SEQ ID NO：113。
在Perkin Elmer 2400热循环仪中，以100ng基因组DNA为模板，使用rTth聚合酶(Applied Biosystems；Foster City，CA)和Pfu Turbo聚合酶(Stratagene；La Jolla，CA)以8∶1的混合物来进行PCR。这种混合的聚合酶可以使PCR反应具有较高的保真度。PCR条件如下：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒、54℃退火30秒和68℃延伸2分钟，共20个循环；以及最后68℃延伸5分钟。使用Qiagen凝胶抽提试剂盒(Qiagen，Inc.；Valencia，CA)将获得的PCR产物进行凝胶纯化。
使用PCR将辅酶A转移酶、乳酰辅酶A脱水酶(E1、E2α亚基和E2β亚基)和3-羟基丙酰辅酶A脱水酶的PCR产物装配起来。OSCTE-1和OSCTE-2引物以及OSEBH-1和OSEBH-2引物彼此互补。因此，在PCR反应过程中互补的DNA末端能够彼此退火，从两个方向延伸DNA。装配PCR反应混合物中含有PCR产物(即辅酶A转移酶、乳酰辅酶A脱水酶和3-羟基丙酰辅酶A脱水酶PCR反应的产物)各100ng以及上述的rTth聚合酶/Pfu Turbo聚合酶混合物，向其中加入两个末端引物(OSNBpctF和OSHBR)，以确保装配的效率。用于装配产物的PCR反应条件为：94℃预变性1分钟；94℃变性30秒、55℃退火30秒和68℃延伸6分钟，共25个循环；以及最后68℃延伸7分钟。将装配的PCR产物进行凝胶纯化，并用限制性内切酶(NdeI和BamHI)消化。这些限制性内切酶位点是由OSNBpctF引物(NdeI)和OSHBR引物(BamHI)引入到装配的PCR产物中的。消化后的PCR产物在80℃加热30分钟以使限制性内切酶失活，然后直接用来连接到pET11a载体中。
pET11a载体以NdeI和BamHI限制性内切酶消化，用Qiagen凝胶抽提试剂盒进行凝胶纯化，经虾碱性磷酸酶(Roche MolecularBiochemicals；Indianapolis，IN)处理，然后与装配的PCR产物一起用于连接反应。使用T4连接酶(Roche Molecular Biochemicals；Indianapolis，IN)在16℃下连接过夜。使用热激法将所得的连接反应液转化NovaBlue化学感受态细胞(Novagen，Madison，WI)。热激后，把细胞涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的LB平板上。使用QiaPrepSpin微量制备试剂盒(Qiagen，Inc.；Valencia，CA)从每个菌落中纯化质粒DNA，并用NdeI和BamHI限制性内切酶消化进行分析。
实施例5、操纵子#2的构建
构建了下述操纵子，它可用于在大肠杆菌中生产3-羟基丙酸(图35A和B)。使用PCR方法从埃氏巨球菌基因组DNA扩增了编码辅酶A转移酶和乳酰辅酶A脱水酶的核酸分子。用于扩增辅酶A转移酶编码序列的两种引物为：OSNBpctF和OSCTE-2；而用于扩增乳酰辅酶A脱水酶编码序列的两种引物为：OSCTE-1和OSNBe1R5’-CGACGGATCCTTAGAGGATTTCCGAGAAAGC-3’，SEQ ID NO：114。使用PCR方法从橙色绿屈挠菌基因组DNA扩增了编码3-羟基丙酰辅酶A脱水酶的核酸分子，所用两种引物为：OSXNhF5’-GGTGTCTAGAGACAGTCCTGTCGTTTATGTAGAAGGAG-3’，SEQ IDNO：115和OSXNhR5’-GGGAATTCCATATGCGTAACTTCCTCCTGCTATCAACGACCACTGAAGTTGG-3’，SEQ ID NO：116。
在Perkin Elmer 2400热循环仪中，以100ng基因组DNA为模板，使用rTth聚合酶(Applied Biosystems；Foster City，CA)和Pfu Turbo聚合酶(Stratagene；La Jolla，CA)以8∶1的混合物来进行PCR。这种混合的聚合酶可以使PCR反应具有较高的保真度。PCR条件如下：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒、54℃退火30秒和68℃延伸2分钟，共20个循环；以及最后68℃延伸5分钟。使用Qiagen凝胶抽提试剂盒(Qiagen，Inc.；Valencia，CA)将获得的PCR产物进行凝胶纯化。
使用PCR将辅酶A转移酶和乳酰辅酶A脱水酶(E1、E2α亚基和E2β亚基)的PCR产物装配起来。OSCTE-1和OSCTE-2引物彼此互补。因此，在PCR反应过程中，辅酶A转移酶序列末端的22个核苷酸与乳酰辅酶A脱水酶起始端的22个核苷酸能够彼此退火，从两个方向延伸DNA。装配PCR反应混合物中含有辅酶A转移酶和乳酰辅酶A脱水酶PCR反应的产物各100ng和上述的rTth聚合酶/Pfu Turbo聚合酶混合物，向其中加入两个末端引物(OSNBpctF和OSHBelR)，以确保装配的效率。用于装配产物的PCR反应条件为：94℃预变性1分钟；94℃变性30秒、54℃退火30秒和68℃延伸5分钟，共20个循环；以及最后68℃延伸6分钟。
将装配的PCR产物进行凝胶纯化，并用限制性内切酶(NdeI和BamHI)消化。这些限制性内切酶位点是由OSNBpctF引物(NdeI)和OSHBelR引物(BamHI)引入到装配的PCR产物中的。消化后的PCR产物在80℃加热30分钟以使限制性内切酶失活，然后直接用来连接到pET11a载体中。
pET11a载体以NdeI和BamHI限制性内切酶消化，用Qiagen凝胶抽提试剂盒进行凝胶纯化，经虾碱性磷酸酶(Roche MolecularBiochemicals；Indianapolis，IN)处理，然后与装配的PCR产物一起用于连接反应。使用T4连接酶(Roche Molecular Biochemicals；Indianapolis，IN)在16℃下连接过夜，使用热激法将所得的连接反应液转化NovaBlue化学感受态细胞(Novagen，Madison，WI)。热激后，将细胞涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的LB平板上。使用QiaPrepSpin微量制备试剂盒(Qiagen，Inc.；Valencia，CA)从每个菌落中纯化质粒DNA，由NdeI和BamHI限制性内切酶消化进行分析。消化结果表明含有辅酶A转移酶和乳酰辅酶A脱水酶编码序列的DNA片段被克隆到pET11a载体中了。
用XbaI和NdeI消化带有辅酶A转移酶和乳酰辅酶A脱水酶编码序列的质粒，凝胶纯化，然后用于在辅酶A转移酶编码序列上游克隆3-羟基丙酰辅酶A脱水酶编码产物。因为用XbaI和NdeI消化消除了pET11a载体上的核糖体结合位点(RBS)，因此在质粒中伴随着3-羟基丙酰辅酶A脱水酶编码产物克隆了一个新的同源性核糖体结合位点。简单地说，用XbaI和NdeI限制性内切酶消化编码3-羟基丙酰辅酶A脱水酶的PCR产物，65℃加热30分钟以使限制性内切酶失活，然后连接到pTD载体中。连接反应混合液转化NovaBlue化学感受态细胞(Novagen，Madison，WI)，然后涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的LB平板上。
对克隆进行逐一筛选，并用QiaPrep Spin微量抽提试剂盒纯化质粒。所得质粒用XbaI和NdeI限制性内切酶消化，通过凝胶电泳进行分析。含有编码3-羟基丙酰辅酶A脱水酶的PCR产物插入片段的pTD载体命名为pHTD。pHTD中乳酰辅酶A脱水酶、辅酶A转移酶和3-羟基丙酰辅酶A脱水酶序列的表达由单一的T7启动子指导，每个编码序列在其起始密码子上游有单独的核糖体结合位点(RBS)。
为了确保乳酰辅酶A脱水酶、辅酶A转移酶和3-羟基丙酰辅酶A脱水酶序列正确装配和克隆在一个操纵子中，对操纵子的两端和所有编码序列间的连接进行了序列测定。DNA分析结果表明该操纵子装配正确。
将pHTD质粒转入BL21(DE3)细胞以研究编码序列的表达。实施例6、操纵子#3和#4的构建
操纵子#3(图36A和B)和操纵子#4(图37A和B)中各有E1激活因子位于操纵子的一端。操纵子3#在3-羟基丙酰辅酶A脱水酶编码序列和E1激活因子编码序列之间含有一个核糖体结合位点。而在操纵子#4中，3-羟基丙酰辅酶A脱水酶编码序列的终止密码子和E1激活因子编码序列的起始密码子如下发生了融合：TAGTG。在操纵子#4中缺少核糖体结合位点可以降低E1激活因子的表达水平。
为构建操纵子#3，使用PCR方法从埃氏巨球菌基因组DNA扩增了编码辅酶A转移酶和乳酰辅酶A脱水酶的核酸分子。用于扩增辅酶A转移酶编码序列的两种引物为：OSNBpctF和OSHTR5’-ACGTTGATCTCCTTCTACATTATTTTTTCAGTCCCATG-3’，SEQ IDNO：117；用于扩增乳酰辅酶A脱水酶编码序列的E2α和E2β亚基的两种引物为：OSEIIXNF5’-GGTGTCTAGAGTCAAAGGAGAGAACAAAATCATGAGTG-3’，SEQID NO：118和OSEIIXNR5’-GGGAATTCCATATGCGTAACTTCCTCCTGCTATTAGAGGATTTCCGAGAAAGC-3’，SEQ ID NO：119；以及用于扩增乳酰辅酶A脱水酶编码序列的E1激活因子的两种引物为：OSHrEIF5’-TCAGTGGTCGTTGATCACGCTATAAAGAAAGGTGAAAACTGTGTATACTCTC-3’，SEQ ID NO：120和OSEIBR5’-CGACGGATCCCTTCCTTGGAGCTCATGCTTTC-3’，SEQ ID NO：121。使用PCR方法从橙色绿屈挠菌基因组DNA扩增了编码3-羟基丙酰辅酶A脱水酶的核酸分子，所用两种引物为：OSTHF5’-CATGGGACTGAAAAAATAATGTAGAAGGAGATCAACGT-3’，SEQ IDNO：122和OSEIrHR5’-GAGAGTATACACAGTTTTCACCTTTCTTTATAGCGTGATCAACGACCACTGA-3’，SEQ ID NO：123。
在Perkin Elmer 2400热循环仪中，以100ng基因组DNA为模板，使用rTth聚合酶(Applied Biosystems；Foster City，CA)和Pfu Turbo聚合酶(Stratagene；La Jolla，CA)以8∶1的混合物来进行PCR。这种混合的聚合酶可以使PCR反应具有较高的保真度。PCR条件如下：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒、54℃退火30秒和68℃延伸2分钟，共20个循环；以及最后68℃延伸5分钟。使用Qiagen凝胶抽提试剂盒(Qiagen，Inc.；Valencia，CA)将获得的PCR产物进行凝胶纯化。
使用PCR将3-羟基丙酰辅酶A脱水酶和E1激活因子的PCR产物装配起来。OSHrE1F和OSE1rHR引物彼此互补。因此，在PCR反应过程中，这两条引物能够彼此退火，从两个方向延伸DNA。装配PCR反应混合物中含有100ng3-羟基丙酰辅酶A脱水酶的PCR产物、100ngE1激活因子的PCR产物和上述的rTth聚合酶/Pfu Turbo聚合酶混合物，向其中加入两个末端引物(OSTHF和OSE1BR)，以确保装配的效率。用于装配产物的PCR反应条件为：94℃预变性1分钟；94℃变性30秒、54℃退火30秒和68℃延伸1.5分钟，共20个循环；以及最后68℃延伸5分钟。
将装配的PCR产物进行凝胶纯化，与凝胶纯化的辅酶A转移酶PCR产物一起，用于第二个装配PCR。OSTHF和OSHTR引物彼此互补。因此，在PCR反应过程中，互补的DNA末端能够彼此退火，从两个方向延伸DNA。装配PCR反应混合物中含有100ng纯化的3-羟基丙酰辅酶A脱水酶/E1的PCR产物100ng、纯化的辅酶A转移酶的PCR产物和上述的聚合酶混合物，向其中加入两个末端引物(OSNBpctF和OSEIBR)，以确保装配的效率。用于装配产物的PCR反应条件为：94℃预变性1分钟；94℃变性30秒、54℃退火30秒和68℃延伸3分钟，共20个循环；以及最后68℃延伸5分钟。
将装配的PCR产物进行凝胶纯化，用限制性内切酶NdeI和BamHI消化。这些限制性内切酶位点是由OSNBpctF引物(NdeI)和OSEIBR引物(BamHI)引入到装配的PCR产物中的。消化后的PCR产物在80℃加热30分钟使限制性内切酶失活，然后直接用来连接到pET11a载体中。
pET11a载体以NdeI和BamHI限制性内切酶消化，用Qiagen凝胶抽提试剂盒进行凝胶纯化，经虾碱性磷酸酶(Roche MolecularBiochemicals；Indianapolis，IN)处理，然后与装配的PCR产物一起用于连接反应。使用T4连接酶(Roche Molecular Biochemicals；Indianapolis，IN)在16℃下连接过夜。使用热激法将所得的连接反应液转化NovaBlue化学感受态细胞(Novagen，Madison，WI)。热激后，把细胞涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的LB平板上。使用QiaPrepSpin微量抽提试剂盒(Qiagen，Inc.；Valencia，CA)从每个菌落中纯化质粒DNA。所得的带有辅酶A转移酶、3-羟基丙酰辅酶A脱水酶和E1激活因子序列的质粒(pTHrE1)用XbaI和NdeI限制性内切酶消化，使用凝胶电泳和Qiagen凝胶抽提试剂盒进行纯化，然后用作载体来克隆E2α亚基/E2β亚基PCR产物。
用同样的酶消化E2α亚基/E2β亚基PCR产物，然后连接到pTHrE1载体上。使用T4连接酶(Roche Molecular Biochemicals；Indianapolis，IN)在16℃下连接过夜。将所得的连接反应液转化NovaBlue化学感受态细胞(Novagen，Madison，WI)，然后把细胞涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的LB平板上。使用QiaPrep Spin微量抽提试剂盒(Qiagen，Inc.；Valencia，CA)从每个菌落中纯化质粒DNA，用XbaI和NdeI限制性内切酶消化并进行凝胶电泳分析。最后使得到的带有操纵子#3的质粒(pEIITHrEI)转入BL21(DE3)细胞以研究克隆序列的表达。电喷射质谱分析证实，这些细胞的提取物具有辅酶A转移酶活性和3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性。同样的分析还用于证实了这些细胞的提取物也具有乳酰辅酶A脱水酶活性。
为了构建操纵子#4，使用PCR方法从埃氏巨球菌基因组DNA扩增了编码辅酶A转移酶和乳酰辅酶A脱水酶的核酸分子。用于扩增辅酶A转移酶编码序列的两种引物为：OSNBpctF和OSHTR；用于扩增乳酰辅酶A脱水酶编码序列的E2α和E2β亚基的两种引物为：OSEIIXNF和OSEIIXNR；以及用于扩增乳酰辅酶A脱水酶编码序列的E1激活因子的两种引物为：OSHEIF5’-CCAACTTCAGTGGTCGTTAGTGAAAACTGTGTATACTCTC-3’，SEQ ID NO：124和OSEIBR。使用PCR方法从橙色绿屈挠菌基因组DNA扩增了编码3-羟基丙酰辅酶A脱水酶的核酸分子，所用两种引物为：OSTHF和OSEIHR5’-GAGAGTATACACAGTTTTCACTAACGACCACTGAAGTTGG-3’，SEQ ID NO：125。
在Perkin Elmer 2400热循环仪中，以100ng基因组DNA为模板，使用rTth聚合酶(Applied Biosystems；Foster City，CA)和Pfu Turbo聚合酶(Stratagene；La Jolla，CA)以8∶1的混合物来进行PCR。这种混合的聚合酶可以使PCR反应具有较高的保真度。PCR条件如下：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒、54℃退火30秒和68℃延伸2分钟，共20个循环；以及最后68℃延伸5分钟。使用Qiagen凝胶抽提试剂盒(Qiagen，Inc.；Valencia，CA)将获得的PCR产物进行凝胶纯化。
使用PCR将3-羟基丙酰辅酶A脱水酶和E1激活因子的PCR产物装配起来。OSHEIF和OSEIHR引物彼此互补。因此，在PCR反应过程中，这两条引物能够彼此退火，从两个方向延伸DNA。装配PCR反应混合物中含有100ng3-羟基丙酰辅酶A脱水酶的PCR产物、100ngE1激活因子的PCR产物和上述的rTth聚合酶/Pfu Turbo聚合酶混合物，向其中加入两个末端引物(OSTHF和OSE1BR)，以确保装配的效率。用于装配产物的PCR反应条件为：94℃预变性1分钟；94℃变性30秒、54℃退火30秒和68℃延伸1.5分钟，共20个循环；以及最后68℃延伸5分钟。
将装配的PCR产物进行凝胶纯化，与凝胶纯化的辅酶A转移酶PCR产物一起，用于第二个装配PCR。OSTHF和OSHTR引物彼此互补。因此，在PCR反应过程中，互补的DNA末端能够彼此退火，从两个方向延伸DNA。装配PCR反应混合物中含有100ng纯化的3-羟基丙酰辅酶A脱水酶/E1的PCR产物、100ng纯化的辅酶A转移酶的PCR产物和上述的聚合酶混合物，向其中加入两个末端引物(OSNBpctF和OSEIBR)，以确保装配的效率。用于装配产物的PCR反应条件为：94℃预变性1分钟；94℃变性30秒、54℃退火30秒和68℃延伸3分钟，共20个循环；以及最后68℃延伸5分钟。
将装配的PCR产物进行凝胶纯化，并用限制性内切酶NdeI和BamHI消化。这些限制性内切酶位点是由OSNBpctF引物(NdeI)和OSEIBR引物(BamHI)引入到装配的PCR产物中的。消化后的PCR产物在80℃加热30分钟使限制性内切酶失活，然后直接用来连接到pET11a载体中。
pET11a载体以NdeI和BamHI限制性内切酶消化，用Qiagen凝胶抽提试剂盒进行凝胶纯化，经虾碱性磷酸酶(Roche MolecularBiochemicals；Indianapolis，IN)处理，然后与装配的PCR产物一起用于连接反应。使用T4连接酶(Roche Molecular Biochemicals；Indianapolis，IN)在16℃下连接过夜。使用热激法将所得的连接反应液转化NovaBlue化学感受态细胞(Novagen，Madison，WI)。热激后，把细胞涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的LB平板上。使用QiaPrepSpin微量抽提试剂盒(Qiagen，Inc.；Valencia，CA)从每个克隆中纯化质粒DNA。所得的带有辅酶A转移酶、3-羟基丙酰辅酶A脱水酶和E1激活因子序列的质粒(pTHE1)用XbaI和NdeI限制性内切酶消化，使用凝胶电泳和Qiagen凝胶抽提试剂盒进行纯化，然后用作载体来克隆E2α亚基/E2β亚基PCR产物。
用同样的酶消化E2α亚基/E2β亚基PCR产物，然后连接到pTHE1载体。使用T4连接酶(Roche Molecular Biochemicals；Indianapolis，IN)在16℃下连接过夜。将所得的连接反应液转化NovaBlue化学感受态细胞(Novagen)，然后将细胞涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的LB平板上。使用QiaPrep Spin微量抽提试剂盒(Qiagen，Inc.；Valencia，CA)从每个克隆中纯化质粒DNA，用XbaI和NdeI限制性内切酶消化并进行凝胶电泳分析。最后使得到的带有操纵子#4的质粒(pEIITHEI)转入BL21(DE3)细胞以研究克隆序列的表达。电喷射质谱分析证实，这些细胞的提取物具有辅酶A转移酶活性和3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性。同样的分析还用来证实这些细胞的提取物也具有乳酰辅酶A脱水酶活性。
以NruI、XbaI和BamHI限制性内切酶消化带有合成的3-羟基丙酸操纵子的大肠杆菌质粒pEIITHrEI，使用Qiagen凝胶抽提试剂盒(Qiagen，Inc.；Valencia，CA)对XbaI-BamHIDNA片段进行凝胶纯化，并用于进一步克隆在芽孢杆菌载体pWH1520(MoBiTec BmBH，Gottingen，Germany)中。pWH1520载体用SpeI和BamHI限制性内切酶消化，使用Qiagen凝胶抽提试剂盒进行凝胶纯化。使用T4连接酶将带有3-羟基丙酸操纵子的XbaI-BamHI片段连接到pWH1520载体中，16℃下反应过夜。连接混合液转化TOP10化学感受态细胞，然后将细胞涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的LB平板上。一个命名为巨大芽孢杆菌(B.Megaterium)(pBPO26)的克隆用来分析辅酶A转移酶和辅酶A脱水酶活性。分析按前述用于大肠杆菌的方法进行。酶活分别为5U/mg和13U/mg。
实施例7、两个质粒系统的构建
构建了下述结构，它可用于在大肠杆菌中生产3-羟基丙酸(图38A和B)。使用PCR方法从埃氏巨球菌基因组DNA扩增了编码辅酶A转移酶和乳酰辅酶A脱水酶的核酸分子。用于扩增辅酶A转移酶编码序列的两种引物为：OSNBpctF和OSHTR；用于扩增乳酰辅酶A脱水酶编码序列的E2α和β亚基的两种引物为：OSEIIXNF和OSEIIXNR；以及用于扩增乳酰辅酶A脱水酶编码序列的E1激活因子的两种引物为：E1PROF5’-GTCGCAGAATTCCCATCAATCGCAGCAATCCCAAC-3’，SEQ IDNO：126和E1PROR5’-TAACATGGTACCGACAGAAGCGGACCAGCAAACGA-3’，SEQ IDNO：127。使用PCR方法从橙色绿屈挠菌基因组DNA扩增了编码3-羟基丙酰辅酶A脱水酶的核酸分子，所用两种引物为：OSTHF和OSHBR5’-CGACGGATCCTCAACGACCACTGAAGTTGG-3’，SEQ IDNO：128 。
在Perkin Elmer 2400热循环仪中，以100ng基因组DNA为模板，使用rTth聚合酶(Applied Biosystems；Foster City，CA)和Pfu Turbo聚合酶(Stratagene；La Jolla，CA)以8∶1的混合物来进行PCR。这种混合的聚合酶可以使PCR反应具有较高的保真度。PCR条件如下：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒、54℃退火30秒和68℃延伸2分钟，共20个循环；以及最后68℃延伸5分钟。使用Qiagen凝胶抽提试剂盒(Qiagen，Inc.；Valencia，CA)将获得的PCR产物进行凝胶纯化。
使用PCR将辅酶A转移酶和3-羟基丙酰辅酶A脱水酶的PCR产物装配起来。OSTHF和OSHTR引物彼此互补。因此，在PCR反应过程中，互补的DNA末端能够彼此退火，从两个方向延伸DNA。装配PCR反应混合物中含有100ng纯化的辅酶A转移酶的PCR产物、100ng纯化的3-羟基丙酰辅酶A脱水酶的PCR产物和上述的聚合酶混合物，向其中加入两个末端引物(OSNBpctF和OSHBR)，以确保装配的效率。用于装配产物的PCR反应条件为：94℃预变性1分钟；94℃变性30秒、54℃退火30秒和68℃延伸2.5分钟，共20个循环；以及最后68℃延伸5分钟。
将装配的PCR产物进行凝胶纯化，并用限制性内切酶NdeI和BamHI消化。这些限制性内切酶位点是由OSNBpctF引物(NdeI)和OSHBR引物(BamHI)引入到装配的PCR产物中的。消化后的PCR产物在80℃加热30分钟使限制性内切酶失活，然后直接用来连接到pET11a载体中。
pET11a载体以NdeI和BamHI限制性内切酶消化，用Qiagen凝胶抽提试剂盒进行凝胶纯化，经虾碱性磷酸酶(Roche MolecularBiochemicals；Indianapolis，IN)处理，然后与装配的PCR产物一起用于连接反应。使用T4连接酶(Roche Molecular Biochemicals；Indianapolis，IN)在16℃下连接过夜。使用热激法将所得的连接反应液转化NovaBlue化学感受态细胞(Novagen，Madison，WI)。热激后，把细胞涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的LB平板上。使用QiaPrepSpin微量抽提试剂盒(Qiagen，Inc.；Valencia，CA)从每个菌落中纯化质粒DNA，然后用NdeI和BamHI限制性内切酶消化，并进行凝胶电泳分析。所得的带有辅酶A转移酶和3-羟基丙酰辅酶A脱水酶的质粒(pTH)用XbaI和NdeI限制性内切酶消化，使用凝胶电泳和Qiagen凝胶抽提试剂盒进行纯化，然后用作载体来克隆E2α亚基/E2β亚基PCR产物。
用同样的酶消化E2α亚基/E2β亚基PCR产物，然后连接到pTH载体。连接反应使用T4连接酶(Roche Molecular Biochemicals；Indianapolis，IN)在16℃下操作过夜。将所得的连接混合液转化NovaBlue化学感受态细胞(Novagen，Madison，WI)，然后把细胞涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的LB平板上。使用QiaPrep Spin微量抽提试剂盒(Qiagen，Inc.；Valencia，CA)从每个菌落中纯化质粒DNA，用XbaI和NdeI限制性内切酶消化并进行凝胶电泳分析。使得到的带有乳酰辅酶A脱水酶的E2α和β亚基、辅酶A转移酶和3-羟基丙酰辅酶A脱水酶的质粒(pEIITH)转化到BL21(DE3)细胞以研究克隆序列的表达。
凝胶纯化的E1激活因子PCR产物用EcoRI和KpnI限制性内切酶消化，65℃加热30分钟，连接到以EcoRI和KpnI限制性内切酶消化的载体(pPROLar.A)中，用Qiagen凝胶抽提试剂盒进行凝胶纯化，并经虾碱性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals；Indianapolis，IN)处理。使用T4连接酶(Roche Molecular Biochemicals；Indianapolis，IN)，在16℃下连接过夜。使用电穿孔法将所得的连接反应液转化DH10B电感受态细胞(Gibco Life Technologies；Gaithersburg，MD)。电穿孔后，把细胞涂布于含有25μg/mL卡那霉素的LB平板上。使用QiaPrep Spin微量抽提试剂盒(Qiagen，Inc.；Valencia，CA)从每个菌落中纯化质粒DNA，然后用EcoRI和KpnI限制性内切酶消化，并进行凝胶电泳分析。使所得的带有E1激活因子的质粒(pPROE1)转化到BL21(DE3)细胞以研究克隆序列的表达。
pPROE1和pEIITH质粒是相容的质粒，可用在同一个细菌宿主细胞中。此外，从pPROE1和pEIITH质粒的表达可以使用IPTG和阿拉伯糖在不同水平上进行诱导，这使得对克隆序列的表达进行精细调节成为可能。
实施例8、3-羟基丙酸的生产
使用重组大肠杆菌在小规模分批发酵反应中生产了3-羟基丙酸。按照生产商的说明书使用λDE3溶原化试剂盒(Novagen，Madison，WI)构建了带有可诱导的T7RNA聚合酶的菌株ALS848(又命名TA3476(J.Bacteriol.，143：1081-1085(1980)))。构建的菌株命名为ALS484(DE3)。使用标准的电穿孔技术将质粒pEIITHrEI转化到ALS484(DE3)菌株中。在LB/羧苄青霉素(50μg/mL)平板上筛选转化子。将单菌落接种于含4mL培养液的15mL培养管中。以带有载体pET11a的ALS484(DE3)菌株作为对照。将细胞在Innova 4230摇床(NewBrunswick Scientific，Edison，NJ)上于37℃、250rpm培养8-9小时。取3mL培养液作为种子开始厌氧培养。ALS(DE3)/pET11a和ALS(DE3)/pEIITHrEI分别在含100mL培养基的血清瓶中进行厌氧培养，培养基为含0.4％葡萄糖、50μg/mL羧苄青霉素和100mM MOPS的LB培养基。将培养物37℃下不震荡生长过夜。培养过夜的培养物使用新鲜的含0.4％葡萄糖、50μg/mL羧苄青霉素和100mM MOPS的LB培养基在血清瓶中传代培养。该培养物的起始OD(600)调整到0.3。这些血清瓶在37℃不震荡培养。培养1小时后，加入100μM IPTG进行诱导。在30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时和24小时分别从每个血清瓶中取出3mL样品。样品放入两个做好标记的2mL微量离心管中，每管1.5mL。样品在微量离心机中于14000g离心3分钟。上清液使用0.45μ的针筒过滤器进行过滤，滤液储存于-20℃，以备分析。发酵产物，主要是乳酸和3-羟基丙酸，通过衍生为乳酸和3-羟基丙酸的辅酶A酯后使用LC/MS进行测定。
使用下述方法将乳酸和3-羟基丙酸转化为相应的辅酶A酯。简单地说，将滤液与辅酶A反应缓冲液(200mM磷酸钾缓冲液、2mM乙酰辅酶A和0.1mg/mL纯化的转移酶)以1∶1比例混合。在室温反应20分钟。加入1倍体积10％的三氟乙酸(TFA)终止反应。样品用Sep Pak Vac柱(Waters)纯化，柱子用甲醇进行调节，然后用0.1％的TFA洗两次。将样品上柱，再用0.1％的TFA洗两次。然后用40％乙腈0.1％TFA洗脱样品。通过真空离心以除去样品中的乙腈。然后用LC/MS分析样品。
使用Waters/Micromass ZQ LC/MS仪来分析标准的辅酶A/辅酶A硫酯混合物以及从发酵液衍生的辅酶A硫酯混合物，该仪器连有一台Waters 2690液相色谱仪，在色谱仪与单个四极质谱仪间串联放置一个Waters 996发光二极管阵列(PDA)吸光度检测器。使用4.6×150mmYMC ODS-AQ(3μm颗粒，120_孔径)反相色谱柱在室温进行液相色谱(LC)分离。为分离辅酶A的酯开发了使用不同流动相的两种梯度洗脱系统。这两种系统汇总于表3。第一种洗脱系统可快速有效地分离5种成分的辅酶A/辅酶A硫酯混合物(辅酶A、乙酰辅酶A、乳酰辅酶A、丙烯酰辅酶A和丙酰辅酶A)，而第二种洗脱系统可用于对乳酰辅酶A和3-羟基丙酰辅酶A的酯的结构异构体进行基线分离，此外也可用于分离上述酯以外的酯。在所有系统中，流速为0.250mL/min，在200nm到400nm间监测发光二极管阵列紫外(UV)吸光度。基于目的分析物的质子化分子离子([M+H]+)的产生和特征性片段离子的形成，对电喷射质谱系统的所有参数进行最适化和选择。在使用ESI-MS检测正离子状态的辅酶A和有机酸辅酶A硫酯时，仪器参数设置如下：毛细管：4.0V；提取器：1V；RF透镜：0V；源温度：100℃；去溶剂化温度：300℃；去溶剂化气体：500L/小时；锥体气体：40L/小时；低质量分辨率：13.0；高质量分辨率：14.5；离子能量：0.5；放大倍数：650。对报道的质/荷比(m/z)及分子质量的不确定度为±0.01％。表3给出了用于分离有机酸-辅酶A硫酯的梯度洗脱系统的概况。
表3
系统 缓冲液A 缓冲液B  梯度
 时间  B％
1 25mM乙酸铵0.5％乙酸 乙腈0.5％乙酸   040424750   104010010010
2 25mM乙酸铵10mM TEA0.5％乙酸 乙腈0.5％乙酸   01045505354   10106010010010
下述方法用于将从3-羟基丙酸衍生的3-羟基丙酰辅酶A与从乳酸衍生的2-羟基丙酰辅酶A(即乳酰辅酶A)分开。因为这些结构异构体具有相同的质量和质谱断裂行为，对混合物中这些分析物的分离和鉴定依赖于它们的色谱分离。尽管第一种洗脱系统能很好地分离测试验的辅酶A硫酯(图46)，但它不能分辨3-羟基丙酰辅酶A和乳酰辅酶A。为此发展了另一种液相色谱洗脱系统，其中使用了乙酸铵和三乙胺(系统2，表3)。
在3-羟基丙酰辅酶A和乳酰辅酶A的混合物中检测了系统2对这两种化合物的分离能力。将从3-羟基丙酰辅酶A和乳酰辅酶A混合物得到结果(图47A)与从仅有乳酰辅酶A得到的结果(图47B)进行比较，可以看出系统2可以分离3-羟基丙酰辅酶A和乳酰辅酶A。在峰1下记录的质谱图(图47A插图)与图46C相比，可以用来鉴定峰1为羟基丙酰辅酶A硫酯。此外，对比图47A和B以及对应于每个峰的质谱结果，表明峰1对应于3-羟基丙酰辅酶A，峰2对应于乳酰辅酶A。
使用系统2证实了转化有pEIITHrEI的大肠杆菌能够生产3-羟基丙酸，因为在其中检测到了3-羟基丙酰辅酶A。具体地说，在分析从含有pEIITHrEI的大肠杆菌培养物中收集的经辅酶A转移酶处理的发酵液等份时，得到了一个质荷比为840(m/z＝840)的离子色谱图，这表明存在3-羟基丙酰辅酶A(图48A)。而在分析从不含有pEIITHrEI的大肠杆菌培养物中收集的经辅酶A转移酶处理的发酵液等份时没有发现对应于3-羟基丙酰辅酶A的峰(图48B)。因此，这些结果表明，质粒pEIITHrEI指导了具有丙酰辅酶A转移酶活性、乳酰辅酶A脱水酶活性和丙烯酰辅酶A脱水酶活性的多肽的表达，同时也表明这些多肽的表达导致了3-羟基丙酸的形成。
实施例9、编码具有乙酰辅酶A羧化酶活性的多肽的核酸分子的克隆
具有乙酰辅酶A羧化酶活性的多肽催化脂肪酸合成的第一个关键步骤--将乙酰辅酶A羧化为丙二酸单酰辅酶A。具有乙酰辅酶A羧化酶活性的多肽也负责为某些细胞功能所需的极长链脂肪酸的生物合成提供丙二酸单酰辅酶A。具有乙酰辅酶A羧化酶活性的多肽可以是生物素依赖性的酶，其中生物素辅酶是在翻译后结合到特定的赖氨酸残基上的。由这样的多肽催化的反应由两个独立的半反应组成。在第一个半反应中，生物素在一个ATP依赖性反应中被碳酸氢盐羧化形成羧基生物素；在第二个半反应中，将羧基转移到乙酰辅酶A上形成丙二酸单酰辅酶A。
具有乙酰辅酶A羧化酶活性的多肽在原核和真核生物中都存在。原核生物中的多肽是一种多亚基酶(4个亚基)，其中每个亚基由不同的核酸序列编码。例如，在大肠杆菌中，下列基因编码乙酰辅酶A羧化酶的4个亚基：
accA：乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶α亚基(GenBank_注册号M96394)
accB：生物素羧基载体蛋白(GenBank_注册号U18997)
accC：生物素羧化酶(GenBank_注册号U18997)
accD：乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶β亚基(GenBank_注册号M68934)
真核生物中的多肽是一个由单一基因编码的高分子量的多功能酶。例如，在啤酒酵母中，乙酰辅酶A羧化酶可以具有GenBank_注册号M92156中所示的序列。
使用带有T7启动子的载体pFN476过量表达大肠杆菌中的原核类型的乙酰辅酶A羧化酶，在别处已有描述(Davis等.J.Biol.Chem.，275：28593-28598(2000))。从啤酒酵母的基因组DNA扩增了真核类型的乙酰辅酶A羧化酶基因。为从啤酒酵母扩增acc1基因设计了两种引物：acc1F5’-atagGCGGCCGC AGGAATGCTGTATGAGCGAAGAAAGCTTATT-3’，SEQ ID NO：138，其中黑体为同源序列，斜体为NotI位点，下划线为核糖体结合位点(RBS)，小写为外加序列；和acc1R5’-atgctcgcatCTCGAGTAGCTAAATTAAATTACATCAATAGTA-3’，SEQID NO：139，其中黑体为同源序列，斜体为XhoI位点，小写为外加序列。扩增acc1基因使用了下述PCR混合液：10Xpfu缓冲液(10μL)、dNTP(10mM；2μL)、cDNA(2μL)、acc1F(100μM；1μL)、acc1R(100μM；1μL)、pfu酶(2.5U/μL；2μL)和去离子水(82μL)。使用下述步骤扩增acc1基因。PCR反应完成后，将PCR产物在凝胶上分离，使用Qiagen凝胶分离试剂盒从凝胶上分离了对应于acc1核酸的条带(约6.7kb)。用NotI和XhoI(New England BioLab)消化PCR片段。然后将消化后的PCR片段与用NotI和XhoI消化及用SAP酶去磷酸化的载体pET30a连接。用1μL的连接混合液转化大肠杆菌DH10B菌株，用1mLSOC培养基使细胞恢复。在含50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选转化细胞。挑选出8个单菌落，用PCR筛选正确的插入片段。使用QiaPrepSpin微量抽提试剂盒分离带有正确插入片段的质粒。
为了获得具有乙酰辅酶A羧化酶活性的多肽，将过量表达大肠杆菌或啤酒酵母乙酰辅酶A羧化酶的pMSD8或pET30a/acc1质粒转化到Tuner pLacI化学感受态细胞(Novagen，Madison，WI)。在含有氯霉素(25μg/mL)加上羧苄青霉素(50μg/mL)或卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上筛选转化细胞。
按照下述方式可以制备该菌株的粗提取物。带有pMSD8的TunerpLacI培养过夜，转接于200mL新鲜的M9培养基中(在1升档板培养瓶中)，该M9培养基中添加了0.4％葡萄糖、1μg/mL硫胺素、0.1％酪蛋白氨基酸和50μg/mL羧苄青霉素或50μg/mL卡那霉素以及25μg/mL氯霉素。将培养物在摇床上于37℃、250rpm转速下培养到在600nm光密度大约为0.6。然后加入IPTG至终浓度为100μM，接着于37℃、250rpm转速下继续培养3小时。8000Xg离心收集细胞，用0.85％的NaCl洗一次。将细胞沉淀重新悬浮于最低体积的含50mMTris-HCl(pH8.0)、5mM MgCl2、100mM KCl、2mM DTT和5％甘油的溶液中。在1000psi压力下两次通过French压力破碎器以裂解细胞，并于30,000Xg离心20分钟US除去细胞碎片。
可以使用Davis等的方法分析酶活(J.Biol.Chem.，275：28593-28598(2000))。
实施例10、编码来自橙色绿屈挠菌(Chloroflexus auarantiacus)、具有丙二酸单酰辅酶A还原酶活性的多肽的核酸分子的克隆
从橙色绿屈挠菌中部分纯化了一个具有丙二酸单酰辅酶A还原酶活性的多肽，并获得了氨基酸微量测序结果。利用该氨基酸测序结果，鉴定和克隆了编码具有丙二酸单酰辅酶A还原酶活性的多肽的核酸。
蛋白纯化所需的菌体在B.Braun BIOSTATB发酵罐(B.BraunBiotech International GmbH，Melsungen，Germany)中培养。使用带有水加热夹套的玻璃罐体来生长所需的菌体。玻璃罐体与自身的控制部分相连。液体的工作体积为4升，罐的操作温度55℃，搅拌速度75rpm。不时地通过发酵罐的顶部空间通入二氧化碳以维持厌氧条件。使用标准pH电极监测培养液的pH，并将其维持在8.0到8.3之间。用于发酵罐的种液培养于两个250mL的摇瓶，使用Innova4230摇床(NewBrunswick Scientific，Edison，NJ)，于55℃培养，使用内置灯光。发酵罐的照明使用3只65W的反光电灯(General Electric，Cleveland，OH)。每只灯放置于距玻璃罐体约50厘米的地方。用于种液和发酵罐培养的培养基如下：每升含0.07gEDTA、1mL微量元素溶液、1mLFeCl3溶液、0.06g CaSO4·2H2O、0.1gMgSO4·7H2O、0.008g NaCl、0.075g KCl、0.103g KNO3、0.68g NaNO3、0.111g Na2HPO4、0.2g NH4Cl、1g酵母粉、2.5g酪蛋白氨基酸、0.5g甘氨酰甘氨酸和900mL去离子水。微量元素溶液每升含0.5mL浓H2SO4、2.28g MnSO4·7H2O、0.5gZnSO4·7H2O、0.5g H3BO4、0.025g CuSO4·2H2O、0.025g Na2MoO4·2H2O和0.045g CoCl2·6H2O。FeCl3溶液每升含0.2905g FeCl3。将培养基的pH调整到8.2到8.4之间，加入0.75g/L Na2S·9H2O，将pH重新调整到8.2到8.4之间，培养基通过0.22μ的过滤器过滤除菌。
发酵罐用500mL生长的培养物接种。细胞密度达到600nm光吸收为大约0.5到0.6时，终止发酵并收集菌体。
于4℃、5000Xg离心(Beckman JLA8.1000转头)收集细胞，用1倍体积冰冷的0.85％NaCl洗涤，然后再次离心。沉淀的细胞重悬浮于30mL冰冷的100mM Tris-HCl(pH7.8)缓冲液中，该缓冲液含有2mM DTT、5mM MgCl2、0.4mM PEFABLOC(Roche MolecularBiochemicals，Indianapolis，IN)、1％硫酸链霉素以及2片完全无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)。将细胞悬浮液在1600psi压力下三次通过50mL的French压力破碎器破壁裂解。30,000Xg离心(Beckman JA25.50转头)除去细胞碎片。粗提物在层析之前先用0.2μm HT Tuffryn膜针筒式过滤器(PallCorp.，Ann Arbor，MI)过滤。使用BioRad的蛋白分析试剂按照生产商提供的微量分析方法，测定粗提物的蛋白浓度为29mg/mL。以牛γ球蛋白制作标准曲线。该方法基于Bradford的染料结合方法(Bradford，Anal.Biochem.，72：248(1976))。
在进行蛋白纯化之前，使用下述方法确定粗提物中的丙二酸单酰辅酶A还原酶的活性。在可透紫外光的96孔板(Corning，NY)中加入50μL等份的细胞提取物粗酶液(29mg/mL)、10μL 1M Tris-HCl(终浓度10μmM)、10μL10mM丙二酸单酰辅酶A(终浓度1mM)、5.5μL5.5mM NADPH(终浓度0.3mM)和24.5μL去离子水。酶活在45℃测定。使用SpectraMAX Plus96孔板读板器(Molecular devicesSunnyvale，CA)测定。通过测定在340nm波长NADPH的消失来检测丙二酸单酰辅酶A还原酶的活性。粗提取表现出了丙二酸单酰辅酶A还原酶活性。
5mL细胞提取物(共145mg蛋白)用20mL缓冲液A(20mM乙醇胺(pH9.0)、5mM MgCl2、2mM DTT)稀释。蛋白的色谱纯化使用BioLogic蛋白纯化系统(BioRad Hercules，CA)进行。UNOQ-6离子交换柱用缓冲液A以1mL/min流速平衡，然后将25mL细胞悬浮液上样。上样后，柱子用2.5倍柱体积的缓冲液A以2mL/min流速冲洗。通过含NaCl线形梯度的缓冲液A洗脱蛋白，NaCl浓度为0-0.33M，总体积为25倍柱体积。在整个层析分离过程中，每个级分收集3mL。收集管中含有50μL Tris-HCl(pH6.5)，以使洗脱样品的pH降到7左右。检测到的主要色谱峰位于相应于18到21级分和23到30级分的区域。从这些级分中取出200μL样品，置于微量离心管中于4℃浓缩，使用Microcon YM-10柱(Millipore Corp.，Bedford，MA)，参照生产商的说明。向每个浓缩后的级分中加入缓冲液A-Tris(100mMTris-HCl(pH7.8)、5mM MgCl2、2mM DTT)至总体积100μL。然后使用上述的分光光度分析法分别测定这些级分中的丙二酸单酰辅酶A还原酶活性。发现大多数特异的丙二酸单酰辅酶A还原酶活性位于18到21级分中。将这些级分合并，使用PD-10柱(Amersham PharmaciaPiscataway，NJ)按照生产商的说明对合并的样品进行脱盐。
将10.5mL脱盐的蛋白提取物用缓冲液A-Tris稀释到25mL。然后将此脱盐稀释的样品上样到用缓冲液A-Tris平衡过的1mL HiTrapBlue柱(Amersham Pharmacia Piscataway，NJ)上。上样流速为0.1mL/min。未结合的蛋白用2.5倍柱床体积的缓冲液A-Tris洗下。然后用100mM Tris(pH7.8)、5mM MgCl2、2mM DTT、2mM NADPH和1M NaCl溶液将蛋白洗脱。在分离过程中，每个级分收集1mL。从49到54级分中各取样200μL浓缩。在各个浓缩的级分中加入缓冲液A-Tris至总体积100μL。使用上述分析法测定级分活性，发现51级分中具有最高的比活。将51级分整个浓缩，在SDS-PAGE上将浓缩样品分离。
使用BioRad ProteinII微型电泳系统和预制的SDS-PAGE凝胶(4-15％)、或Protein II XI系统和按生产商提供的步骤铺制的16cm×20cm×1mm SDS-PAGE胶(10％)进行电泳。凝胶按照生产商的说明在工作缓冲液中电泳，工作缓冲液为25mM Tris-HCl(pH8.3)、192mM甘氨酸和0.1％SDS。
51级分样品用1mm厚的胶进行电泳。51级分中的蛋白上样于10％SDS-PAGE上(3条道，每道含75μg总蛋白)。简单地使用考马斯亮蓝(Bio-Rad，Hercules，CA)对凝胶进行染色，用10％乙酸和20％甲醇溶液脱色至背景透亮。染色显示了一个大约130-140KDa的条带。
将大约130-140KDa的蛋白条带从凝胶中切下，不要带有多余的未染色凝胶。切下一块同样面积的无蛋白的凝胶作为阴性对照。凝胶切片置于无色的微量离心管中，用50％乙腈的HPLC级的水漂洗，再用50％乙腈洗两次，置于干冰上送至剑桥的哈佛微化学测序中心(Harvard Microchemistry Sequencing Facility，Cambridge，MA)。
在用胰蛋白酶对多肽样品进行原位消化后，将得到的多肽段通过微型毛细管反相HPLC分离。HPLC直接与Finnigan LCQ四极离子捕获质谱仪(μLC/MS/MS)的纳电子喷溅(nano-electrospray)离子化源偶联。对于在色谱运行中分离的多个多肽中的每一个序列，在线、高分辨率地获得了谱图(MS/MS)。使用华盛顿大学开发的算法Sequest(Eng等，J.Am.Soc.Mass Spectrom.，5：976(1994))和哈佛大学开发的程序(Chittum等，Biochemistry，37：10866(1998))将多肽的MS/MS谱图用已知的序列进行了校正。结果检查了与已知蛋白的一致性并人工证实了保真度。
采用了同样的纯化步骤获得了另一个样品(蛋白1样品)，并对其进行了同样的分析，以用于评估51级分样品。
多肽测序结果表明，从51级分样品和蛋白1样品获得的多肽，与从橙色绿屈挠菌基因组测序得到的和在联合基因组网站( http：//www.jgi.doe.gov/)公布的6个毗连序列群(764、799、859、923、1090、1024)具有相似性。764毗连序列群是这6个当中最明显的，它与大约40个肽序列具有相似性。对这些毗连序列群的每一个在GenBank网站( http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行了BLASTX分析，结果表明，764毗连序列群的DNA序列(4201碱基)编码具有脱氢酶/还原酶类型活性的多肽。然而仔细检查764毗连序列群，发现该毗连序列群不含有合适的ORF可以为130-140KDa的多肽编码。
对其它5个毗连序列群也进行了BLASTX分析，结果如下：799毗连序列群(3173碱基)显示编码具有磷酸和脱氢酶类型活性的蛋白；859毗连序列群(5865碱基)显示编码具有合成酶类型活性的蛋白；923毗连序列群(5660碱基)显示编码具有延伸因子和合成酶类型活性的蛋白；1090毗连序列群(15201碱基)显示编码具有脱氢酶/还原酶以及细胞色素和σ因子类型活性的蛋白；1024毗连序列群(12276碱基)显示编码具有脱氢酶、脱羧酶和合成酶类型活性的蛋白。因此859和923毗连序列群被排除，不做进一步分析。
从BLASTX分析得到的结果还表明在1024毗连序列群中发现的脱氢酶更可能是单磷酸肌醇脱氢酶。因而排除了1024毗连序列群编码具有丙二酸单酰辅酶A还原酶活性的多肽的可能性。799毗连序列群也被排除了，因为它是前述的OS17多肽的一部分。
这使搜索范围缩减到两个毗连序列群：764和1090毗连序列群。因为这两个毗连序列群是使用同样的蛋白样品鉴定的，并且在其中发现的脱氢酶活性有非常相似的BLASTX结果，因此作出假设：它们都是同一多肽的一部分。此外还有其它获自下列发现的证据可以支持这一假设，根据联合基因组研究所提供的支架数据进行分析，结果表明在橙色绿屈挠菌基因组中764和1090毗连序列群是彼此相邻的。然而序列相似性和组装分析却表明这两个毗连序列群间没有重叠序列，这可能是由于在基因组测序中存在缺口的缘故。
对属于764和1090毗连序列群的多肽序列进行了作图。在此分析基础上，鉴定了合适的编码框架和潜在的起始与终止密码子。设计了下述的PCR引物，以通过PCR扩增编码具有丙二酸单酰辅酶A还原酶活性的多肽的片段：PRO140F5’-ATGGCGACGGGCGAGTCCATGAG-3’，SEQ ID NO：153；PRO140R5’-GGACACGAAGAACAGGGCGACAC-3’，SEQ ID NO：154；和PRO140UPF5’-GAACTGTCTGGAGTAAGGCTGTC-3’，SEQ IDNO：155。PRO140F引物是在1090毗连序列群序列的基础上设计的，对应于潜在的起始密码子的开始。第12个碱基从G改变为C以避免引物二聚体的形成。这个改变并不改变由此密码子编码的氨基酸。PRO140R引物是在764毗连序列群序列的基础上设计的，对应于潜在的终止密码子下游约1kb位置的区域。PRO140UPF引物是在1090毗连序列群序列的基础上设计的，对应于潜在的起始密码子上游约300碱基位置的区域。
制备了橙色绿屈挠菌基因组DNA。简单地说，将橙色绿屈挠菌在50mL培养基中培养3-4天。将细胞沉淀，并用5mL10mMTris溶液洗涤。使用Gentra基因组“Puregene”DNA分离试剂盒(Gentra Systems，Minneapolis，MN)提供的革兰氏阳性菌的分离步骤，分离橙色绿屈挠菌基因组DNA。将沉淀的细胞重新悬浮于1mL Gentra细胞悬浮液中，加入14.2mg溶菌酶和4μL20mg/mL蛋白酶K溶液。然后将细胞悬浮液在37℃温育30分钟。3500g离心25分钟回收沉淀的基因组DNA，空气干燥10分钟。基因组DNA悬浮于适当体积的10mMTris溶液中，4℃保存。
以橙色绿屈挠菌基因组DNA为模板设置了下述两个PCR反应：
PCR#1反应                                    PCR程序
3.3XrTH聚合酶缓冲液         30μL            94℃2分钟
Mg(OAC)(25mM)               4μL             共29个循环：
dNTP混合液(10mM)            3μL             94℃30秒
PRO140F(100μM)             2μL             63℃45秒
PRO140R(100μM)             2μL             68℃4.5分钟
基因组DNA(100ng/mL)         1μL             68℃7分钟
rTH聚合酶(2U/μL)           2μL             4℃保存直到使用
pfu聚合酶(2.5U/μL)         0.25μL
去离子水                    55.75μL
合计                        100μL
PCR#2反应                                    PCR程序
3.3XrTH聚合酶缓冲液         30μL            94℃2分钟
Mg(OAC)(25mM)               4μL             共29个循环：
DNTP混合液(10mM)               3μL                94℃30秒
PRO140UPF(100μM)              2μL                60℃45秒
PRO140R(100μM)                2μL                68℃4.5分钟
基因组DNA(100ng/mL)            1μL                68℃7分钟
RTH聚合酶(2U/μL)              2μL                4℃保存直到使用
Pfu聚合酶(2.5U/μL)            0.25μL
去离子水                       55.75μL
合计                           100μL
从两个PCR反应中获得的产物在0.8％TAE凝胶上分离。两个PCR反应都产生了长度为4.7-5Kb的产物。这与能够编码具有丙二酸单酰辅酶A还原酶活性的多肽的核酸分子的预期长度大致符合。
使用测序引物对两个PCR引物进行了测序：1090Fseq5’-GATTCCGTATGTCACCCCTA-3’，SEQ ID NO：156；和764Rseq5’-CAGGCGACTGGCAATCACAA-3’，SEQ ID NO：157。序列分析表明在764和1090比连序列群之间有一个间隙。在764和1090比连序列群序列之间有一个长度大于300碱基对的核酸序列(图51)。此外，序列分析发现了一个3678碱基的ORF，其与脱氢酶/还原酶类型的酶具有相似性(图52)。由此ORF编码的氨基酸序列长度为1225个氨基酸(图50)。同样，将该ORF编码的氨基酸序列进行了BLASTP分析，发现了两个短链脱氢酶结构域(adh类型)。这些结果与具有丙二酸单酰辅酶A还原酶活性的多肽的性质一致，因为这样的酶在将丙二酸单酰辅酶A转化为3-羟基丙酸的过程中包含了两个还原步骤。此外，这条多肽的计算分子量为大约134KDa。
使用PRO140F/PRO140R引物对、橙色绿屈挠菌基因组DNA和上述的#1PCR反应的步骤进行了PCR。PCR完成后，向PCR混合液中加入0.25UTaq聚合酶(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)，然后在72℃温育10分钟。使用QiagenPCR纯化试剂盒(QiagenInc.，Valencia，CA)对PCR产物进行了柱纯化。然后将纯化的PCR产物按照生产商的说明(Invitrogen，Carlsbad，CA)经过TOPO克隆到表达载体pCRT7/CT中。将TOPO连接混合液按照生产商的说明(Invitrogen，Carlsbad，CA)转化TOP10F’化学感受态细胞。细胞恢复半小时后，在含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子。挑选20个单菌落，使用Qiagen Spin微量抽提试剂盒(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)提取质粒DNA。
通过PCR逐一测试了这20个克隆以寻找正确的方向和插入大小。简单地说，以质粒DNA为模板，使用下述两种物进行PCR扩增：PCRT75’-GAGACCACAACGGTTTCCCTCTA-3’，SEQ ID NO：158；和PRO140R5’-GGACACGAAGAACAGGGCGACAC-3’，SEQ ID NO：159。使用下述的PCR反应混合物和程序：
PCR反应                                   PCR程序
3.3XrTH聚合酶缓冲液      7.5μL           94℃2分钟
Mg(OAC)(25mM)            1μL             共25个循环：
dNTP混合液(10mM)         0.5μL           94℃30秒
PCRT7(100μM)            0.125μL         55℃45秒
PRO140R(100μM)          0.125μL         68℃4分钟
质粒DNA                  0.5μL           68℃7分钟
rTH聚合酶(2U/μL)        0.5μL           4℃保存直到使用
去离子水                 14.75μL
合计                     25μL
在这20个被测试的克隆中，只有一个克隆表现出正确的插入(克隆#P-10)。将2μLP-10质粒DNA按照生产商的说明转化BL21(DE3)pLysS化学感受态细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)。细胞在37℃恢复30分钟，然后涂布于含100μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL氯霉素的LB平板上。
20mL的BL21(DE3)pLysS/P-10培养液和20mL的BL21(DE3)pLysS对照培养液培养过夜。将过夜培养液作为种液，接种两个100mLBL21(DE3)pLysS/P-10克隆培养液和两个100mLBL21(DE3)pLysS对照培养液起始培养。对所有培养物来说，当培养液在600nm处OD达到约0.5时，加入IPTG进行诱导。对照菌株培养液用10μM IPTG或100μM IPTG诱导，而BL21(DE3)pLysS/P-10克隆培养液中的一个加入10μM IPTG，另一个加入100μM IPTG进行诱导。诱导后培养液继续生长2.5小时。在诱导前和诱导2.5小时后分别从每个培养摇瓶中取样，使用4-15％SDS-PAGE进行分离以分析多肽的表达。在诱导的BL21(DE3)pLysS/P-10样品中，发现了对应于具有分子量大约为135KDa的多肽的条带。在对照菌株样品和诱导前采集的样品中没有这条带。
为评估丙二酸单酰辅酶A还原酶活性，对BL21(DE3)pLysS/P-10和20mL BL21(DE3)pLysS细胞进行培养，然后8000xg离心(JA16.250转头，Beckman Coulter，Fullerton，CA)收集细胞。细胞收集后，用等体积的0.85％NaCl溶液洗一次。把细胞沉淀重新悬浮于含有5mMMgCl2和2mM DTT的100mM Tris-HCl缓冲液中。将此细胞在1000psi压力下(计量值)两次通过French压力破碎器进行破壁。然后30,000 xg离心(JA25.50转头，Beckman Coulter，Fullerton，CA)除去细胞碎片。细胞提取物在4℃或冰上保存直到使用。
对照细胞和IPTG诱导的细胞的丙二酸单酰辅酶A还原酶活性均在37℃测定。丙二酸单酰辅酶A还原酶活性同前所述，通过观察所加入的NADPH的消失来检测。在对照菌株的细胞提取物中没有发现活力，而IPTG诱导的BL21(DE3)pLysS/P-10细胞的细胞提取物表现出了丙二酸单酰辅酶A还原酶活性，其比活经计算大约为0.0942μmol/min/mg总蛋白。
丙二酸单酰辅酶A还原酶活性还可以通过分析从丙二酸单酰辅酶A形成3-羟基丙酸来测定，使用下述反应体系，在37℃进行：
                             体积              终浓度
Tris-HCl(1M)                 10μL             100mM
丙二酸单酰辅酶A(10mM)        40μL             4mM
 NADPH(10mM)                 30μL             3mM
粗酶液                       20μL
合计                         100μL
反应在37℃进行30分钟。在对照反应中，加入BL21(DE3)pLysS的细胞提取物至终浓度322mg蛋白。在实验反应混合液中，BL21(DE3)pLysS/P-10的细胞提取物加至终浓度226mg总蛋白。反应混合液在-20℃冷冻保存以备进一步分析。
使用HPX-87H(7.8×300mm)有机酸HPLC柱(BioRad Laboratories，Hercules，CA)对反应混合液中的成分进行色谱分离。柱温维持在60℃。流动相为HPLC级的水，用三氟乙酸(TFA)调至pH2.5，流速为0.6mL/min。
使用Waters/Micromass ZQ LC/MS仪来检测反应样品中的3-羟基丙酸，该仪器连有一台Waters 2690液相色谱仪(Waters Corp.，Milford，MA)，在色谱仪与单个四极质谱仪间串联有一个Waters996发光二极管阵列(PDA)吸收检测器。离子化源采用大气压化学离子化(APCI)源。基于3-羟基丙酸的质子化分子离子([M+H]+)的产生，对APCI-MS系统的所有参数进行最适化和选择。下列参数用于检测正离子状态下的3-羟基丙酸：电晕放电：10μA；锥体电压：20V；提取器：2V；RF透镜：0.2V；源温度：100℃；APCI探针温度：300℃；去溶剂化气体：500L/小时；锥体气体：50L/小时；低质量分辨率：15.0；高质量分辨率：15.0；离子能量：1.0；放大倍数：650。数据收集在选择离子报告(Selected Ion Reporting，SIR)状态，设置为m/z＝90.9。
使用HPLC-质谱联用技术在对照反应样品和实验反应样品中对3-羟基丙酸的存在进行了探测。在对照样品中，没有观察到3-羟基丙酸的峰，而在实验样品中显示了一个峰，在保留时间和质量上与3-羟基丙酸相符。
实施例11、生产3-羟基丙酸的重组细胞的构建
图44显示了一条通过乙酰辅酶A直接从葡萄糖生产3-羟基丙酸的途径。许多生物体，如大肠杆菌、芽孢杆菌和酵母都可以从葡萄糖通过糖酵解和丙酮酸脱氢酶的作用生成乙酰辅酶A。为了转化从葡萄糖产生的乙酰辅酶A，一个值得考虑的办法是过量表达两个基因，一个编码乙酰辅酶A羧化酶，另一个编码丙二酸单酰辅酶A还原酶。例如，可以使用pET30a和pFN476载体通过T7启动子在大肠杆菌中表达这些基因。pET30a载体带有pBR的复制原点和卡那霉素抗性，pFN476载体带有pSC101的复制原点，使用羧苄青霉素抗性作为筛选标记。因为这两个载体有相容的复制原点和不同的标记，它们可以同时维持在大肠杆菌中。因此，改造大肠杆菌用以从葡萄糖直接生产3-羟基丙酸的构建体是pMSD8(pFN476/accABCD)(Davis等，J.Biol.Chem.，275：28593-28598，2000)、pET30a/丙二酸单酰辅酶A还原酶或pET30a/acc1和pFN476/丙二酸单酰辅酶A还原酶。这些构建体见图45所示。
为了测试从葡萄糖生产3-羟基丙酸，将带有质粒pMSD8(pFN476/accABCD)、pET30a/丙二酸单酰辅酶A还原酶或pET30a/acc1和pFN476/丙二酸单酰辅酶A还原酶的大肠杆菌菌株Tuner pLacI在B.Braun BIOSTAT B发酵罐中培养。实验中使用带有水加热夹套的玻璃罐体，罐的工作体积为1.5升，操作温度37℃。以1vvm的速度通入无菌空气给发酵罐连续提供氧气。搅拌速度受级联控制以维持溶解氧浓度为40％DO。使用2N NaOH将培养液的pH维持在7.0。大肠杆菌菌株生长于M9培养基中，该M9培养基中添加了1％葡萄糖、1μg/mL硫胺素、0.1％酪蛋白氨基酸、10μg/mL生物素、50μg/mL羧苄青霉素、50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素。当细胞密度达到0.5OD(600nm)时，加入100μM IPTG以诱导基因的表达。在诱导后1、2、3、4和8小时各取2mL样品。此外在诱导3小时后取出200mL样品制备细胞提取物。将2mL样品离心，使用LC/MS技术分析上清液中的产物。上清液在-20℃保存以备进一步分析。
提取物制备方法如下：200mL细胞悬浮液在8,000g离心，沉淀细胞用50mL含5mM MgCl2、100mM KCl、2mM DTT和5％甘油的50mM Tris-HCl(pH8.0)溶液洗涤。细胞悬浮液再次在8000g离心，沉淀细胞重新悬浮于5mL的5mM MgCl2、100mM KCl、2mM DTT和5％甘油的50mM Tris-HCl(pH8.0)溶液中。细胞在1000psi压力下两次通过French Press破壁；30,000g离心20分钟除去细胞碎片。所有操作均在4℃下进行。为了证实使用该重组细胞提取物可在体外生产3-羟基丙酸，在37℃进行了下述反应，反应体积为200μL，反应混合物如下：Tris-HCl(pH8.0；100mM)、ATP(1mM)、MgCl2(5mM)、KCl(100mM)、DTT(5mM)、NaHCO3(40mM)、NADPH(0.5mM)、乙酰辅酶A(0.5mM)和细胞提取物(0.2mg)。反应进行15分钟后加入1倍体积的10％三氟乙酸(TFA)终止反应。使用LC/MS技术检测该反应的产物。
使用Waters/Micromass ZQ LC/MS仪来检测和分析上清液和体外反应混合物中的3-羟基丙酸。该仪器包括一台Waters 2690液相色谱仪(Waters Corp.，Milford，MA)，在色谱仪与单个四极质谱仪间串联有一个Waters 2410折光指数检测器。使用Bio-Rad Aminex 87-H离子交换柱在45℃进行液相色谱分离。用0.015％TFA缓冲液洗脱糖、醇和有机酸产物，缓冲液洗脱流速为0.6mL/min。为测定和定量3-羟基丙酸，使用从TCI，America(Portland，OR)获得的样品做标准品。
实施例12、克隆丙酰辅酶A转移酶、乳酰辅酶A脱水酶(LDH)和水合酶(OS19)用于在啤酒酵母中表达
使用pESC酵母表位标记载体系统(Stratagene，La Jolla，CA)来克隆参与从乳酸生产3-羟基丙酸的基因。每个pESC载体在相反方向各含有一个GAL1和GAL10启动子，因此在每个载体上可以表达两个基因。GAL1和GAL10启动子由葡萄糖阻遏并由半乳糖诱导。有4种pESC载体，各含一种不同的酵母选择性标记(HIS3、TRP1、LEU2、URA3)，所以多个质粒可以维持在一个单一菌株中。每个克隆区有一个用于插入基因的多接头位点、一个转录终止子和一个表位编码序列用于在表达蛋白的C端或N端进行表位标记。pESC载体也含有一个ColE1复制原点和一个氨苄青霉素抗性基因，可以在大肠杆菌中进行复制和筛选。构建了下列载体/启动子/核酸的组合：
载体  启动子  多肽 核酸来源
PESC-Trp  GAL1  OS19水合酶 橙色绿屈挠菌
 GAL10  E1 埃氏巨球菌
PESC-Leu  GAL1  E2α 埃氏巨球菌
 GAL10  E2β 埃氏巨球菌
PESC-His  GAL1  D-LDH 大肠杆菌
 GAL10  PCT 埃氏巨球菌
所用引物如下：
OS19APAF：                             5’-
ATAGGGCCCAGGAGATCAAACCATGGGTGAAGAGTCTCTGGTTC-
3’(SEQ ID NO：164)
OS19SALR：                             5’-
CCTCTGCTACAGTCGACACAACGACCACTGAAGTTGGGAG-3’
(SEQ ID NO：165)
OS19KPNR：                             5’-
AGTCTGCTATCGGTACCTCAACGACCACTGAAGTTGGGAG-3’(SEQID NO：166)
EINOTF：                                    5’-
ATAGCGGCCGCATAATGGATACTCTCGGAATCGACGTTGG-3’(SEQID NO：167)
EICLAR：                                    5’-
CCCCATCGATACATATTTCTTGATTTTATCATAAGCAATC-3’(SEQ IDNO：168)
EIIαAPAF：                                 5’-
CCAGGGCCCATAATGGGTGAAGAAAAAACAGTAGATATTG-3’(SEQID NO：169)
EIIαSALR：                                 5’-
GGTAGACTTGTCGACGTAGTGGTTTCCTCCTTCATTGG-3’(SEQ IDNO：170)
EIIβNOTF：                                 5’-
ATAGCGGCCGCATAATGGGTCAGATCGACGAACTTATCAG-3’(SEQID NO：171)
EIIβSPER：                                 5’-
AGGTTCAACTAGTTCGTAGAGGATTTCCGAGAAAGCCTG-3’(SEQID NO：172)
LDHAPAF：                                   5’-
CTAGGGCCCATAATGGAACTCGCCGTTTATAGCAC-3’(SEQ IDNO：173)
LDHXHOR：                                   5’-
ACTTCTCGAGTTAAACCAGTTCGTTCGGGCAGGT-3’(SEQ IDNO：174)
PCTSPEF：                                   5’-
GGGACTAGTATAATGGGAAAAGTAGAAATCATTACAG-3’(SEQ IDNO：175)
PCTPACR：                                   5’-
CGGCTTAATTAACAGCAGAGATTTATTTTTTCAGTCC-3’(SEQ IDNO：176)
所有的限制性内切酶均购自New England Biolabs，Beverly，MA。所有的质粒DNA使用QIAprep Spin微量制备试剂盒制备，并且所有的凝胶纯化使用QIAquick凝胶抽提试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)进行。
A、pESC-Trp/OS19水合酶载体的构建
将来自橙色绿屈挠菌的OS19核酸克隆在pESC-Trp中构建了两个载体。其中一个构建体利用了GAL1多克隆位点的ApaI和SalI限制性内切酶位点，设计为包含c-myc表位；另一个构建体利用了ApaI和KpnI位点，因而不包含c-myc表位序列。
6μgpESC-Trp载体DNA用限制性内切酶ApaI消化，消化片段用QIAquick PCR纯化柱纯化；然后将3μg ApaI消化的载体DNA用限制性内切酶SalI消化，另外3μgApaI消化的载体DNA用限制性内切酶KpnI消化。双酶切的载体DNA在1％TAE琼脂糖凝胶上分离、纯化、用虾碱性磷酸酶(Roche Biochemical Products，Indianapolis，IN)脱磷酸化，然后用QIAquick PCR纯化柱纯化。
从基因组DNA上使用PCR引物对OS19APAF和OS19SALR及引物对OS19APAF和OS19KPNR扩增了编码橙色绿屈挠菌具有水合酶活性的多肽(OS19)的核酸。将OS19APAF设计成在扩增片段的起始端引入了一个ApaI限制性内切酶位点和一个翻译起始位点(ACCATGG)。将引物OS19KPNR设计成在扩增片段的末端引入了一个KpnI限制性内切酶位点，并含有水合酶基因的翻译终止密码子。OS19SALR在扩增片段的末端引入了一个SalI限制性内切酶位点，并改变了终止密码子，使得翻译能够在阅读框内继续进行，并通过载体的c-myc表位。PCR混合物含有：1X Expand PCR缓冲液、100ng橙色绿屈挠菌基因组DNA、各种引物0.2μM、各种dNTP0.2μM和5.25UExpand DNA聚合酶(Roche)，总体积100μL。PCR反应在MJ ResearchPTC100热循环仪中进行，条件如下：94℃预变性1分钟；然后94℃30秒、57℃1分钟和72℃2.25分钟，共8个循环；接着94℃30秒、62℃1分钟和72℃2.25分钟，共24个循环；以及最后72℃延伸7分钟。然后将扩增产物在1％TAE琼脂糖凝胶上进行电泳分离。把每种引物对的PCR反应样品，从凝胶上切下0.8kb的片段并纯化。纯化的片段以KpnI或SalI限制性内切酶消化，经QIAquick PCR纯化柱纯化，用ApaI限制性内切酶消化，再经QIAquick PCR纯化柱纯化，并在微型凝胶上定量。
含有编码具有水合酶活性的橙色绿屈挠菌多肽(OS19)的核酸的消化的PCR产物50-60ng与50ng预先准备的pESC-Trp载体使用T4DNA连接酶，在16℃连接16小时。用1μL连接反应液通过电穿孔转化40μL大肠杆菌ElectromaxTM DH10BTM细胞。电穿孔后的细胞涂布于含有100μg/mL羧苄青霉素的LB平板(LBC)上。使用克隆PCR和适当的PCR引物对克隆进行逐一筛选。将单个克隆悬浮于大约25μL10mM Tris溶液中，取2μL悬浮液涂布于LBC平板上；剩余的悬浮液在95℃加热10分钟使细菌细胞破碎，并取2μL加热的细胞用于25μLPCR反应中。PCR混合物含有：1XTaq缓冲液、每种引物0.2μM、每种dNTP 0.2mM和1U Taq DNA聚合酶。所用的PCR程序与上述用于从基因组DNA扩增核酸的程序相同。
从含有预期插入片段的克隆的培养液中分离质粒DNA并测序，以证实不存在由PCR引起的核苷酸错误。使用Frozen-EZ YeastTransformation IITM试剂盒(Zymo Research，Orange，CA)将带有被证实序列的载体转入啤酒酵母YPH500菌株中。转化反应液涂布于SC-Trp培养基平板上(见Stratagene pESC载体使用手册的培养基配方)。通过克隆PCR逐一筛选带有OS19核酸的酵母克隆。把克隆悬浮于20μL含有5U消解酶的Y裂解缓冲液(Zymo Research)中，37℃加热10分钟；取3μL该悬浮液用于25μLPCR反应中，PCR反应混合物和程序与上述用于大肠杆菌转化子克隆筛选中的相同。pESC-Trp载体也转化到YPH500中用作水合酶分析对照，并通过PCR利用GAL1和GAL10引物筛选转化子。
B、pESC-Trp/OS19/EI水合酶载体的构建
将序列已被证实并且分析结果为阳性的pESC-Trp/OS19构建体(ApaI-SalI位点)的质粒DNA用于在GAL10启动子的下游插入编码埃氏巨球菌E1激活因子多肽的核酸。3μg质粒DNA用限制性内切酶ClaI消化，消化片段用QIAquick PCR纯化柱纯化。然后将消化的载体DNA用限制性内切酶NotI消化，65℃加热20分钟使酶失活。双酶切的载体DNA用虾碱性磷酸酶(Roche Biochemical Products，Indianapolis，IN)脱磷酸化，在1％TAE琼脂糖凝胶上分离，并进行凝胶纯化。
从基因组DNA上使用PCR引物对EINOTF和EICLAR扩增了编码埃氏巨球菌E1激活因子多肽的核酸。把EINOTF设计成在扩增片段的起始端引入了一个NotI限制性内切酶位点和一个翻译起始位点。把引物EICLAR设计成在扩增片段的末端引入了一个ClaI限制性内切酶位点，并改变了翻译的终止密码子，使得能够在框内翻译出FLAG表位。PCR混合物含有：1XExpand PCR缓冲液、100ng埃氏巨球菌基因组DNA、每种引物0.2μM、每种dNTP0.2mM和5.25U Expand DNA聚合酶，总体积100μL。PCR反应在MJ Research PTC100热循环仪中进行，条件如下：94℃预变性1分钟；然后94℃30秒、55℃45秒和72℃3分钟，共8个循环；接着94℃30秒、62℃45秒和72℃3分钟，共24个循环；以及最后72℃延伸7分钟。然后将扩增产物在1％TAE琼脂糖凝胶上进行电泳分离，从凝胶上切下0.8kb的片段并纯化。纯化的片段以ClaI限制性内切酶消化，经QIAquick PCR纯化柱纯化后，以NotI限制性内切酶消化，再用QIAquick PCR纯化柱纯化，并在微型凝胶上定量。
60ng含有编码埃氏巨球菌E1激活因子多肽编码的核酸的消化的PCR产物与70ng预先准备的pESC-Trp/OS19水合酶载体，使用T4DNA连接酶，在16℃连接16小时。用1μL连接反应液通过电穿孔转化40μL大肠杆菌ElectromaxTM DH10BTM细胞。电穿孔后的细胞涂布于LBC培养基的平板上。使用克隆PCR，利用PCR引物EINOTF和EICLAR对克隆进行逐一筛选。将每个克隆悬浮于大约25μL10mM Tris溶液中，取2μL悬浮液涂布于LBC培养基上；剩余的悬浮液在95℃加热10分钟使细菌细胞破碎，取2μL加热的细胞液用于25μL PCR反应中。PCR混合物含有：1XTaq缓冲液、每种引物0.2μM、每种dNTP0.2mM和1U Taq DNA聚合酶。所用的PCR程序与上述用于从基因组DNA扩增核酸的程序相同。从含有预期插入片段的克隆的培养液中分离质粒DNA并测序，以证实不存在由PCR引起的核苷酸错误。
C、pESC-Leu/EIIα/EIIβ载体的构建
3μgpESC-Leu载体的DNA用限制性内切酶ApaI消化，消化片段用QIAquick PCR纯化柱纯化。然后将载体DNA用限制性内切酶SalI消化，65℃加热20分钟使酶失活。双酶切的载体DNA用虾碱性磷酸酶(Roche)脱磷酸化，然后在1％TAE琼脂糖凝胶上分离，并进行凝胶纯化。
从基因组DNA上使用PCR引物对EIIαAPAF和EIIaαSALR扩增了编码埃氏巨球菌E2α多肽的核酸。把EIIαAPAF引物设计成在扩增片段的起始端引入了一个ApaI限制性内切酶位点和一个翻译起始位点。把引物EIIαSALR设计成在扩增片段的末端引入了一个SalI限制性内切酶位点，并改变了翻译的终止密码子，使得能够在阅读框内继续翻译出c-myc表位。PCR混合物含有：1X Expand PCR缓冲液，100ng埃氏巨球菌基因组DNA、每种引物0.2μM、每种dNTP0.2mM和5.25U Expand DNA聚合酶，总体积100μL。PCR反应在MJ ResearchPTC100热循环仪中进行，条件如下：94℃预变性1分钟；然后94℃30秒、55℃1分钟和72℃3分钟，共8个循环；接着94℃30秒、62℃1分钟和72℃3分钟，共24个循环；以及最后72℃延伸7分钟。然后将扩增产物在1％TAE琼脂糖凝胶上进行电泳分离，从凝胶上切下1.3kb的片段并纯化。纯化的片段以ApaI限制性内切酶消化，经QIAquick PCR纯化柱纯化后，以SalI限制性内切酶消化，再次用QIAquick PCR纯化柱纯化，并在微型凝胶上定量。
80ng含有编码埃氏巨球菌E2α多肽的核酸的消化的PCR产物与80ng预先准备的pESC-Leu载体，使用T4 DNA连接酶，在16℃连接16小时。用1μL连接反应液通过电穿孔转化40μL大肠杆菌ElectromaxTM DH10BTM细胞。转化后的细胞涂布于LBC培养基上。使用克隆PCR，利用PCR引物EIIαAPAF和EIIαSALR对克隆进行逐一筛选。将每个克隆悬浮于大约25μL10mM Tris溶液中，取2μL悬浮液涂布于LBC培养基上。剩余的悬浮液在95℃加热10分钟使细菌细胞破碎，取2μL加热的细胞液用于25μLPCR反应中。PCR混合物含有：1XTaq缓冲液、每种引物0.2μM、每种dNTP0.2mM和1U TaqDNA聚合酶。所用的PCR程序与上述用于从基因组DNA扩增核酸的程序相同。从含有预期插入片段的克隆的培养液中分离质粒DNA并测序，以证实不存在由PCR引起的核苷酸错误。
将序列已被证实的pESC-Leu/EIIα载体的质粒DNA用于插入编码埃氏巨球菌E2β多肽的核酸。3μg质粒DNA用限制性内切酶SpeI消化，消化片段用QIAquick PCR纯化柱纯化。然后将载体DNA用限制性内切酶NotI消化，并在1％的TAE琼脂糖凝胶上进行凝胶纯化。双酶切的载体DNA用虾碱性磷酸酶(Roche)脱磷酸化，然后用QIAquick PCR纯化柱纯化。
从基因组DNA上使用PCR引物对EIIαNOTF和EIIβSPER扩增编码埃氏巨球菌E2β多肽的核酸。把EIIβNOTF引物设计成在扩增片段的起始端引入了一个NotI限制性内切酶位点和一个翻译起始位点。把引物EIIβSPER设计成在扩增片段的末端引入了一个SpeI限制性内切酶位点，并改变了翻译的终止密码子，使得能够在框内翻译出FLAG表位。PCR混合物含有：1X Expand PCR缓冲液、100ng埃氏巨球菌基因组DNA、每种引物0.2μM、每种dNTP 0.2mM和5.25U Expand DNA聚合酶，总体积100μL。PCR反应在MJ Research PTC100热循环仪中进行，条件如下：94℃预变性1分钟；然后94℃30秒、55℃45秒和72℃3分钟，共8个循环；接着94℃30秒、62℃45秒和72℃3分钟，共24个循环；以及最后72℃延伸7分钟。将扩增产物在1％TAE琼脂糖凝胶上进行电泳分离，从凝胶上切下1.1kb的片段并纯化。纯化的片段以SpeI限制性内切酶消化，经QIAquick PCR纯化柱纯化后，以NotI限制性内切酶消化，并再次用QIAquick PCR纯化柱纯化，在微型凝胶上定量。
38ng含有编码埃氏巨球菌E2β多肽的核酸的消化的PCR产物与50ng预先准备的pESC-Leu/EII载体，使用T4 DNA连接酶，在16℃连接16小时。用1μL连接反应液通过电穿孔转化40μL大肠杆菌ElectromaxTM DH10BTM细胞。电穿孔转化后的细胞涂布于LBC平板上。使用克隆PCR，利用PCR引物EIIβNOTF和EIIβSPER对克隆进行逐一筛选。将每个克隆悬浮于大约25μL10mM Tris溶液中，取2μL悬浮液涂布于LBC培养基上。剩余的悬浮液在95℃加热10分钟使细菌细胞破碎，取2μL加热的细胞液用于25μLPCR反应中。PCR混合物含有：1X Taq缓冲液、每种引物0.2μM、每种dNTP 0.2mM和1UTaq DNA聚合酶。所用的PCR程序与上述用于从基因组DNA扩增核酸的程序相同。
从含有预期插入片段的克隆的培养液中分离质粒DNA并测序，以证实不存在由PCR引起的核苷酸错误。使用Frozen-EZ YeastTransformation IITM试剂盒(Zymo Research，Orange，CA)将带有被证实序列的pESC-Leu/EIIα/EIIβ载体和pESC-Trp/OS19/EI载体共转入啤酒酵母YPH500菌株中。转化反应液涂布于SC-Trp-Leu培养基上。通过克隆PCR逐一筛选带有OS19、E1、E2α和E2β核酸的酵母克隆。克隆悬浮于20μL含有5U消解酶的Y裂解缓冲液(Zymo Research)中，37℃加热10分钟。取3μL该悬浮液用于25μL PCR反应中，PCR反应混合物和程序与上述用于大肠杆菌转化子克隆筛选中的相同。pESC-Trp/OS19和pESC-Leu载体也被共转入啤酒酵母YPH500菌株中，用做乳酰辅酶A脱水酶分析的对照。这些转化子使用GAL1和GAL10引物进行克隆筛选(pESC酵母表位标记载体系统操作手册(Instruction manual，pESC Yeast Epitope Tagging Vectors)，Stratagene)。
D、pESC-His/D-LDH/PCT载体的构建
3μgpESC-His载体的DNA用限制性内切酶XhoI消化，消化片段用QIAquick PCR纯化柱纯化。然后将消化的载体DNA用限制性内切酶ApaI消化，并在1％的TAE琼脂糖凝胶进行凝胶纯化。双酶切的载体DNA用虾碱性磷酸酶(Roche)脱磷酸化，并用QIAquick PCR纯化柱纯化。
从DH10B菌株的基因组DNA上使用PCR引物对LDHAPAF和LDHXHOR扩增了大肠杆菌的D-LDH基因。把LDHAPAF设计成在扩增片段的起始端引入了一个ApaI限制性内切酶位点和一个翻译起始位点。把引物LDHXHOR设计成在扩增片段的末端引入了一个XhoI限制性内切酶位点，并含有D-LDH基因的翻译终止密码子。PCR混合物含有：1X Expand PCR缓冲液、100ng大肠杆菌基因组DNA、每种引物0.2μM、每种dNTP0.2mM和5.25U Expand DNA聚合酶，总体积100μL。PCR反应在MJ Research PTC100热循环仪中进行，条件如下：94℃预变性1分钟；然后94℃30秒、59℃45秒和72℃2分钟，共8个循环；接着94℃30秒、64℃45秒和72℃2分钟，共24个循环；以及最后72℃延伸7分钟。将扩增产物在1％TAE琼脂糖凝胶上进行电泳分离，从凝胶上切下1.0kb的片段并纯化。纯化的片段以ApaI限制性内切酶消化，经QIAquick PCR纯化柱纯化后，以XhoI限制性内切酶消化，再次用QIAquick PCR纯化柱纯化，并在微型凝胶上定量。
80ng含有大肠杆菌D-LDH基因的消化的PCR产物与80ng预先准备的pESC-His载体，使用T4 DNA连接酶，在16℃连接16小时。用1μL连接反应液通过电穿孔转化40μL大肠杆菌ElectromaxTMDH10BTM细胞。转化后的细胞涂布于LBC培养基上。使用克隆PCR，利用PCR引物LDHAPAF和LDHXHOR对克隆进行逐一筛选。将每个克隆悬浮于大约25μL 10mM Tris溶液中，取2μL悬浮液涂布于LBC培养基上。剩余的悬浮液在95℃加热10分钟使细菌细胞破碎，取2μL加热的细胞液用于25μL PCR反应中。PCR混合物含有：1X Taq缓冲液、每种引物0.2μM、每种dNTP 0.2mM和1U Taq DNA聚合酶。所用的PCR程序与上述用于从基因组DNA扩增核酸的程序相同。从含有预期插入片段的克隆的培养液中分离质粒DNA并测序，以证实不存在由PCR引起的核苷酸错误。
将序列已被证实的pESC-His/D-LDH载体的质粒DNA用于插入编码埃氏巨球菌PCT多肽的核酸。3μg质粒DNA用限制性内切酶PacI消化，消化片段用QIAquick PCR纯化柱纯化。然后将此载体DNA用限制性内切酶SpeI消化，并在1％的TAE琼脂糖凝胶上进行凝胶纯化。双酶切的载体DNA用虾碱性磷酸酶(Roche)脱磷酸化，然后用QIAquick PCR纯化柱纯化。
从基因组DNA上使用PCR引物对PCTSPEF和PCTPACR扩增了编码埃氏巨球菌PCT多肽的核酸。把PCTSPEF设计成在扩增片段的起始端引入了一个SpeI限制性内切酶位点和一个翻译起始位点。把引物PCTPACR设计成在扩增片段的末端引入了一个PacI限制性内切酶位点，并含有PCT基因的翻译终止密码子。PCR混合物含有：1XExpand PCR缓冲液、100ng埃氏巨球菌基因组DNA、每种引物0.2μM、每种dNTP 0.2mM和5.25U Expand DNA聚合酶，总体积100μL。PCR反应在MJ Research PTC100热循环仪中进行，条件如下：94℃预变性1分钟；然后94℃30秒、56℃45秒和72℃2.5分钟，共8个循环；接着94℃30秒、64℃45秒和72℃2.5分钟，共24个循环；以及最后72℃延伸7分钟。将扩增产物在1％TAE琼脂糖凝胶上进行电泳分离，从凝胶上切下1.55kb的片段并纯化。纯化的片段以PacI限制性内切酶消化，经QIAquick PCR纯化柱纯化后，以SpeI限制性内切酶消化，再次用QIAquick PCR纯化柱纯化，并在微型凝胶上定量。
95ng含有编码埃氏巨球菌PCT多肽的核酸的消化的PCR产物与75ng预先准备的pESC-His/D-LDH载体，使用T4 DNA连接酶，在16℃连接16小时。用1μL连接反应液通过电穿孔转化40μL大肠杆菌ElectromaxTM DH10BTM细胞。转化后的细胞涂布于LBC平板上。使用克隆PCR，利用PCR引物PCTSPEF和PCTPACR对克隆进行逐一筛选。将每个克隆悬浮于大约25μL 10mM Tris溶液中，取2μL悬浮液涂布于LBC培养基上。剩余的悬浮液在95℃加热10分钟使细菌细胞破碎，取2μL加热的细胞液用于25μL PCR反应中。PCR混合物含有：1X Taq缓冲液、每种引物0.2μM、每种dNTP 0.2mM和1U Taq DNA聚合酶。所用的PCR程序与上述用于从基因组DNA扩增核酸的程序相同。
从含有预期插入片段的克隆的培养液中分离质粒DNA并测序，以证实不存在由PCR引起的核苷酸错误。使用Frozen-EZ YeastTransformation IITM试剂盒(Zymo Research，Orange，CA)将带有被证实序列的构建体转入啤酒酵母YPH500菌株中。转化反应液涂布于SC-His培养基上。通过克隆PCR逐一筛选带有D-LDH和PCT基因的酵母克隆。克隆悬浮于20μL含有5U消解酶的Y裂解缓冲液(ZymoResearch)中，37℃加热10分钟。取3μL该悬浮液用于25μL PCR反应中，PCR反应混合物和程序与上述用于大肠杆菌转化子克隆筛选中的相同。pESC-His载体也被转入啤酒酵母YPH500菌株中，用做酶活分析的对照。这些转化子使用GAL1和GAL10引物进行克隆筛选。
实施例13、酶在啤酒酵母中的表达
A、转化酵母的水合酶活性
带有pESC-Trp/OS19构建体或pESC-Trp载体(阴性对照)的单个菌落接种于5mL含2％葡萄糖的SC-Trp培养基，于30℃培养16小时，用做种子接种于35mL同样的培养基。转接的培养物在30℃培养7小时，测定它们的OD600。取一定体积的细胞，该体积值与其OD值的乘积为40，沉淀细胞，用不含碳源的SC-Trp培养基洗涤，再次沉淀细胞。将细胞悬浮于5mL含2％半乳糖的SC-Trp培养基中，用做种子接种于100mL同样的培养基。培养物在30℃、250rpm生长17.5小时，然后沉淀细胞，用0.85％NaCl洗涤，再次沉淀细胞。沉淀的细胞(70mg)悬浮于140μL 50mM Tris-HCl(pH7.5)缓冲液中，加入等体积(沉淀细胞加缓冲液的体积)的预先清洗的玻璃珠(Sigma，150-212微米)。混合液震荡30秒，在冰上放置1分钟，这样的震荡/冷却循环再重复8次。然后将细胞在5,000g离心6分钟，将上清液转移到另一个管中。玻璃珠/沉淀细胞用250μL缓冲液洗两次，离心，上清液与第一次的上清液合并。
一株带有前述的pETBlue-1/OS19构建体的大肠杆菌菌株用做水合酶活性分析的阳性对照。该菌培养过夜达到饱和，在第二天早上用新鲜的LBC培养基稀释20倍，在37℃、250rpm培养直到OD600达到0.6，此时加入IPTG至终浓度为1mM进行诱导。细胞在37℃、250rpm继续培养2小时，沉淀细胞，用0.85％NaCl洗涤，再次沉淀细胞。使用BugBusterTM蛋白抽提试剂和Benzonase_(Novagen)参照生产商的说明，在室温温育20分钟破碎细胞。在4℃16,000g离心，将上清液转移到一个新管中，用于酶活分析。
上述的啤酒酵母细胞提取物中的总蛋白含量用Bio-Rad微板蛋白分析仪(Bio-Rad，Hercules，CA)定量测定。含有OS19构建体(ApaI-SalI和ApaI-KpnI位点)的YPH500、含有pESC-Trp阴性对照的YPH500以及含有pETBlue-1/OS19构建体的大肠杆菌都被用来检测它们将丙烯酰辅酶A转化为3-羟基丙酰辅酶A的能力。分析方法参照前述的含有pETBlue-1/OS19构建体的大肠杆菌Tuner菌株的分析方法。当在含有丙烯酰辅酶A的反应混合液中加入阴性对照菌的细胞提取物时，出现了一个分子量为823的主峰，这个峰对应于丙烯酰辅酶A，表明丙烯酰辅酶A没有被转化为任何其它产物。当在反应混合液中加入带有pESC-Trp/OS19构建体(ApaI-SalI或ApaI-KpnI位点)的菌株的细胞提取物时，主峰的位置移到分子量为841，这对应于3-羟基丙酰辅酶A。大肠杆菌对照菌的反应混合液也出现了分子量为841的峰。对pESC-Trp/OS19构建体(ApaI-SalI位点)进行了时间过程研究，在反应开始0、1、3、7、15、30和60分钟后测定了分子量为841和823的峰的出现。对于带有该载体的菌株和大肠杆菌对照菌株的细胞提取物，随着时间的进程观察到了3-羟基丙酰辅酶A的峰的增加，而带有载体的YPH500菌株的细胞提取物仅显示了一个丙烯酰辅酶A的主峰。
B、转化酵母的丙酰辅酶A转移酶活性
带有pESC-His/D-LDH或pESC-His/D-LDH/PTC构建体或不含插入片段的pESC-His载体(阴性对照)的单个菌落接种于5mL含2％葡萄糖的SC-His培养基，于30℃250rpm培养16小时，用做种子接种于35mL同样的培养基。转接的培养物在30℃培养7小时，测定它们的OD600。对每个菌株，取一定体积的细胞，该体积值与其OD值的乘积为40，沉淀细胞，用不含碳源的SC-His培养基洗涤，再次沉淀细胞。将细胞悬浮于5mL含2％半乳糖的SC-His培养基中，并用做种子接种于100mL同样的培养基。培养物在30℃、250rpm生长16.75小时，沉淀细胞，用0.85％NaCl洗涤，再次沉淀细胞。沉淀的细胞(70mg)悬浮于140μL 100mM磷酸钾(pH7.5)缓冲液中，加入等体积(沉淀细胞加缓冲液的体积)的预先清洗的玻璃珠(Sigma，150-212微米)。混合液震荡30秒，在冰上放置1分钟，这样的震荡/冷却循环再重复8次。然后细胞以5,000g离心6分钟，将上清液转移到另一个管中。玻璃珠/沉淀细胞用250μL缓冲液洗两次，离心，上清液与第一次的上清液合并。
一株带有前述的pETBlue-1/PCT构建体的大肠杆菌菌株用做丙酰辅酶A转移酶活性分析的阳性对照。该菌培养过夜达到饱和，在第二天早上用新鲜的含100μg/mL羧苄青霉素的LB培养基稀释20倍，在37℃、250rpm培养直到OD600达到0.6，此时加入IPTG至终浓度为1mM进行诱导。细胞在37℃、250rpm继续培养2小时，沉淀细胞，用0.85％NaCl洗涤，再次沉淀细胞。使用BugBusterTM蛋白抽提试剂和Benzonase_(Novagen)，参照生产商的说明，在室温温育20分钟破碎细胞。在4℃ 16,000g离心，将上清液转移到一个新管中，用于酶活分析。
细胞提取物中的总蛋白含量用Bio-Rad微板蛋白分析仪(Bio-Rad，Hercules，CA)定量测定。含有D-LDH和D-LDH/PCT构建体的啤酒酵母菌株YPH500、含有pESC-His阴性对照的YPH500以及含有pETBlue-1/PCT构建体的大肠杆菌都被用来检测它们将丙酰辅酶A和乙酸转化为乙酰辅酶A和丙酸的能力。分析方法参照前述的含有pETBlue-1/PCT构建体的大肠杆菌Tuner菌株的分析方法。
当在反应混合液中加入1μg阴性对照菌株或YPH500/pESC-His/D-LDH菌株的细胞提取物蛋白时，在长达11分钟的过程中没有观察到吸收值的增加(从0.00到0.00)。当在反应混合液中加入1μgYPH500/pESC-His/D-LDH/PCT菌株和大肠杆菌/PCT菌株的细胞提取物蛋白时，观察到的吸收值分别从0.00增加到0.04和从0.00增加到0.06。使用2mg细胞提取物总蛋白，阴性对照菌和YPH500/pESC-His/D-LDH菌株显示出吸收值在11分钟内从0.00增加到0.01，而YPH500/pESC-His/D-LDH/PCT菌株和大肠杆菌/PCT菌株观察到的吸收值分别从0.00增加到0.10和从0.00增加到0.08。
C、转化酵母的乳酰辅酶A脱水酶活性
带有pESC-His/D-LDH或pESC-His/D-LDH/PTC构建体或不含插入片段的pESC-His载体(阴性对照)的啤酒酵母YPH500菌株的单个菌落接种于5mL含4％葡萄糖的SC-His培养基，于30℃培养23小时，用做种子接种于35mL含2％棉子糖的SC-His培养基。转接的培养物在30℃培养8小时，测定它们的OD600。对每个菌株，取一定体积的细胞，该体积值与其OD值的乘积为40，沉淀细胞，将细胞悬浮于10mL含2％半乳糖的SC-His培养基中，用做种子接种于总体积为100mL同样的培养基。培养物在30℃、250rpm生长17小时，沉淀细胞，用0.85％NaCl洗涤，再次沉淀细胞。沉淀的细胞(190mg)悬浮于380μL100mM磷酸钾(pH7.5)缓冲液中，加入等体积(沉淀细胞加缓冲液的体积)的预先清洗的玻璃珠(Sigma，150-212微米)。混合液震荡30秒，在冰上放置1分钟，这样的震荡/冷却循环再重复7次。然后细胞以5,000g离心6分钟，将上清液转移到另一个管中。玻璃珠/沉淀细胞用300μL缓冲液洗两次，离心，将上清液与第一次的上清液合并。
一株厌氧生长的大肠杆菌DH10B菌株培养物用做D-LDH分析的阳性对照。该菌培养过夜达到饱和，在第二天早上用新鲜的LB培养基稀释20倍，在37℃厌氧培养7.5小时，沉淀细胞，用0.85％NaCl洗涤，再次沉淀细胞。使用BugBusterTM蛋白抽提试剂和Benzonase_(Novagen)，参照生产商的说明，在室温温育20分钟破碎细胞。在4℃16,000g离心，将上清液转移到一个新管中，用于酶活分析。
细胞提取物中的总蛋白含量用Bio-Rad微板蛋白分析仪(Bio-Rad，Hercules，CA)定量测定。含有D-LDH和D-LDH/PCT构建体的啤酒酵母菌株YPH500、含有pESC-His阴性对照的YPH500以及厌氧培养的大肠杆菌菌株都被用来检测它们将丙酮酸转化为乳酸的能力，分析方法为实时地分析NADH到NAD的氧化反应。分析反应混合物含：100mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)、0.2mM NADH和0.5-1.0μg细胞提取物。通过加入丙酮酸钠至终浓度为5mM来起始反应，在10分钟内测定340nm处吸收值的减少。当在反应混合液中加入0.5μg阴性对照菌株的细胞提取物总蛋白时，在200秒内观察到吸收值从-0.01减少到-0.02；当在反应混合液中加入YPH500/pESC-His/D-LDH或YPH500/pESC-His/D-LDH/PCT菌株的细胞提取物蛋白时，在200秒内观察到的吸收值分别从-0.21减少到-0.47和从-0.20减少到-0.47。0.5μL(7.85μg)厌氧生长的大肠杆菌菌株的细胞提取物显示出的吸收值的减少，与1μg YPH500/pESC-His/D-LDH/PCT菌株的细胞提取物显示出的很相似。使用4μg YPH500/pESC-His/D-LDH/PCT菌株的细胞提取物，在10分钟内观察到吸收值从-0.18减少到-0.60，而阴性对照菌株则没有显示出吸收值的减少(从-0.08到-0.08)。
D、在啤酒酵母中生产3-羟基丙酸的证明
使用Frozen-EZ Yeast Transformation IITM试剂盒(Zymo Research，Orange，CA)将pESC-Trp/OS19/EI、pESC-Leu/EIIa/EIIB和pESC-His/D-LDH/PCT构建体转化到同单个啤酒酵母菌株YPH500中。将pESC-Trp、pESC-Leu和pESC-His载体也转入到单个啤酒酵母菌株YPH500中作为阴性对照菌株。转化反应液涂布于SC-Trp-Leu-His培养基上。通过克隆PCR检测是否存在相应于每个构建体的核酸来逐一筛选单个酵母菌落。
带有所有6个基因的菌株和阴性对照菌株在5mL含2％葡萄糖的SC-Trp-Leu-His培养基上培养。于30℃培养31小时后，取2mL接种于50mL同样的培养基。转接的培养物在30℃培养19小时，测定它们的OD600。对每个菌株，取一定体积的细胞，该体积值与其OD值的乘积为100，沉淀细胞，用不含碳源的SC-Trp-Leu-His培养基洗涤，再次沉淀细胞。将细胞悬浮于10mL含2％半乳糖和2％绵子糖的SC-Trp-Leu-His培养基中，用做种子接种于总体积250mL同样的培养基。培养物在30℃不震荡的条件下生长于瓶中，在0、4.5、20、28.5、45和70小时取样。样品离心以除去细胞，上清液用0.45微米的Acrodisc针筒式过滤器过滤(Pall Gelman Laboratory，Ann Arbor，MI)。
使用6μg纯化的丙酰辅酶A转移酶、50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)和1mM乙酰辅酶A将100μL过滤的培养液中的任何乳酸或3-羟基丙酸衍生为其辅酶A酯。反应在室温进行15分钟，加入1倍体积的10％三氟乙酸终止反应。反应混合物按照前述的方法使用Sep Pak C18柱进行纯化，并用LC/MS分析。
实施例14、从β-丙氨酸生产有机酸的生物合成途径的构建
从β-丙氨酸生产3-羟基丙酸的一条可能的途径包括使用具有辅酶A转移酶活性(例如一类能够将辅酶A基团从一种代谢物转移到另一种代谢物的酶中的一种)的多肽。如图54所示，可以使用具有辅酶A转移酶活性的多肽和辅酶A供体如乙酰辅酶A和丙酰辅酶A将β-丙氨酸转化为β-丙氨酰辅酶A。或者，β-丙氨酰辅酶A还可以通过具有辅酶A合成酶活性的多肽的作用而形成。通过具有β-丙氨酰辅酶A脱氨酶活性的多肽，可以将β-丙氨酰辅酶A脱氨形成丙烯酰辅酶A。通过具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的多肽，可以将丙烯酰辅酶A在β位上水合产生3-羟基丙酰辅酶A。3-羟基丙酰辅酶A可以在具有辅酶A转移酶活性的多肽催化的反应中，作为辅酶A供体转移给β-丙氨酸，从而生成产物3-羟基丙酸。或者，3-羟基丙酰辅酶A也可以被具有特异性辅酶A水解酶活性的多肽水解产生3-羟基丙酸。
在本发明中，已经描述了对一个具有辅酶A转移酶活性的多肽进行分离、测序、表达和活性检测的方法。
A、有β-丙氨酰辅酶A脱氨酶活性的多肽的分离
具有β-丙氨酰辅酶A脱氨酶活性的多肽可以催化β-丙氨酰辅酶A转化为丙烯酰辅酶A。Vagelos等已描述了在丙酸梭状芽孢杆菌(Clostridum propionicum)中这种多肽的活性(J.Biol.Chem.，234：490-497(1959))。这种多肽可以用做丙酸梭状芽孢杆菌中丙烯酸途径的一部分，用于生产丙酸。
丙酸梭状芽孢杆菌于37℃无氧培养，培养基含0.2％酵母提取物、0.2％胰蛋白酶解蛋白胨、0.05％半胱氨酸、0.5％β-丙氨酸、0.4％VRB盐、5mM磷酸钾，pH7.0。细胞培养12小时后收获，用50mM磷酸钾(kpi)(pH7.0)洗两次。大约2g湿细胞重新悬浮于40mL缓冲液A中(含50mM磷酸钾，pH7.0，1mM MgCl2，1mM EDTA和1mM DTT)，超声破壁，功率大约85-100W，使用3mm探头(Branson sonifier 250)。在Centricon T-1080超速离心机中以100,000g离心45分钟除去细胞碎片，细胞提取物(活性约110U/mg)使用Source-15Q柱进行阴离子交换层析。Source-15Q柱载样32mL，在10倍柱体积内用0-0.5M NaCl线性梯度洗脱。该多肽在70-110mM NaCl之间被洗脱下来。
洗脱液加入(NH4)2SO4至终浓度为1M，上样到用1M(NH4)2SO4的缓冲液A平衡的Resource-Phe柱上。该多肽不与此柱结合。
样品用Amicon超滤浓缩(膜截留分子量30kDa)后得到最终制剂。功能性多肽由4个多肽亚基组成，每个亚基分子量为16kDa。使用标准分析方法(见下文)测得该多肽的最终比活为1033U/mg。
把每个纯化步骤后所取的多肽样品用15％SDS-PAGE凝胶进行分离。凝胶用0.1％考马斯亮兰R250染色，用7.1％乙酸/5％乙醇溶液脱色。
多肽用RP-HPLC脱盐，然后用气相Edman降解法测定N-端序列。分析结果获得了该多肽N-端序列的35个氨基酸。序列如下：MVGKKVVHHLMMSAK DAHYTGNLVNGARIVNQWGD(SEQ IDNO：177)。
B、基因片段的扩增
利用具有β-丙氨酰辅酶A脱氨酶活性的多肽的这35个氨基酸序列，设计了引物，用于从丙酸梭状芽孢杆菌(C.Propionicum)的基因组扩增相应的DNA。使用Gentra基因组DNA分离试剂盒(GentraSystems，Minneapolis)，根据革兰氏阳性菌的基因组DNA分离步骤，分离了丙酸梭状芽孢杆菌的基因组DNA。参照丙酸梭状芽孢杆菌的密码子使用表反向翻译了氨基酸序列两端的7个氨基酸，获得了20个核苷酸的简并引物：
ACLF：5’-ATGGTWGGYAARAARGTWGT-3’(SEQ ID NO：178)
ALCR：5’-TCRCCCCAYTGRTTWACRAT-3’(SEQ ID NO：179)
PCR反应混合物含有：1X Taq PCR缓冲液、每种引物0.6μM、每种dNTP 0.2mM、2U Taq DNA聚合酶(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)、2.5％(v/v)DMSO和100ng基因组DNA，总体积50μL。在PCR过程中使用了递减程序，在58℃退火4个循环，56℃退火4个循环，54℃退火4个循环，以及52℃退火24个循环。每一循环中94℃变性30秒和72℃延伸1.25分钟。起始时在94℃预变性2分钟，结束时在72℃最后延伸5分钟。反应中使用的PCR引物的量比常规PCR中的引物量高3倍，这是由于引物3’端的简并性。此外，使用每个单独引物分开进行了PCR反应，以鉴定从单一简并引物获得的PCR产物。20μL的每个PCR产物用2.0％TAE(Tris-乙酸-EDTA)的琼脂糖凝胶进行电泳分离。
在同时含有正向和反向引物的反应中产生了一条大约为100bp的条带，但在单独使用正向或反向引物的反应中则没有。从胶上切下该片段，使用QIAquick凝胶抽提试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)进行纯化。将4μL纯化的条带连接到pCRII-TOPO载体，使用TOPO克隆程序(Invitrogen，Carlsbad，CA)通过热激法转入大肠杆菌TOP10细胞。转化子涂布于含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL X-gal的LB培养基上。将单个白色的菌落重悬浮于25μL10mM Tris溶液中，在95℃加热10分钟使细菌细胞破碎，取2μL加热的细胞液用于25μLPCR反应中，使用与pCRII-TOPO载体同源的M13R和M13F通用引物。PCR混合物含有：1X Taq PCR缓冲液、每种引物0.2μM、每种dNTP 0.2mM和1U Taq DNA聚合酶。PCR反应在MJ Research PTC100热循环仪中进行，条件如下：94℃预变性2分钟；然后94℃30秒、52℃1分钟，和72℃1.25分钟，共30个循环；最后72℃延伸7分钟。从显示所需插入片段的克隆的培养液中提取质粒DNA(使用QIAprep Spin微量抽提试剂盒，Qiagen)，并使用M13R通用引物进行DNA测序。位于简并引物内部，对应于35个氨基酸残基序列部分的核酸序列如下：5’-
ACATCATTTAATGATGAGCGCAAAAGATGCTCACTATACTGGAAAC
TTAGTAAACGGCGCTAGA-3’(SEQ ID NO：180)。
C、基因组步查法获得完整的编码序列
利用了位于简并引物内部的核酸序列的部分设计了进行基因组步查的上游和下游方向引物。引物序列如下：
ACLGSP1F：5’-GTACATCATTTAATGATGAGCGCAAAAGATG-3’(SEQ ID NO：181)
ACLGSP2F：5’-GATGCTCACTATACTGGAAACTTAGTAAAC-3’(SEQ ID NO：182)
ACLGSP1R：5’-ATTCTAGCGCCGTTTACTAAGTTTCCAG-3’(SEQ ID NO：183)
ACLGSP2R：5’-CCAGTATAGTGAGCATCTTTTGCGCTCATC-3’(SEQ ID NO：184)
GSP1F和GSP2F引物面向下游，而GSP1R和GSP2R引物面向上游，并且，GSP2F和GSP2R引物分别嵌套于GSP1F和GSP1R引物之内。按照CLONTECH的通用基因组步查试剂盒(ClonTechLaboratories，Inc.，Palo Alto，CA)手册来进行基因组步查文库的构建，除了DraI、EcoRV和PvuII外还使用SspI和HincII限制性酶来产生文库。在Perkin Elmer 9700热循环仪上进行PCR反应，反应混合物含：1X XL缓冲液II、每种dNTP0.2mM、1.25mM Mg(OAc)2、每种引物0.2μM、2U rTH DNA聚合酶XL(Applied Biosystems，FosterCity，CA)以及1μL文库，总体积50μL。第一轮PCR反应条件：94℃预变性5秒；然后94℃2秒和70℃3分钟，共7个循环，接着94℃2秒和64℃3分钟，共32个循环；以及最后64℃延伸4分钟。第二轮PCR采用：94℃预变性15秒；然后94℃5秒和70℃3分钟，共5个循环；接着94℃5秒和64℃3分钟，共26个循环；以及最后66℃延伸7分钟。第一和第二轮PCR产物各20μL在1％TAE的琼脂糖凝胶上进行电泳分离。在第二轮正向的PCR反应中，使用DraI文库获得了一条1.4Kb的条带，使用HincII文库获得了一条1.5Kb的条带，使用PvuII文库获得了一条4.0Kb的条带，以及使用SspI文库获得了2.0和2.6Kb的条带；在第二轮反向的PCR反应中，使用DraI文库获得了一条1.5Kb的条带，使用EcoRV文库获得了一条0.8Kb的条带，使用HincII文库获得了一条2.0Kb的条带，使用PvuII文库获得了一条2.9Kb的条带，以及使用SspI文库获得了一条1.5Kb的条带。这几个片段被凝胶纯化、克隆和测序。
具有β-丙氨酰辅酶A脱氨酶活性的多肽的编码序列见SEQ IDNO：162。该编码序列编码的氨基酸序列见SEQ ID NO：160。该编码序列在细菌细胞中进行了克隆和表达。具有预期大小的多肽被分离并进行酶活性检测。
在本发明中已经描述了编码具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性(例如图54中的第七种酶活性，其可以由具有SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列的多肽实现)的多肽的核酸分子的分离。这种多肽与具有辅酶A转移酶活性的多肽(例如具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽)和具有β-丙氨酰辅酶A脱氨酶活性的多肽(例如具有SEQ IDNO：160所示的氨基酸序列的多肽)结合起来，提供了一种从β-丙氨酸生产3-羟基丙酸的方法。
实施例15、从β-丙氨酸生产有机酸的生物合成途径的构建
在另一条途径中，从天冬氨酸产生的β-丙氨酸可以被一种具有4，4-氨基丁酸氨基转移酶活性的多肽脱氨(图55)。该反应也能使在形成天冬氨酸时消耗的谷氨酸再生。β-丙氨酸脱氨可以产生丙二酸半醛，它可进一步被具有3-羟基丙酸脱氢酶活性的多肽或具有3-羟基异丁酸脱氢酶活性的多肽还原，生成3-羟基丙酸。这些多肽可以通过下述方法获得。
A、从丙酮丁醇梭菌(C.Acetobutvcilicum)克隆gabT(4-氨基 丁酸氨基转移酶)
根据已发表的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutycilicus)gabT基因(GenBank#AE007654)的序列设计了如下PCR引物：
Cac aba nco sen：5’-GAGCCATGGAAGAAATAAATGCTAAAG-3’(SEQ ID NO：185)
Cac aba bam anti：5’-AGAGGATGGCTTTTTAAATCGCTATTC-3’(SEQ ID NO：186)
这些引物在5’端引入了一个NcoI位点，在3’端引入了一个BamHI位点。以C.acetobutycilicum的染色体DNA为模板，建立了如下的PCR反应：
水                           80.75μL              PCR程序
Taq Plus Long10X缓冲液       10μL                 94℃5分钟
DNTP混合物(10mM)             3μL                  25个循环：
Cac aba nco sen(20mM)        2μL                  94℃30秒
Cac aba bam anti(20mM)       2μL                  50℃30秒
丙酮丁醇梭菌DNA(～100ng)    1μL                  72℃80秒每循环加2秒
Taq Plus Long(5U/mL)         1μL                  1个循环：
Pfu(2.5U/mL)                 0.25μL               68℃7分钟
                                                   4℃保存直到使用
在琼脂糖凝胶上进行分析发现了一个单一条带，大小约为1.3Kb。使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化了该片段，使用TOPO Zero Blunt PCR克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)克隆到pCRII TOPO中。取1μL pCRII TOPO连接反应液转化大肠杆菌TOP10的化学感受态细胞。细胞在SOC培养基中培养1小时，在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选转化子。转化子的单菌落在含有卡那霉素的LB培养基中生长过夜，使用微量制备试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)提取质粒DNA。超螺旋的质粒DNA在1％琼脂糖凝胶上分离，酶切，筛选带有插入的克隆。对插入片段进行测序以证实它的序列和特性。
具有正确插入片段的质粒用限制性内切酶NcoI和BamHI消化。对消化后的插入片段进行凝胶分离，并连接到用限制性内切酶NcoI和BamHI消化的表达载体pET28b中。取1μL连接混合液转化大肠杆菌TOP10的化学感受态细胞。细胞在SOC培养基中恢复1小时，在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选转化子。超螺旋的质粒DNA在1％琼脂糖凝胶上分离，酶切，筛选带有插入片段的克隆。使用微量制备试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)分离带有插入片段的质粒，取1μL质粒DNA转化BL21(DE3)电感受态细胞(Novagen，Madison，WI)。这些细胞被用来检查具有4-氨基丁酸氨基转移酶活性的多肽的表达。
B、从铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa)克隆mmsB(3-羟基异丁酸 脱氢酶)
根据已发表的铜绿假单胞菌(Psedomonas aeruginosa)mmsB基因(GenBank#M84911)的序列设计了如下PCR引物：
Ppu hid nde sen：5’-ATACATATGACCGACCGACATCGCATT-3’(SEQ ID NO：186)
Ppu hid sal anti：5’-ATAGTCGACGGGTCAGTCCTTGCCGCG-3’(SEQ ID NO：187)
这些引物在5’端引入了一个NdeI位点，在3’端引入了一个BamHI位点。
水 80.75μL  PCR程序
Taq Plus Long 10X缓冲液 10μL  94℃5分钟
DNTP混合物(10mM) 3μL  25个循环：
 94℃30秒
 55℃30秒
 72℃90秒每循环加2秒
Ppu hid nde sen(20μM) 2μL  68℃7分钟
Ppu hid sal anti(20μM) 2μL  4℃保存直到使用
丙酮丁醇梭菌DNA(～100ng) 1μL
Taq Plus Long(Stratagene，La Jolla，CA) 1μL
Pfu(Stratagene，La Jolla，CA) 0.25μL
以铜绿假单胞菌的染色体DNA为模板，建立了如下的PCR反应，染色体DNA从ATCC(Manassas，VA)P.aeruginosa 17933D获得。
在琼脂糖凝胶上进行分析发现了一个单一条带，大小约为1.6Kb。使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化了该片段，并使用TOPO Zero Blunt PCR克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)克隆到pCRII TOPO中。取1μL pCRII TOPO连接混合液转化大肠杆菌TOP10的化学感受态细胞。细胞在SOC培养基中恢复1小时，在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选转化子。转化子的单菌落在含有卡那霉素的LB培养基中生长过夜，使用微量制备试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)提取质粒DNA。超螺旋的质粒DNA在1％琼脂糖凝胶上分离，酶切，筛选带有插入片段的克隆。对插入片段进行测序以证实它的序列和特性。
具有正确插入片段的质粒用限制性内切酶NdeI和BamHI消化。对消化后的插入片段进行凝胶分离，并连接到用限制性内切酶NcoI和BamHI消化的表达载体pET30a中。取1μL连接混合液转化大肠杆菌TOP10的化学感受态细胞。细胞在SOC培养基中恢复1小时，并在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选转化子。超螺旋的质粒DNA在1％琼脂糖凝胶上分离、酶切、筛选带有插入片段的克隆。使用微量制备试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)分离带有插入片段的质粒，取1μL质粒DNA转化BL21(DE3)电感受态细胞(Novagen，Madison，WI)。这些细胞被用来检查具有3-羟基异丁酸脱氢酶活性的多肽的表达。
其它实施方案
结合其详细说明，本发明已进行了描述，可以理解的是，上述描述的目的只是举例说明，而并不是对本发明的范围进行限制；本发明的范围由所附的权利要求进行限定。其它的方面、优点和修饰都在下面的权利要求的范围之内。

Claims (90)

1.一种含有乳酰辅酶A脱水酶活性和3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的细胞。
2.权利要求1所述的细胞，其含有的一种活性选自E1激活因子、E2α和E2β活性。
3.权利要求1所述的细胞，其含有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性。
4.权利要求1所述的细胞，其含有辅酶A转移酶活性。
5.权利要求1所述的细胞，其含有具下列序列的外源核酸：
(a)SEQ ID NO：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162或163中所述的序列；或
(b)与SEQ ID NO：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162或163中所述的序列具有至少65％的序列同一性的核酸序列。
6.权利要求1所述的细胞，其含有3-羟基丙酰辅酶A水解酶活性或3-羟基异丁酰辅酶A水解酶活性。
7.权利要求1所述的细胞，其含有脂肪酶活性。
8.权利要求1所述的细胞，其生产3-羟基丙酸。
9.权利要求1所述的细胞，其生产3-羟基丙酸酯。
10.权利要求9所述的细胞，其中所述酯选自3-羟基丙酸甲酯、3-羟基丙酸乙酯、3-羟基丙酸丙酯、3-羟基丙酸丁酯和3-羟基丙酸-2-乙基已酯。
11.权利要求1所述的细胞，其含有辅酶A合成酶活性。
12.权利要求1所述的细胞，其含有聚羟酸合酶活性。
13.权利要求1所述的细胞，其生产聚3-羟基丙酸。
14.权利要求1所述的细胞，其为原核细胞。
15.权利要求1所述的细胞，其选自酵母(yeast)、乳杆菌(lactobacillu)、乳球菌(lactococcus)、芽孢杆菌(Bacillus)和埃希氏杆菌(Escherichia)细胞。
16.一种含有辅酶A合成酶活性、乳酰辅酶A脱水酶活性和聚羟酸合酶活性的细胞。
17.权利要求16所述的细胞，其含有的一种活性选自E1激活因子、E2α和E2β活性。
18.权利要求16所述的细胞，其生产聚丙烯酸。
19.权利要求16所述的细胞，其为原核细胞。
20.权利要求16所述的细胞，其选自酵母、乳杆菌、乳球菌、芽孢杆菌或埃希氏杆菌细胞。
21.一种含有辅酶A转移酶活性、乳酰辅酶A脱水酶活性和脂肪酶活性的细胞。
22.权利要求21所述的细胞，其含有的一种活性选自E1激活因子、E2α和 E2β活性。
23.权利要求21所述的细胞，其生产丙烯酸酯。
24.权利要求23所述的细胞，其中所述酯选自丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯和丙烯酸丁酯。
25.权利要求21所述的细胞，其为原核细胞。
26.权利要求21所述的细胞，其选自酵母、乳杆菌、乳球菌、芽孢杆菌和埃希氏杆菌细胞。
27.一种多肽，其氨基酸序列选自：
(a)SEQ ID NO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161中所述的序列；
(b)具有SEQ ID NO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161中所述的序列中的至少10个连续氨基酸残基的序列；
(c)与SEQ ID NO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161中所述的序列具有至少65％的序列同一性的序列；
(d)与SEQ ID NO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161中所述的序列中的至少10个连续氨基酸残基具有至少65％的序列同一性的序列；和
(e)SEQ ID NO：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160或161中所述的序列，其含有至少一个保守替代。
28.一种核酸分子，其含有编码权利要求27所述的多肽的核酸序列。
29.一种转化细胞，其含有至少一种外源核酸分子，其中所述分子含有编码权利要求27所述的多肽的核酸序列。
30.权利要求29所述的细胞，其生产3-羟基丙酸。
31.权利要求29所述的细胞，其中所述外源核酸分子编码具有乳酰辅酶A脱水酶活性的酶的E2α多肽。
32.权利要求29所述的细胞，其中所述外源核酸分子编码具有乳酰辅酶A脱水酶活性的酶的E2β多肽。
33.权利要求29所述的细胞，其中所述外源核酸分子编码具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性或辅酶A转移酶活性的多肽。
34.权利要求29所述的细胞，其中所述外源核酸分子编码具有3-羟基丙酰辅酶A水解酶活性或3-羟基异丁酰辅酶A水解酶活性的多肽。
35.权利要求29所述的细胞，其含有脂肪酶活性。
36.权利要求29所述的细胞，其生产3-羟基丙酸酯。
37.权利要求36所述的细胞，其中所述酯选自3-羟基丙酸甲酯、3-羟基丙酸乙酯、3-羟基丙酸丙酯、3-羟基丙酸丁酯和3-羟基丙酸-2-乙基已酯。
38.权利要求29所述的细胞，其含有辅酶A合成酶活性。
39.权利要求29所述的细胞，其生产聚3-羟基丙酸。
40.权利要求29所述的细胞，其是原核细胞。
41.权利要求29所述的细胞，其选自乳杆菌、乳球菌、芽孢杆菌和埃希氏杆菌细胞。
42.权利要求29所述的细胞，其为酵母细胞。
43.一种特异性结合剂，其与权利要求27所述的多肽特异性结合。
44.一种分离的核酸分子，其所含的核酸序列选自：
(a)SEQ ID NO：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162或163中所述的序列；
(b)具有SEQ ID NO：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162或163中所述的序列中的至少10个连续核苷酸的序列；
(c)与SEQ ID NO：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162或163中所述的序列具有至少65％的序列同一性的序列；
(d)与SEQ ID NO：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162或163中所述的序列中的至少10个连续核苷酸具有至少65％的序列同一性的序列；和
(e)在中度严格条件下，与SEQ ID NO：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162或163中所述的序列杂交的序列。
45.一株生产细胞，其含有权利要求44所述的分离的核酸分子，该核酸分子对所述生产细胞来说是外源的。
46.权利要求45所述的细胞，其中所述分离的核酸分子编码一条具有一种选自下列酶活性的多肽：辅酶A转移酶活性、乳酰辅酶A脱水酶活性、辅酶A合成酶活性、辅酶A脱水酶活性、脱氢酶活性、丙二酸单酰辅酶A还原酶活性和3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性。
47.一种生产多肽的方法，其包括在让权利要求45所述的细胞产生所述多肽的条件下培养该细胞，其中生产所述多肽。
48.一种生产3-羟基丙酸的方法，其包括在能够生产3-羟基丙酸的条件下培养至少一种细胞，该细胞含有至少一种外源核酸分子，所述分子编码至少一种能从磷酸烯醇式丙酮酸生产3-羟基丙酸的多肽。
49.权利要求48所述的方法，其中所述细胞选自酵母、乳杆菌、乳球菌、芽孢杆菌和埃希氏杆菌细胞。
50.权利要求48所述的方法，其中3-羟基丙酸是通过一条利用β-丙氨酸为中间体的生物合成途径生产的。
51.权利要求48所述的方法，其中3-羟基丙酸是通过一条利用丙二酸单酰辅酶A为中间体的生物合成途径生产的。
52.权利要求48所述的方法，其中3-羟基丙酸是通过一条利用乳酸为中间体的生物合成途径生产的。
53.一种生产3-羟基丙酸的方法，其包括在能够生产3-羟基丙酸的条件下培养至少一种细胞，该细胞含有至少一种外源核酸分子，所述分子编码至少一种能从乳酸生产3-羟基丙酸的多肽。
54.权利要求53所述的方法，其中所述细胞选自酵母、乳杆菌、乳球菌、芽孢杆菌和埃希氏杆菌细胞。
55.一种生产3-羟基丙酸的方法，其包括在其中细胞生产3-羟基丙酸的条件下培养至少一种细胞，所述细胞含有乳酰辅酶A脱水酶活性和3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性。
56.权利要求55所述的方法，其中所述细胞选自酵母、乳杆菌、乳球菌、芽孢杆菌和埃希氏杆菌细胞。
57.权利要求55所述的方法，其中所述细胞含有辅酶A转移酶活性。
58.权利要求55所述的方法，其中所述细胞含有3-羟基丙酰辅酶A水解酶活性或3-羟基异丁酰辅酶A水解酶活性。
59.一种生产3-羟基丙酸的方法，该方法包括：
(a)将乳酸与具有辅酶A转移酶活性的第一个多肽接触，产生乳酰辅酶A；
(b)将所述乳酰辅酶A与具有乳酰辅酶A脱水酶活性的第二个多肽接触，产生丙烯酰辅酶A；
(c)将所述丙烯酰辅酶A与具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的第三个多肽接触，产生3-羟基丙酰辅酶A；和
(d)将所述3-羟基丙酰辅酶A与所述第一个多肽接触，产生3-羟基丙酸，或与具有3-羟基丙酰辅酶A水解酶活性或3-羟基异丁酰辅酶A水解酶活性的第四个多肽接触，产生3-羟基丙酸。
60.一种生产聚3-羟基丙酸的方法，其包括在其中细胞生产聚3-羟基丙酸的条件下培养该细胞，所述细胞含有乳酰辅酶A脱水酶活性和3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性。
61.权利要求60所述的方法，其中所述细胞选自酵母、乳杆菌、乳球菌、芽孢杆菌和埃希氏杆菌细胞。
62.权利要求60所述的方法，其中所述细胞含有辅酶A合成酶活性。
63.权利要求60所述的方法，其中所述细胞含有聚羟酸合酶活性。
64.一种生产聚3-羟基丙酸的方法，该方法包括：
(a)将乳酸与具有辅酶A合成酶活性的第一个多肽接触，产生乳酰辅酶A；
(b)将所述乳酰辅酶A与具有乳酰辅酶A脱水酶活性的第二个多肽接触，产生丙烯酰辅酶A；
(c)将所述丙烯酰辅酶A与具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的第三个多肽接触，产生3-羟基丙酰辅酶A；和
(d)将所述3-羟基丙酰辅酶A与具有聚羟酸合酶活性的第四个多肽接触，产生聚3-羟基丙酸。
65.一种生产3-羟基丙酸酯的方法，其包括在其中细胞生产所述3-羟基丙酸酯的条件下培养该细胞，所述细胞含有乳酰辅酶A脱水酶活性和3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性。
66.权利要求65所述的方法，其中所述细胞选自酵母、乳杆菌、乳球菌、芽孢杆菌和埃希氏杆菌细胞。
67.权利要求65所述的方法，其中所述细胞含有辅酶A转移酶活性。
68.权利要求65所述的方法，其中所述细胞含有3-羟基丙酰辅酶A水解酶活性或3-羟基异丁酰辅酶A水解酶活性。
69.一种生产3-羟基丙酸酯的方法，该方法包括：
(a)将乳酸与具有辅酶A转移酶活性的第一个多肽接触，产生乳酰辅酶A；
(b)将所述乳酰辅酶A与具有乳酰辅酶A脱水酶活性的第二个多肽接触，产生丙烯酰辅酶A；
(c)将所述丙烯酰辅酶A与具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的第三个多肽接触，产生3-羟基丙酰辅酶A；
(d)将所述3-羟基丙酰辅酶A与所述第一个多肽接触，产生3-羟基丙酸，或与具有3-羟基丙酰辅酶A水解酶活性或3-羟基异丁酰辅酶A水解酶活性的第四个多肽接触，产生3-羟基丙酸；和
(e)将所述3-羟基丙酸与具有脂肪酶活性的第五个多肽接触，产生3-羟基丙酸酯。
70.一种生产聚丙烯酸的方法，其包括在其中细胞生产所述聚丙烯酸的条件下培养该细胞，所述细胞含有辅酶A合成酶活性和乳酰辅酶A脱水酶活性。
71.权利要求70所述的方法，其中所述细胞选自酵母、乳杆菌、乳球菌、芽孢杆菌和埃希氏杆菌细胞。
72.权利要求70所述的方法，其中所述细胞含有聚羟酸合酶活性。
73.一种生产聚丙烯酸的方法，该方法包括：
(a)将乳酸与具有辅酶A合成酶活性的第一个多肽接触，产生乳酰辅酶A；
(b)将所述乳酰辅酶A与具有乳酰辅酶A脱水酶活性的第二个多肽接触，产生丙烯酰辅酶A；和
(c)将所述丙烯酰辅酶A与具有聚羟酸合酶活性的第三个多肽接触，产生聚丙烯酸。
74.一种生产丙烯酸酯的方法，其包括在其中细胞生产该丙烯酸酯的条件下培养该细胞，所述细胞含有辅酶A转移酶活性和乳酰辅酶A脱水酶活性。
75.权利要求74所述的方法，其中所述细胞选自酵母、乳杆菌、乳球菌、芽孢杆菌和埃希氏杆菌细胞。
76.权利要求74所述的方法，其中所述细胞含有脂肪酶活性。
77.一种生产丙烯酸酯的方法，该方法包括：
(a)将乳酸与具有辅酶A转移酶活性的第一个多肽接触，产生乳酰辅酶A；
(b)将所述乳酰辅酶A与具有乳酰辅酶A脱水酶活性的第二个多肽接触，产生丙烯酰辅酶A；
(c)将所述丙烯酰辅酶A与所述第一个多肽接触，产生丙烯酸；和
(d)将所述丙烯酸与具有脂肪酶活性的第三个多肽接触，产生该丙烯酸酯。
78.一种生产3-羟基丙酸的方法，其包括在其中所述细胞生产3-羟基丙酸的条件下培养该细胞，所述细胞含有至少一种外源核酸，所述核酸编码至少一种多肽，以使在所述3-羟基丙酸能够生产的条件下从乙酰辅酶A中生产所述3-羟基丙酸。
79.权利要求78所述的方法，其中所述细胞选自酵母、乳杆菌、乳球菌、芽孢杆菌和埃希氏杆菌细胞。
80.一种生产3-羟基丙酸的方法，其包括在其中细胞生产3-羟基丙酸的条件下培养该细胞，所述细胞含有至少一种外源核酸，所述核酸编码至少一种多肽，以使在所述3-羟基丙酸能够生产的条件下从丙二酸单酰辅酶A生产所述3-羟基丙酸。
81.权利要求80所述的方法，其中所述细胞选自酵母、乳杆菌、乳球菌、芽孢杆菌和埃希氏杆菌细胞。
82.一种生产3-羟基丙酸的方法，其包括在其中细胞生产3-羟基丙酸的条件下培养该细胞，所述细胞含有至少一种外源核酸，所述核酸编码至少一种多肽，以使在所述3-羟基丙酸能够生产的条件下从β-丙氨酸生产3-羟基丙酸。
83.权利要求82所述的方法，其中所述细胞选自酵母、乳杆菌、乳球菌、芽孢杆菌和埃希氏杆菌细胞。
84.一种生产3-羟基丙酸的方法，其包括在能够生产3-羟基丙酸的条件下培养细胞，所述细胞含有一种外源核酸，所述核酸编码能够从乙酰辅酶A生产3-羟基丙酸的多肽。
85.权利要求84所述的方法，其中所述细胞选自酵母、乳杆菌、乳球菌、芽孢杆菌和埃希氏杆菌细胞。
86.一种生产3-羟基丙酸的方法，其包括在能够生产3-羟基丙酸的条件下培养细胞，所述细胞含有至少一种外源核酸，所述核酸编码能够从丙二酸单酰辅酶A生产3-羟基丙酸的多肽。
87.权利要求86所述的方法，其中所述细胞选自酵母、乳杆菌、乳球菌、芽孢杆菌和埃希氏杆菌细胞。
88.一种生产3-羟基丙酸的方法，该方法包括：
(a)将乙酰辅酶A与具有乙酰辅酶A羧化酶活性的第一个多肽接触，产生丙二酸单酰辅酶A；和
(b)将所述丙二酸单酰辅酶A与具有丙二酸单酰辅酶A还原酶活性的第二个多肽接触，产生所述3-羟基丙酸。
89.一种生产3-羟基丙酸的方法，该方法包括将丙二酸单酰辅酶A与具有丙二酸单酰辅酶A还原酶活性的多肽接触，从而产生所述3-羟基丙酸。
90.一种生产3-羟基丙酸的方法，该方法包括：
(a)将β-丙氨酰辅酶A与具有β-丙氨酰辅酶A脱氨酶活性的第一个多肽接触，产生丙烯酰辅酶A；
(b)将所述丙烯酰辅酶A与具有3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的第二个多肽接触，产生3-羟基丙酰辅酶A；和
(c)将3-羟基丙酰辅酶A与具有谷氨酸脱氢酶活性的第三个多肽接触，产生3-羟基丙酸。
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