CN1631902A - 一种当归多糖及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种当归多糖，由下法制得：将当归醇沉物溶于蒸馏水，用Sevag法去蛋白直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，离心除去沉淀；保留水相，加入无水乙醇，沉淀多糖，弃上清液，所得沉淀物以无水乙醇洗涤，经冷冻干燥后，凝胶分子排阻层析分离，收集相对分子质量范围在1,0000－11,0000之间的分离产物，再经冷冻干燥后得到当归多糖。本发明的当归多糖对化学物质和热刺激引起的疼痛有明显镇痛作用，并能有效对抗雌性激素诱发“痛经”所引起的疼痛反应；可用于制备镇痛药物尤其是治疗痛经药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种当归多糖及其制备方法和用途。
背景技术
当归属补益药，为伞形科(umbuiferae)当归属多年生草本植物当归[AngelicaSinensis(Oliv)Diels]的干燥根。当归有补血和血，活血化瘀，调经止痛之功效，临床上常依症将当归与其它药物配伍使用，用于月经不调、痛经、血虚头痛、腰腹疼痛等症。
当归的化学组成包括挥发油和水溶性组分两大部分。早期研究曾指出当归油对各种动物离体子宫，不论受孕者或未孕者都有弛缓作用。它在一定程度上为当归用于痛经治疗做出了解释。
当归多糖存在于当归水溶性部位，它是由分子量不同的高分子化合物组成的同系混合物。近年来，当归多糖已被证明具有复杂的生物活性，能够调节机体的免疫功能，对抗皮质激素所引起的抑制，防止外周白细胞的减少和辐射损伤中的照射后效应，增强机体造血功能和抗肿瘤作用。
疼痛是常见的临床症状，寻找安全有效的非成瘾性镇痛药物一直是药物工作者十分重视的问题。“痛经”更是妇科常见病，中医认为其发病机理主要是气血受阻，血行不畅所致。当归作为中医的妇科要药，如何寻找到其有效治疗成分以进行中药现代化改革，使其符合现代剂型要求，是药物学界的研究热点。
《中国药学杂志》2002；37(10)：746-8“当归粗多糖镇痛作用的实验研究”揭示当归粗多糖具有镇痛作用，但所用当归粗多糖中糖含量相对较低，还含有其它成分，且镇痛效果不明显。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种当归多糖制备方法和用途，所得当归多糖具有明显镇痛作用，尤其是治疗“痛经”有明显的效果。
本发明提供的技术方案是：一种当归多糖，由下法制得：将当归醇沉物溶于蒸馏水，用Sevag法去蛋白直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，离心除去沉淀；保留水相，加入无水乙醇，沉淀多糖，弃上清液，所得沉淀物以无水乙醇洗涤，经冷冻干燥后，凝胶分子排阻层析分离，收集相对分子质量范围在1,0000-11,0000之间的分离产物，再经冷冻干燥后得到当归多糖。
本发明还提供了上述当归多糖的制备方法，将当归醇沉物溶于蒸馏水，用Sevag法去蛋白直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，离心除去沉淀；保留水相，加入无水乙醇，沉淀多糖，弃上清液，所得沉淀物以无水乙醇洗涤至洗涤液呈无色，弃去洗涤液，洗涤后的沉淀物经冷冻干燥，凝胶分子排阻层析分离，收集相对分子质量范围在1,0000-11,0000之间的分离产物，再经冷冻干燥后得到当归多糖。
本发明中的上述原料当归醇沉物可来自中药制备过程中中药材常用提取方法所得当归醇沉物：即当归经水煮得到水提取物，水提取物经乙醇提取后的沉淀物。
本发明所得到的上述当归多糖属于聚合物，其分子量代表的是相似链长的平均配布。经鉴定本发明的当归多糖的物化性质为：相对分子质量范围在1,0000-11,0000之间(采用凝胶渗透色谱-激光光散射联用技术)，易溶于水，糖含量大于95％，经HPLC检测表明主要由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖和木糖组成，并且紫外吸收光谱显示192nm处有明显吸收峰；红外吸收光谱分析，在3352cm-1、2940cm-1、1747cm-1、1626cm-1、1414cm-1、1237cm-1、1021cm-1及536cm-1处表现为典型的多糖吸收峰。
本发明的上述当归多糖在制备镇痛药物尤其是治疗痛经药物中的用途。如将本发明的当归多糖用于制备胶囊、片剂、颗粒剂以及注射剂，所得药物具有明显的镇痛作用，尤其是治疗“痛经”效果显著。
按背景技术中的当归粗多糖(糖含量为65.5％)一次性口服给药0.25g/kg时，对化学物质和热刺激引起疼痛的模型有明显镇痛作用，而本发明的当归多糖在一次性口服给药0.025g/kg时即可产生相当作用，使用剂量下降90％，并且随剂量增加镇痛作用增强。
具体实施方式
以下结合具体的实例对本发明的技术方案作进一步说明：
本发明中的上述原料当归醇沉物可来自中药制备过程中中药材常用提取方法所得当归醇沉物：即当归经水煮得到水提取物，水提取物经乙醇提取后的沉淀物。
当归醇沉物也可由下法得到：所述当归醇沉物按下法制得，取当归饮片，加入5～7倍当归饮片重量的水煎煮30～60分钟，滤过；将所得药渣加入3～6倍重量(药渣)的水进行煎煮30～50分钟，滤过；所得药渣加入3～6倍重量(药渣)的水煎煮30～50分钟，滤过；合并三次滤液，并将滤液浓缩；合并三次滤液，浓缩，冷却至室温，加入乙醇至乙醇含量为40％～60％(体积比，下同)，2～4℃冷藏24～48小时，滤过，得沉淀物；再次浓缩，加入乙醇至乙醇含量为70％～80％，2～4℃冷藏24～48小时，滤过，得沉淀物；第三次浓缩，加入乙醇至乙醇含量为80％～90％，2～4℃冷藏24～48小时，滤过，得沉淀物；合并三次沉淀物得当归醇沉物。
本发明当归多糖的制备：将当归醇沉物溶于蒸馏水，加入乙醇至乙醇含量为70％～80％抽提，2～4℃冷藏24～48小时，弃上清，保留沉淀，重复进行此步骤直至上清液无色，保留沉淀。再次将沉淀重新溶于蒸馏水，用Sevag法去蛋白直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，离心除去变性蛋白。保留水相，加入3～4倍体积的无水乙醇，于2～4℃冷藏24～48小时，弃上清。沉淀部分以无水乙醇洗涤至洗涤液呈无色，弃去洗涤液，待乙醇自然挥发后，冷冻干燥5～20小时，所得产物属于聚合物，其分子量代表的是相似链长的平均配布。经凝胶分子排阻层析分离，收集相对分子质量范围在1,0000-11,0000之间的分离产物，再经冷冻干燥后得到当归多糖。经鉴定本发明所得当归多糖的物化性质为：相对分子质量范围在1,0000-11,0000之间(采用凝胶渗透色谱-激光光散射联用技术)，易溶于水，糖含量大于95％，经HPLC检测表明主要由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖和木糖组成，并且紫外吸收光谱显示192nm处有明显吸收峰；红外吸收光谱分析，在3352cm-1、2940cm-1、1747cm-1、1626cm-1、1414cm-1、1237cm-1、1021cm-1及536cm-1处表现为典型的多糖吸收峰。
实施例1：取当归饮片加入5倍(重量比)水煎煮30分钟，滤过；将所得药渣加入3倍(重量比)水进行煎煮30分钟，滤过；所得药渣加入3倍(重量比)水煎煮30分钟，滤过；合并三次滤液，并将滤液浓缩。合并三次滤液，浓缩，冷却至室温，加入乙醇至乙醇含量为40％(v/v)，4℃冷藏24小时，滤过，保留沉淀即当归醇沉物；再次浓缩，加入乙醇至乙醇含量为70％(v/v)，4℃冷藏24小时，滤过，保留沉淀即当归醇沉物；第三次浓缩，加入乙醇至乙醇含量为80％(v/v)，4℃冷藏24小时，滤过，保留沉淀即当归醇沉物。合并沉淀即合并当归醇沉物，将其重新溶于蒸馏水，加入乙醇至乙醇含量为70％(v/v)抽提，4℃冷藏24小时，弃上清，保留沉淀，重复进行此步骤直至上清液无色，保留沉淀。再次将沉淀重新溶于蒸馏水，用Sevag法去蛋白直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，离心除去变性蛋白。保留水相，加入4倍体积的无水乙醇，于4℃冷藏24小时，弃上清。沉淀部分以无水乙醇洗涤至洗涤液呈无色，弃去洗涤液，待乙醇自然挥发后，冷冻干燥5小时；以TSK-Gel4000H型柱(细孔孔径600埃)，柱尺寸250×10mm，以蒸馏水为流动相，流量10ml/min，收集5-60min的分离产物；再经冷冻干燥后得到当归多糖。采用凝胶渗透色谱-激光光散射联用技术，HPLC以及红外吸收光谱分析鉴定上述当归多糖的得率为10％，纯度为96％。
实施例2：取当归饮片加入7倍(重量比)水煎煮60分钟，滤过；将所得药渣加入5倍(重量比)水进行煎煮40分钟，滤过；所得药渣加入3倍(重量比)水煎煮40分钟，滤过；合并三次滤液，并将滤液浓缩。合并三次滤液，浓缩，冷却至室温，加入乙醇至乙醇含量为60％(v/v)，2℃冷藏48小时，滤过，保留沉淀即当归醇沉物；再次浓缩，加入乙醇至乙醇含量为80％(v/v)，2℃冷藏48小时，滤过，保留沉淀即当归醇沉物；第三次浓缩，加入乙醇至乙醇含量为80％(v/v)，2℃冷藏48小时，滤过，保留沉淀即当归醇沉物。合并沉淀即合并当归醇沉物，将其重新溶于蒸馏水，加入乙醇至乙醇含量为80％(v/v)抽提，2℃冷藏48小时，弃上清，保留沉淀，重复进行此步骤直至上清液无色，保留沉淀。再次将沉淀重新溶于蒸馏水，用Sevag法去蛋白直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，离心除去变性蛋白。保留水相，加入3倍体积的无水乙醇，于2℃冷藏48小时，弃上清。沉淀部分以无水乙醇洗涤至洗涤液呈无色，弃去洗涤液，待乙醇自然挥发后，冷冻干燥10小时；以TSK-Gel4000H型柱(细孔孔径600埃)，柱尺寸250×10mm，以蒸馏水为流动相，流量10ml/min，收集5-60min的分离产物；再经冷冻干燥后得到当归多糖。采用凝胶渗透色谱-激光光散射联用技术，HPLC以及红外吸收光谱分析鉴定上述当归多糖的得率为30％，纯度为97％。
实施例3：取当归饮片加入6倍(重量比)水煎煮50分钟，滤过；将所得药渣加入6倍(重量比)水进行煎煮50分钟，滤过；所得药渣加入6倍(重量比)水煎煮50分钟，滤过；合并三次滤液，并将滤液浓缩。合并三次滤液，浓缩，冷却至室温，加入乙醇至乙醇含量为50％(v/v)，4℃冷藏48小时，滤过，保留沉淀即当归醇沉物；再次浓缩，加入乙醇至乙醇含量为80％(v/v)，4℃冷藏48小时，滤过，保留沉淀即当归醇沉物；第三次浓缩，加入乙醇至乙醇含量为90％(v/v)，4℃冷藏48小时，滤过，保留沉淀即当归醇沉物。合并沉淀即合并当归醇沉物，将其重新溶于蒸馏水，加入乙醇至乙醇含量为70％(v/v)抽提，4℃冷藏48小时，弃上清，保留沉淀，重复进行此步骤直至上清液无色，保留沉淀。再次将沉淀重新溶于蒸馏水，用Sevag法去蛋白直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，离心除去变性蛋白。保留水相，加入4倍体积的无水乙醇，于4℃冷藏24小时，弃上清。沉淀部分以无水乙醇洗涤至洗涤液呈无色，弃去洗涤液，待乙醇自然挥发后，冷冻干燥20小时；以TSK-Gel4000H型柱(细孔孔径600埃)，柱尺寸250×10mm，以蒸馏水为流动相，流量10ml/min，收集5-60min的分离产物；再经冷冻干燥后得到当归多糖。采用凝胶渗透色谱-激光光散射联用技术，HPLC以及红外吸收光谱分析鉴定上述当归多糖的得率为40％，纯度为96％。
实施例4：用本发明当归多糖制备镇痛的药物：当归多糖加入赋形剂，按常规方法制成片剂。
实施例5：用本发明当归多糖制备镇痛的药物：当归多糖加入赋形剂，按常规方法制成胶囊。
实施例6：用本发明当归多糖制备镇痛的药物：当归多糖溶解于注射用水中，按常规方法制成针剂。
动物试验：
1.药物：己烯雌酚注射液，上海第九制药厂，批号：020906。缩宫素注射液，南京生物化学制药厂，批号：030409。
(2)主要仪器GL-8402型热板测痛仪，浙江宁海医药仪器厂生产。
(3)动物健康昆明种小鼠，除“痛经模型”选用♂小鼠作为阴性对照外，其它实验均用♀小鼠，体重18±1g，由武汉大学动物实验中心提供，合格证号：SCXK(鄂)2003-2004。
2.方法
(1)本发明当归多糖对醋酸所致雌性小鼠扭体反应的影响
动物分组和药物剂量见表1，实验前1小时经口给药背景技术中的当归粗多糖(糖含量为65.5％)或本发明的当归多糖，模型组给予等容量生理盐水。给药后1小时腹腔注射1％醋酸0.2ml/只，观察给药小鼠扭体反应潜伏期及30min内扭体次数，并计算保护百分率。
(2)本发明当归多糖对热板法镇痛作用的影响
预先以55℃热板对♀小鼠进行筛选，在10～30秒内出现舔足反应的为合格小鼠。实验分组和药物剂量见表2。实验前1小时经口灌胃(ig)给予受试药，模型组给予等容量生理盐水。为避免痛阈周期性波动的影响，实验均在上午8～10时进行，室温25±1℃。记录各组痛阈的变化，并计算痛阈提高百分率。若60秒内末出现舔足反应，痛阈计为60秒。
(3)本发明当归多糖对己烯雌酚和缩宫素诱发小鼠子宫痉挛的影响
各组动物于实验前皮下注射己烯雌酚0.2mg/只，连续3天。实验当日，动物经口灌胃(ig)给予当归粗多糖或本发明所述的一种当归多糖，模型组给予等容量生理盐水，1小时后ip缩宫素0.3u/只。观察各组动物扭体反应潜伏期及30min内扭体次数。若30min内不出现扭体反应，潜伏期计为30min。
3.结果
(1)本发明当归多糖对疼痛模型——醋酸所致雌性小鼠扭体反应的影响实验，结果见表1。
表1 本发明当归多糖对醋酸所致扭体反应的影响.n(例数)＝10，x±s(均数±标准差)
扭体反应
分组 剂量(g·kg-1)
潜伏期(min) 次数(次/30min) 保护率(％)
模型组 / 5.2±1.8 34.2±8.8 /
当归粗多糖 0.075 6.9±1.51) 22.9±6.92) 33.0
0.250 19.3±6.82) 7.4±5.02) 78.4
一种当归多糖 0.025 14.1±7.82) 10.3±5.32) 69.9
0.075 23.1±6.92) 5.9±4.82) 82.7
注：与模型对照组比较，1)P＜0.05，2)P＜0.01.
结果表明，本发明的当归多糖在仅为当归粗多糖1/10剂量时即可明显产生对醋酸所致疼痛的保护作用，并且随剂量增加作用增强。
(2)本发明当归多糖对热板法致痛作用的影响实验。结果见表2。
表2 本发明当归多糖对雌性小鼠热板法致痛的影响.n(例数)＝10，x±s(均数±标准差)
给药前痛阈时
剂量 给药后痛阈时 痛阈提高时 痛阈提高
分组 间
(g·kg-1) 间(s) 间(s) 率(％)
(s)
模型组 / 20.8±6.4 21.2±6.8 1.3±1.5 1.9
当归粗多糖 0.075 21.5±6.3 24.9±7.7 4.4±5.4 15.8
0.250 23.4±4.4 34.6±9.3 11.7±8.21) 47.9
一种当归多糖 0.025 20.7±5.2 29.4±9.1 9.1±8.11) 42.0
0.075 21.3±6.2 34.8±8.7 13.7±9.61) 63.4
注：与对照组比较，1)P＜0.01.
结果表明，本发明的当归多糖在仅为当归粗多糖1/10剂量时即可显著保护热刺激所致疼痛，并且随剂量增加作用增强。
(3)本发明当归多糖对“痛经模型”——己烯雌酚和缩宫素诱发小鼠子宫痉挛的影响实验，结果见表3。
表3 本发明当归多糖对己烯雌酚和缩宫素所致小鼠子宫痉挛的影响.
n(例数)＝10，x±s(均数±标准差)
扭体反应
分组 剂量(g·kg-1)
潜伏期(min) 次数(次/30min) 发生率(％)
模型组 / 12.3±3.8 6.3±4.0 100
当归粗多糖 0.075 21.1±9.01) 2.0±2.11) 60
0.250 23.2±8.82) 1.3±1.92) 401)
一种当归多糖 0.025 25.4±6.62) 0.9±1.32) 401)
0.075 27.7±4.92) 0.6±1.32) 302)
注：与模型组比较，1)P＜0.05，2)P＜0.01.
上述结果表明，本发明的当归多糖一次性口服给药0.025g/kg和0.075g/kg对化学物质和热刺激引起疼痛的模型有明显镇痛作用，并明显抑制“痛经”所致小鼠扭体反应即能有效对抗雌性激素诱发“痛经”所引起的疼痛反应。实验说明，本发明的当归多糖在当归粗多糖1/10剂量下即有明显作用，并且随剂量增加作用增强。
Claims (5)
1.一种当归多糖，由下法制得：将当归醇沉物溶于蒸馏水，用Sevag法去蛋白直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，离心除去沉淀；保留水相，加入无水乙醇，沉淀多糖，弃上清液，所得沉淀物以无水乙醇洗涤，经冷冻干燥后，凝胶分子排阻层析分离，收集相对分子质量范围在1,0000-11,0000之间的分离产物，再经冷冻干燥后得到当归多糖。
2.根据权利要求1所述的当归多糖，其特征在于：所述当归醇沉物按下法制得，取当归饮片，加入5～7倍当归饮片重量的水煎煮30～60分钟，滤过；将所得药渣加入3～6倍重量的水进行煎煮30～50分钟，滤过；所得药渣加入3～6倍重量的水煎煮30～50分钟，滤过；合并三次滤液，并将滤液浓缩；合并三次滤液，浓缩，冷却至室温，加入乙醇至乙醇含量为40％～60％，2～4℃冷藏24～48小时，滤过，得沉淀物；再次浓缩，加入乙醇至乙醇含量为70％～80％，2～4℃冷藏24～48小时，滤过，得沉淀物；第三次浓缩，加入乙醇至乙醇含量为80％～90％，2～4℃冷藏24～48小时，滤过，得沉淀物；合并三次沉淀物得当归醇沉物。
3.权利要求1所述当归多糖的制备方法，其特征在于：将当归醇沉物溶于蒸馏水，用Sevag法去蛋白直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，离心除去沉淀；保留水相，加入无水乙醇，沉淀多糖，弃上清液，所得沉淀物以无水乙醇洗涤至洗涤液呈无色，弃去洗涤液，洗涤后的沉淀物经冷冻干燥，凝胶分子排阻层析分离，收集相对分子质量范围在1,0000-11,0000之间的分离产物，再经冷冻干燥后得到当归多糖。
4.权利要求1或2所述的当归多糖在制备镇痛药物中的用途。
5.权利要求1或2所述的当归多糖在制备治疗痛经药物中的用途。
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