CN1720060B - 人乳头瘤病毒多肽和免疫原性组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于治疗和预防人乳头瘤病毒(HPV)-相关癌症且特别是宫颈癌的免疫原性组合物和药物组合物。具体而言，本发明涉及用于产生抗HPV的免疫反应的融合蛋白，及编码这些融合蛋白的核酸。特别是，本发明提供HPV E6与E7的融合体，其中该E6和/或E7包含一个或多个突变。这些突变可消除这些致癌蛋白的转化活性且因此赋予E6/E7融合体安全性。此外，这些融合体可维持或增加E6和E7的免疫原性效能。任何基因或蛋白送递方法均可用于送递或包装本发明的免疫原性组合物。

Description

人乳头瘤病毒多肽和免疫原性组合物
本申请要求2002年10月3日提交的、美国临时专利申请系列号No.60/415，929的优先权，其整体引入此处作为参考。
发明领域
本发明涉及用于治疗或预防宫颈癌和由人乳头瘤病毒(HPV)引起的其它癌症的药物组合物和免疫原性组合物。具体而言，本发明涉及用于产生抗HPV的免疫反应的融合蛋白，及编码这些融合蛋白的核酸。这些融合蛋白和多核苷酸用于治疗和预防HPV-诱导的癌症。
发明背景
子宫颈癌是妇女与肿瘤有关的死亡的第二主要原因，全世界每年有250,000人死亡。已知所有宫颈癌中有超过99％均与人乳头瘤病毒(HPV)感染有关，其中50％与16型HPV(HPV16)直接关联(Walboomers等人，J：Path.1999，189：12-19)。而绝大多数HPV16感染都是没有症状且短暂的，而它们确定的百分比则较持久。约1％持续感染的个体由于被称作宫颈上皮内瘤形成(CIN)的严重宫颈损害而不断发展，并最终发展成侵入性宫颈癌。
需要被称作E6和E7的早期HPV蛋白来维持恶性表型(Von Knebel等人，Int J Cancer1992，51：831-4；Crook等人，Embo J1989，8：513-9；He和Huang，Cancer Res.1997，57：3993-9)。这些蛋白在CIN损害和癌中始终如一地表达(Smotkin和Wettstein，Proc NatlAcad Sci USA1986，83：4680-4；Durst等人，Virology1992，189：132-40)。这些蛋白通过破坏细胞周期的调节而诱导上皮增殖。特别是，E7结合并灭活细胞肿瘤抑制剂成视网膜细胞瘤蛋白(Rb)(Dyson等人，Science1989，243：934-7)，其导致细胞发展成细胞周期的S-期(Cobrinik等人，Trends Biochem Sci1992，17：312-5)。HPV16的E6蛋白诱导肿瘤抑制蛋白p53的降解(Scheffner等人，Cell1990，63：1129-36)，防止细胞经历编程性细胞死亡。
因为肿瘤细胞组成型表达E6和E7蛋白，且这些蛋白不存在于正常细胞中，因此这些病毒蛋白是癌症免疫疗法的非常有吸引力的目标。很多证据表明抗人E6和E7的细胞-介导的免疫反应与HPV损害的天然退化和病毒DNA清除有关(Nakagawa等人，J Infect Dis1997，175：927-31；Kadish等人，J Natl Cancer Inst1997，89：1285-93)。且在不同的鼠模型中，抗E7的CTL反应显示出可保护小鼠免受HPV16-阳性肿瘤的侵袭(Feltkamp等人，Eur J Immunol1995，25：2638-42；Lin等人，Cancer Res1996，56：21-6)。
因为细胞-介导的免疫性(CMI)对于控制HPV感染和疾病似乎很重要(Eiben，G.L.等人，Adv Can Res2002，86：113-148)，因此治疗性疫苗应当对人白细胞抗原(HLA)多样性群体中有效覆盖的若干HPVE6和E7抗原性肽产生最佳的T细胞反应。
用于送递E6/E7抗原的有价值的疫苗载体是来源于委内瑞拉马脑炎病毒的减毒3014株的重组甲病毒(AV)载体(VEE；VeldersM.P.等人，Cancer Res2001，61：7861-7867)。复制机能不全的VEE复制子颗粒(VRP)已被证实是对多数临床前期感染疾病和肿瘤模型都十分有效的疫苗(Rayner，J.O.等人，Rev Med Virol2002，12：279-2960)。AV-衍生的复制子载体，如VEE编码RNA形式的异源基因，不会在最初感染外扩散，并诱导感染细胞的编程性细胞死亡(Griffith，D.E.等人，Annu.Rev.Microbiol.1997，51：565-592)。这些限制了延长蛋白表达或整合到宿主DNA中的机会，而这些是自然感染后HPV-诱导的恶性肿瘤的特征。预先存在的抗-VEE免疫性的低水平流行和用VRP反复免疫的前景(Pushko，P.等人，Virology1997，239：389-401)要优于其它重组病毒载体，如牛痘病毒或腺病毒。
癌症免疫疗法的目标，E6和E7具有转化活性。因此，目前本领域中预期的使用E6和E7的免疫疗法具有潜在的危险性，这是因为这些蛋白可诱导细胞的转化和永生化。
这些导致对治疗和预防CIN和宫颈癌的有效组合物的未实现需要。更具体而言，仍然需要包括基于E6-和/或E7-成分的免疫原性组合物，它们是安全的且可有效治疗和/或预防CIN、宫颈癌、肛癌、和其它这类疾病。
由于缺少小鼠I类HLA表达肿瘤模型，所以HPV免疫原性组合物先前的研究受到了限制。此处描述了HPV16E6/B7阳性模型；该模型在HLA-A*0201转基因小鼠中形成了逐渐生长的肿瘤。
发明概述
本发明通过提供药物组合物和多肽而满足了上述和其它需要，所述药物组合物和多肽包含E6和E7多肽的融合体，它具有可降低生物活性的突变和/或融合顺序(E7E6)，因此转化E6和E7的活性潜能。
具体而言，本发明提供新的E6/E7融合多肽以及编码它们的多核苷酸。在具体实施方案中，本发明提供包含人乳头瘤病毒E6和E7多肽的多肽，其中该E7多肽在与SEQ ID NO：14的氨基酸24、26或91相对应的任何一个或多个氨基酸处具有突变且该E6多肽没有突变或在与SEQ ID NO：13的氨基酸63或106相对应的任何一个或多个氨基酸处具有突变。在具体实施方案中，在该融合多肽所含的E7多肽中，与SEQ ID NO：14的氨基酸24和26相对应的其中一个、优选两个氨基酸发生突变。这些突变多肽可在这些突变位置的任何一个上具有甘氨酸残基且E6可以在E7的羧基末端或氨基末端。
本发明还提供编码这些多肽的分离核酸。例如，在本发明其中一个实施方案中，所述分离的核酸包含人乳头瘤病毒E6和E7序列，其中E6核苷酸序列在与HPV 16 E6基因的核苷酸187-189或316-318相对应的任何核苷酸处具有突变，且E7核苷酸序列在与HPV16E7基因的核苷酸70-72、76-78、或271-273相对应的任何核苷酸处具有突变，且其中所述突变得到不同的被编码的氨基酸。本发明还提供包含这些多肽和多核苷酸的药物组合物和免疫原性组合物。
本发明还提供具有SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9、或SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的分离的多肽。在其它实施方案中，本发明提供编码这种多肽的分离核酸，它包括具有核苷酸序列SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12的核酸。
还提供了包含编码E6/E7融合体的核酸序列的表达载体。例如，在具体实施方案中，本发明提供包含与表达控制序列可操纵连接(例如，受表达控制序列的控制)的SEQ ID NOS：4、6、10或12的表达载体。
还提供了包含编码E6/E7融合体的核酸的宿主细胞，以及表达或包含E6/E7融合多肽的宿主细胞。
在其它实施方案中，本发明还提供免疫原性组合物，它包含本发明的核酸或多肽且用于，例如，治疗或预防宫颈癌。这种免疫原性组合物可包含(a)本发明的多肽(例如，包含人乳头瘤病毒E6和E7多肽的多肽，其中该E7多肽在与SEQ ID NO：14的氨基酸24、26或91相对应的任何一个或多个氨基酸处具有突变且该E6多肽没有突变或在与SEQ ID NO：13的氨基酸63或106相对应的任何一个或多个氨基酸处具有突变)，和(b)药学可接受的载体。任选地，本发明的免疫原性组合物还可包含佐剂。
还提供了重组病毒，它包含本发明的一个或多个核酸，和/或编码一个或多个本发明的多肽。因此，例如，本发明的重组病毒可包含SEQID NO：3、5、9或11所示的编码多肽的核酸，且更特别是具有SEQ IDNOS：4、6、10或12的任何一个所示的序列。在特别优选的实施方案中，本发明的重组病毒是修饰的委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)。
此外还提供了使用上述组合物的方法，且这种方法也被认为是本发明的一部分。因此，本发明还提供一种通过给予个体免疫有效量的本发明多肽(例如，具有SEQ ID NOS：3、5、9或11的任何一个所示的氨基酸序列的多肽)和药学有效载体而在个体中产生免疫反应的方法。
还提供了用于治疗和/或预防宫颈癌的方法。例如，在其中一个实施方案中，本发明提供用于治疗宫颈癌的方法，其中给予被诊断患有宫颈癌的患者本发明的多肽(例如，具有SEQ ID NOS：3、5、9或11的任何一个所示的氨基酸序列的多肽)和药学可接受的载体。在其它实施方案中，本发明提供用于预防宫颈癌的方法，其中给予个体本发明的多肽和药学可接受的载体。在另一实施方案中，本发明提供通过给予患者免疫有效量的本发明核酸(例如，多肽所具有的核酸序列编码具有SEQ ID NOS：3、5、9、或11，特别是SEQ ID NOS：4、6、10或12的任何一个所示的氨基酸序列的多肽)而治疗和/或预防患者宫颈癌的方法。
附图简述
图1A和1B是表示被引入到HPV16E6和E7蛋白中的点突变相关于主要的HLA-A I类等位基因的推定表位的位置的示意图。图1A表示E6中天然存在的氨基酸，63C和106C，它们每一个均突变成甘氨酸。图1B表示E7中天然存在的氨基酸，24C、26E、和91C，它们每一个均突变成甘氨酸。先前定义的能够结合HLA-A1、A2、A3、A11且A24等位基因的I类表位在带条纹的格中表示(Kast，W.M.等人，J Immunol1994，152：3904-3912)。
图2A-E是表示人乳头瘤病毒18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68(分别是SEQ ID NOS：15-26)的E6多肽氨基酸序列的序列比对和共有序列的图。所述共有序列(SEQ ID NO：39)在下面的序列比对中表示。共有序列中的大写字母表示完全共有的序列且共有序列中的小写字母表示高频，但不完全共有的序列。
图3A-C是表示人乳头瘤病毒18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68(分别是SEQ ID NOS：27-38)的E7多肽氨基酸序列的序列比对和共有序列的图。所述共有序列(SEQ ID NO：40)在下面的序列比对中表示。共有序列中的大写字母表示完全共有的序列且共有序列中的小写字母表示高频，但不完全共有的序列。
图4A和4B是表示特异性溶解百分比对效应子与靶细胞(E：T)比值的曲线图，其代表VRP接种免疫后的CTL反应。用3x105IU的所示VRP给C57BL/6小鼠皮下接种免疫，并在1个月后进行CTL测定。细胞毒性是通过E7-MVA(A)或E6-MVA(B)感染的MC57G靶细胞的铕释放测量的。这些结果在其它两个实验中再现(没有给出数据)。
图5A和5B是证实没有肿瘤的小鼠百分比对肿瘤侵袭后天数的曲线图。在第21-天和第7-天，用3x105IU的所示VRP免疫原性组合物给C57BL/6小鼠(n＝8/gp)引发免疫并加强，并在第0天用5x105个C3(A)或5x104个TC-1(B)肿瘤细胞侵袭侧腹。每3天监测肿瘤一次。
图6是证实没有肿瘤的小鼠百分比对肿瘤侵袭后天数的曲线图。C57BL/6小鼠(n＝8-16/gp)在第0天接受5x105个C3肿瘤细胞并在第7、14、和21天用所示VRP接种免疫。每隔3天监测肿瘤一次，共45天。
图7是证实没有肿瘤的小鼠百分比对肿瘤侵袭后天数的曲线图。HLA-A*0201转基因小鼠(n＝10/gp)在第0天接受2x106个HLF16肿瘤细胞并在第5、10、和15天用所示VRP接种免疫。每隔5天监测肿瘤一次。
图8A和8B是检测感染了不同VRP制品的原代人乳上皮细胞(MEC)中p53(A)和Rb(B)表达的蛋白质印迹。用所示VRP(MOI＝10)感染后24小时，使25μg各MEC细胞溶解产物经过SDS-PAGE、印迹、并探测p53(A)和Rb(B)水平。相等的蛋白上样是通过用抗-微管蛋白抗体探测证实的。E7蛋白的存在是通过用抗-E7抗体探测所示泳道证实的。
发明详述
本发明提供HPV E6和E7蛋白的融合体，编码这种融合体例子的核苷酸序列，及其突变体形式。虽然先前已经公开了用此方法鉴定的HPV16的各种特异性突变(除E6C106G之外，其先前仅突变成C106R(Dalal等人，J Virol1996，70：683-8))，但还没有进行这些突变的组合，且还没有测试这些突变的组合保留免疫原性而缺少转化或永生化能力的能力。例如，还不知道两种或多种突变的任何其它组合是否能够产生维持它们免疫原性效能的多肽。本发明公开了E6/E7(此处所用术语“E6/E7”表示顺序为E6E7、E7E6或两者的融合体)蛋白的融合体，它包含这些突变的独特组合，且令人吃惊地发现包含4或5个规定突变的E6/E7蛋白可维持它们的免疫原性效能。该发现特别重要，是因为治疗性免疫原性组合物应对HLA多样性群体中有效覆盖度的若干HPV E6和E7抗原性肽产生最佳反应。本发明还公开了具有多个突变，同时维持它们免疫效能的这些E6/E7融合体不会维持E6和E7转化能力，即p53和pRB降解所需的功能。具体而言，本发明的融合体不会诱导p53或Rb降解且，因此，用于送递到患者中或在患者中表达时，比它们的非-突变对应物更安全。
本发明还公开了令人吃惊的发现，即E7E6融合体，即这种融合体中的E6在E7的羧基末端，与它们的E6E7对应物相比免疫活性增加。
在具体实施例中，生产HPV16E6E7和E7E6融合蛋白并测试免疫原性和抗-肿瘤反应。将若干点突变引入到E6和E7基因中，从而将它们的致癌可能性灭活，同时保存已知的HLA表位。对H-2Db限制的E749-57表位的可比较CTL反应是在用3x105个编码野生型或突变融合蛋白的VRP感染性单位接种免疫的小鼠中观察到的。在90％或更多小鼠中，所有表达wt和突变融合蛋白的VRP免疫原性组合物均消除了7天-建立的C3肿瘤。此外，证实了E6E7融合构建体在两个其它E6E7-阳性肿瘤模型中的抗-肿瘤效能。特别是，E7E6TetM VRP在HLF16肿瘤模型中带来完全的肿瘤排斥。用表达突变型，而不是野生型E6和E7基因的VRP感染的原代人乳上皮细胞证实了p53和成视网膜细胞瘤蛋白的正常水平。
本发明的E6E7和E7E6融合体
本发明提供E6/E7融合多肽，它包含多个突变，如E7中的C24G、E26G和C91G和E6中的C63G和C106G(见图1A和B)。例如，E6E7TetM和E7E6TetM融合多肽包含E7C24G和E26G突变及E6C63G和C106G突变，而E6E7PentM和E7E6PentM融合多肽除了存在于TetM突变体中的4个突变之外还包含C91G E7突变。这些突变的融合多肽，此外，可以是不稳定的。本领域技术人员认识到不稳定的蛋白，与稳定的蛋白相比，发展CTL反应的能力增加。本领域的技术人员还认识到融合蛋白倾向于不发生适当折叠且因此较之它们未融合的对应物不太稳定。因此，融合蛋白，如本发明中公开的那些，较之它们的未融合对应物更适于产生细胞-介导的免疫反应。
生产HPV16E 6E7和E7E6融合蛋白并测试免疫原性和抗-肿瘤反应。将若干点突变引入到E6和E7基因中以灭活它们的致癌可能性，同时保存已知的HLA表位。在本发明之前，还不知道此处所测试的突变组合是否能够破坏多肽的免疫原性或是否这种突变多肽仍保留它们的免疫原性。在用3x105个编码野生型或突变型融合蛋白的VRP感染性单位接种免疫的小鼠中观察到了对H-2Db限制的E749-57表位的可比较CTL反应。表达所有野生型和突变型融合蛋白的VRP免疫原性组合物在90％或更多小鼠中均可消除7天-建立的C3肿瘤。此外，在两个其它的E6E7-阳性肿瘤模型中证实了E6/E7融合构建体的抗-肿瘤效能。
本发明提供包含E6和E7的融合多肽，其中E6位于氨基末端或羧基末端。然而，本领域的技术人员可从即时公开认识到，即E6在E7羧基末端的融合体(E7E6融合体)，即E6跟在E7后面，如E7E6TetM和E7E6PentM，与其中E6在E7氨基末端的融合体(E6E7融合体，如E6E7TetM和E6E7PentM)相比，其免疫效能增加。此外，本领域技术人员还应认识到E7E6融合体，即其中E6在E7羧基末端的融合体与E6E7融合体相比，其E6活性降低了。因此，E7E6融合体通常被认为更安全。因此，其中E6在E7羧基末端的融合体是本发明更优选的实施方案。
本发明提供在与HPV16E7的C24、E26和C91及HPV16E6的C63和C106相对应的位置处的特定核苷酸和氨基酸突变的例子。例如，本发明提供半胱氨酸24突变成甘氨酸(核苷酸序列中的相应突变是CTG-CGG)。这些例子不是限制性的。例如，可使用类似导致锌指破裂或Rb结合的突变。例如，可将对于锌指形成至关重要的半胱氨酸残基的突变改变成任何其它氨基酸。优选的突变导致蛋白不稳定且因此，蛋白的免疫原性增加。
在本发明的具体实施方案中，所述多肽是HPV16E6和E7的融合体，其中E7多肽在与SEQ ID NO：14的24、26或91位置相对应的任何氨基酸处具有突变且E6多肽没有突变或在与SEQ ID NO：13的63或106位置相对应的一个或多个氨基酸处具有突变。在本发明的优选实施方案中，所述多肽是HPV16E6和E7的融合体，其中E7多肽在与SEQ ID NO：14的24和26位置相对应的氨基酸处具有突变且E6多肽在选自与SEQ ID NO：13的63或106位置或两个位置相对应的氨基酸处具有突变。
本领域技术人员应了解氨基酸数是通过以甲硫氨酸作为第一个氨基酸开始计算而测定的，甚至是在第二个融合蛋白中的第一个甲硫氨酸缺失的情况下。例如，E6E7TetM(SEQ ID NO：3)的G24突变被认为位于多肽中E7的残基24处。
在本发明另一优选实施方案中，所述多核苷酸是HPV16E6和E7多核苷酸的融合体，其中E6多核苷酸在核苷酸187-189(其与HPV16基因组(基因银行登记号K02718)的核苷酸290-292相对应)或316-318(其与HPV16基因组的核苷酸419-421相对应)的任何一个处具有突变或，E7核苷酸序列在核苷酸70-72(其与HPV16基因组的核苷酸631-633相对应)、76-78(其与HPV16基因组的核苷酸637-639相对应)或271-273(其与HPV16基因组的核苷酸832-834相对应)的任何一个处具有突变。这些核苷酸的改变导致错义突变，而不是无义突变。换句话说，这些突变导致不同的氨基酸被编码。
本发明提供包含这些多肽、或包含编码这些多肽的核苷酸的多肽，和免疫原性组合物和药物组合物。如下所述，这些多肽和多核苷酸以此处提供的序列描述。例如，E6E7TetM多肽在SEQ ID NO：3中描述。本领域技术人员应认识到本发明的多肽和多核苷酸序列不限于本申请中公开的确切序列。例如，E6和E7序列是通过从HPV16的ATCCclone#45113进行PCR获得的。该ATCC克隆的E6和E7序列与基因银行HPV16序列，K02718中的那些稍有不同。因此，本领域技术人员应认识到本发明还包括与此处公开的那些基本同源或基本相似的氨基酸和核苷酸序列，且所述突变的组合可在任何一个E6或E7序列的背景中发生。例如，这些突变和这些突变任何数量的组合可位于K02718中公开的E6和E7序列背景中。
本领域技术人员应认识到除了HPV16之外，本发明还涉及乳头瘤病毒家族的其它成员。与癌症有关的其它乳头瘤病毒基因型，特别是18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68在很可能对它们的致癌能力至关重要的E6和E7蛋白中具有保守基序(见FieldsVirology Fourth Edition，2001，Ch.65和66，2197-2265，Knipe&Howley Eds.，Lippincott Williams and Wilkins)。值得注意的是，这些E6和E7蛋白具有C-X-X-C锌指基序且，对于E7而言，具有推定的Rb结合基序L-X-C-X-E。因此，本发明的实施方案包括来源于乳头瘤病毒家族其它成员的E6和E7融合多肽和多核苷酸，它们具有与本发明公开的突变相应的突变。
与SEQ ID NOS：1-12中公开的特定氨基酸和核苷酸位置相对应的氨基酸和核苷酸可通过进行序列比对而确定。这种序列比对的例子在图2A-E和3A-C中表示。在这些图中，已经将HPV18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68的E6和E7多肽的氨基酸进行了序列比对，并提出了共有序列。E6共有氨基酸序列在SEQ ID NO：39中提出且E7共有氨基酸序列在SEQ ID NO：40中提出。
这些序列比对证实了在本发明中测试的每个突变在这些HPV病毒的每一个中都是保守的且，因此，它们也可被突变从而剔除它们的致癌可能性，同时维持它们引发免疫反应的能力。涉及结构如锌指和结合基序形成的氨基酸常常是保守的。人们可以，例如，鉴定并使与HPV基因型每个成员中的HPV16E7的氨基酸24、26、和91或HPV16E6的氨基酸63或106相对应的保守氨基酸或核苷酸变异。例如，图2A-E中所示的序列比对证实了与HPV16E6的氨基酸63(63C)相对应的HPV18E6氨基酸也是半胱氨酸残基且位于HPV18E6的位置65上。因此，除了与HPV16E7的氨基酸24、26和91以及HPV16E6的氨基酸106相对应的其它残基之外，在本发明中，HPV18E6的66C也可发生突变。同样，在本发明中，可对与E6共有序列(SEQ ID NO：39)的氨基酸65或108相对应的任何HPV E6多肽或与E7共有序列(SEQ ID NO：40)的氨基酸25、27或97相对应的任何HPV E7多肽进行突变。
在本发明其中一个实施方案中，所述融合多肽包含这些突变中的2个。在另一实施方案中，这些融合多肽包含这些突变中的3个。在另一实施方案中，这些融合多肽包含这些突变中的全部5个。
分子生物学定义.根据本发明，可使用本领域内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这类技术在文献中详细描述。见，例如，Sambrook，Fitsch和Maniatis，MolecularCloning：ALaboratory Manual，Second Edition(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(此处称作“Sambrook等人，1989”)；DNA Cloning：A Practical Approach，Volumes I and II(D.N.Glovered.1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait ed.1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins，eds.1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，ed.1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRLPress，1986)；B.E.Perbal，A Practical Guide to MolecularCloning(1984)；F.M.Ausubel等人(eds.)，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。
此处的多核苷酸可利用天然调节序列侧面连接，或与异源序列，包括启动子、增强子、反应元件、信号序列、聚腺苷酸化序列、内含子、5＇-和3＇-非-编码区等连接。所述核酸还可通过本领域已知的很多方法修饰。这种修饰的非-限制性例子包括甲基化，“帽”、一个或多个天然存在的核苷酸的置换(即，第三或原始“摆动”碱基的密码子优化)，及核苷酸间的修饰，如，例如，使用不带电的键的那些(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸盐、氨基甲酸酯等)和使用带电的键的那些(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)。多核苷酸可包含一个或多个附加的共价连接部分，如蛋白(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)、嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)、螯合剂(例如，金属、放射性金属、铁、氧化金属等)和烷化剂等。所述多核苷酸可通过形成甲基或乙基磷酸三酯或烷基亚磷酰胺键而衍生。此外，此处的多核苷酸还可用能够提供可检测信号的标记直接或间接修饰。举例性标记包括放射性同位素、荧光分子、生物素等。下面，在本发明的描述中提供可实施的有关修饰的其它非-限制性例子。
术语“基因”，也称作“结构基因”是指编码或与氨基酸的特定序列相对应的DNA序列，其包含一种或多种蛋白或酶的全部或一部分，且可包括或不包括调节DNA序列，如启动子序列，其可决定，例如基因表达的条件。某些基因，它们不是结构基因，可从DNA转录成RNA，但不会被翻译成氨基酸序列。其它基因可作为结构基因的调节子或DNA转录的调节子发挥作用。
“编码序列”或“编码”多肽、蛋白或酶的序列是核苷酸序列，当它们表达时，产生该多肽、蛋白或酶，即，该核苷酸序列编码该多肽、蛋白、或酶的氨基酸序列。优选，所述编码序列是RNA序列，当受适宜调节序列的控制时，其在体外或体内被翻译成细胞中的多肽。编码序列的边界是由靠近5’末端的起始密码子和下游翻译终止密码子而确定的。编码序列可包括，但不限于，原核序列、源于真核mRNA的cDNA，源于真核(例如，哺乳动物)DNA的基因组DNA序列，甚至合成的DNA序列。如果编码序列用于在真核细胞中表达，则聚腺苷酸化信号和转录终止序列通常位于编码序列的3’。
转录和翻译控制序列是DNA调节序列，如启动子、增强子、终止子等，提供编码序列在宿主细胞中的表达。在真核细胞中，聚腺苷酸化信号是控制序列。“表达控制序列”是涉及转录开始的转录控制序列，如启动子和增强子。
“启动子序列”是一种能够结合细胞中RNA聚合酶且开始下游(3’方向)编码序列的转录的DNA调节区。为了定义本发明，启动子序列通过转录起始位点在其3’末端结合并伸展上游(5’方向)，从而包括以可检测上述背景的水平开始转录所需的最小数量的碱基或元件。如上所述，启动子DNA是开始、调节、或以其它方式介导或控制编码DNA表达的DNA序列。
此处所用多核苷酸的“扩增”是指使用聚合酶链反应(PCR)增加DNA序列混合物内特定DNA的浓度。PCR的描述见Saiki等人，Science1988，239：487。
术语“表达”是指使或引起基因或DNA序列中的信息显现出来，例如通过激活涉及相应基因或DNA序列转录和翻译的细胞功能而产生蛋白。DNA序列在细胞中表达或由细胞表达，形成“表达产物”如蛋白。表达产物本身，例如所得蛋白，也可被细胞表达。例如，当在外源或天然启动子的控制下在外源宿主细胞中表达或产生时，或在外源启动子的控制下在天然宿主细胞中表达或产生时，多核苷酸或多肽是重组表达的。
术语“转染”是指将外源核酸引入到细胞中。术语“转化”是指将“外源”(即外来的或胞外的)基因、DNA或RNA序列引入到宿主细胞中，这样宿主细胞就可表达所引入的基因或序列，以产生所需物质，通常是由所引入的基因或序列编码的蛋白或酶。所引入的基因或序列，其还可被称作“克隆的”或“外源的”基因或序列，可包括调节或控制序列，如通过细胞的遗传机构使用的起始、终止、启动子、信号、分泌或其它序列。所述基因或序列可包括非功能性序列或功能未知的序列。接受且表达所引入DNA或RNA的宿主细胞已被“转化”且是“转化体”或“克隆”。被引入到宿主细胞中的DNA或RNA可来源于任何来源，包括与宿主细胞相同属或种的细胞，或不同属或种的细胞。
术语“载体”和“表达载体”是指通过它可将DNA或RNA序列(例如，外源基因)引入到宿主细胞中的载体，这样就可转化宿主并促进所引入序列的多肽的表达(例如，转录和翻译)。
载体通常包括其中插入外源DNA的可传递剂的DNA。将DNA的其中一个片段插入到DNA的另一片段中的常用方法包括使用被称作限制酶的酶裂解被称作限制位点的特异性位点处(核苷酸的特异性基团)的DNA。通常，将外源DNA插入到载体DNA的一个或多个限制位点处，然后连同可传递载体DNA通过载体运送到宿主细胞中。具有插入或加成DNA的片段或序列，如表达载体，还可被称作“DNA构建体”。
载体的常用类型是“质粒”，其通常是双链DNA自我包含的分子。质粒可很容易地接受其它(外源)DNA且可很容易被引入到适宜宿主细胞中。质粒载体常常包含编码DNA和启动子DNA且具有适于插入外源DNA的一个或多个限制位点。启动子DNA和编码DNA可来源于相同基因或不同基因，且可来源于相同或不同生物。已经描述过大量载体，包括质粒和真菌载体，在各种真核和原核宿主中的复制和/或表达。非-限制性例子包括pKK质粒(Clontech)、pUC质粒、pET质粒(Novagen，Inc.，Madison，WI)、pRSET或pREP质粒(Invitrogen，San Diego，CA)、或pMAL质粒(New England Biolabs，Beverly，MA)，和许多适宜的宿主细胞，使用此处公开或引证的方法或相关领域技术人员已知的其它方法。重组克隆载体常常包括一个或多个用于克隆或表达的复制系统，一个或多个用于在宿主中选择的标记，例如抗生素抗性，和一个或多个表达弹夹。生物技术中的常规实验可用于确定哪个克隆载体最适用于本发明。通常，克隆载体的选择取决于多核苷酸序列和所用宿主细胞的大小。
“多肽”是被称作化学构件的氨基酸链，它们由被称作“肽键”的化学键连接。术语“蛋白”是指包含由基因或从基因直接或间接转录的核酸分子(例如，mRNA或cDNA)编码的氨基酸残基的多肽。任选地，蛋白可缺失某些由基因或mRNA编码的氨基酸残基。蛋白或多肽，包括酶，可以是“天然的”或“野生型的”，是指它可天然存在；或它可以是“突变体”、“变体”或“被修饰的”，是指它已被人工制造、改变、衍生，或某些方面不同于天然蛋白或其它突变体或自其改变。
“突变”是指产生突变蛋白、酶、多肽、多核苷酸、基因或细胞的任何方法或机理。这包括其中蛋白、酶、多核苷酸、或基因序列被改变的任何突变，且细胞中任何可检测的改变是由这种突变引起的。所述改变的蛋白、酶、多肽或多核苷酸均是一种“突变体”，也被称作“变体”。通常，突变发生于多核苷酸或基因序列中，通过单一或多个核苷酸残基的点突变(置换)、缺失、或插入而进行。突变包括基因蛋白-编码区内出现的多核苷酸改变以及蛋白-编码序列以外区的改变，如，但不限于，调节或启动子序列。基因的突变可以是“沉默的”，即表达后不反映在氨基酸改变中，产生基因的“序列-保守”变体。这通常是在一个氨基酸与不止一个密码子相对应时发生。表1列出了哪个氨基酸对应于哪个密码子。
因此，由于遗传密码的简并，编码此处所述E6/E7融合多肽的突变氨基酸残基的任意3个-核苷酸密码子均在本发明的范围之内。
术语“突变体”和“变体”还可用于表示修饰或改变的基因、DNA或RNA序列、酶、细胞等，即，任何种类的突变体。这种改变还包括启动子、核糖体结合位点等的改变。
术语“变体氨基酸序列”是指其它适宜的E6和E7融合多肽，通过不会消除免疫原性的修饰，它们可不同于具体举例说明的E6和E7融合多肽。在进行这种改变时，可考虑氨基酸的亲水指数。本领域技术人员通常均了解亲水氨基酸指数在赋予多肽相互作用的生物功能方面的重要性(Kyte和Doolittle，1982)。已知某些氨基酸可被具有相似亲水指数或值的其它氨基酸置换，且仍然产生具有相似生物活性的多肽。根据每个氨基酸的疏水性和电荷已为其分配了亲水指数。那些指数是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸盐(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天门冬氨酸盐(-3.5)；天门冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
据信氨基酸残基的相对亲水性可决定所得多肽的二级和三级结构，其依次限定多肽与其它分子如酶、底物、受体、抗体、抗原等的相互作用。本领域已知氨基酸可被具有相似亲水指数且仍然可获得功能等价多肽的另一氨基酸置换。在这种改变中，优选亲水指数在+/-2以内的氨基酸置换，特别优选+/-1以内的那些，且更特别优选+/-0.5以内的那些。
相似氨基酸的置换还可基于亲水性进行，特别是将由此创造的生物功能等价多肽或肽用于免疫方案中。美国专利号US4,554,101，其引入此处作为参考，指出由其相邻氨基酸的亲水性决定的多肽最大局部平均亲水性与其免疫原性和抗原性相关，即与多肽的生物性质相关。
如美国专利号US4,554,101所述，将下列亲水性值赋予氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天门冬氨酸盐(+3.0+/-1)；谷氨酸盐(+3.0+/-1)；丝氨酸(+0.3)；天门冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；脯氨酸(-0.5+/-1)；苏氨酸(-0.4)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应了解可将一个氨基酸置换为具有相似亲水值且仍可获得生物等价，且特别是免疫等价多肽的另一氨基酸。在进行这种改变时，优选亲水值+/-2以内的那些；特别优选+/-1以内的那些；且甚至更特别优选+/-0.5以内的那些的氨基酸置换。
如上所列，氨基酸置换通常以氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等为基础。考虑到上述若干特性的举例性置换是本领域技术人员熟知的且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸盐和天门冬氨酸盐；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天门冬酰胺；及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
“功能-保守性变体”是其中规定的氨基酸残基已被改变但没有改变整个结构构象和蛋白或酶的规定功能的蛋白或酶。这包括但不限于，用具有相似结果或物理性质，包括极性或非-极性、大小、形状和电荷的氨基酸取代另一氨基酸(见，例如，表1)。
表1
氨基酸、相应的密码子、和功能性/性质
 
氨基酸 SLC DNA密码子 侧链性质
异亮氨酸 I ATT，ATC，ATA 疏水的
亮氨酸 L CTT，CTC，CTA，CTG，TTA，TTG 疏水的
缬氨酸 V GTT，GTC，GTA，GTG 疏水的
苯丙氨酸 F TTT，TTC 芳香侧链
甲硫氨酸 M ATG 硫基团
半胱氨酸 C TGT，TGC 硫基团
丙氨酸 A GCT，GCC，GCA，GCG 疏水的
甘氨酸 G GGT，GGC，GGA，GGG 疏水的
脯氨酸 P CCT，CCC，CCA，CCG 仲胺
苏氨酸 T ACT，ACC，ACA，ACG 脂族羟基
丝氨酸 S TCT，TCC，TCA，TCG，AGT，AGC 脂族羟基
酪氨酸 T TAT，TAC 芳香侧链
色氨酸 W TGG 芳香侧链
谷氨酰胺 Q CAA，CAG 酰胺基团
天门冬酰胺 N AAT，AAC 酰胺基团
组氨酸 H CAT，CAC 碱性侧链
谷氨酸 E GAA，GAG 酸性侧链
天门冬氨酸 D GAT，GAC 碱性侧链
赖氨酸 K AAA，AAG 碱性侧链
精氨酸 R CGT，CGC，CGA，CGG，AGA，AGG 碱性侧链
终止密码子 Stop TAA，TAG，TGA
此处所称的“序列相似性”是指核苷酸或蛋白序列相关的程度。两个序列间相似性的程度可以序列同一性和/或保守百分比为基础。除所示那些外的保守氨基酸在蛋白或酶中是不同的，这样任何两个相似功能蛋白之间的蛋白或氨基酸序列相似性百分比就可发生改变，且可以是，例如，至少70％、甚至更优选80％，且最优选至少90％，正如按照序列比对方案测定的那样。
此处的“序列同一性”是指两个核苷酸或氨基酸序列不变的程度。
当在规定长度的DNA序列上，至少约80％、且最优选至少约90％或95％的核苷酸相匹配时，则两个DNA序列基本同源或基本相似，这是通过序列比较算法，如BLAST、FASTA、DNA Strider等确定的。这种序列的例子是本发明特定基因的等位基因或种类变体。基本同源的序列可通过使用序列数据银行所用的标准软件比较该序列而鉴定，或在DNA杂交实验中鉴定，例如，在特定系统所规定的严格条件下杂交。
同样，当超过80％的氨基酸相同，或超过约90％相似时，两个氨基酸序列基本同源或基本相似。优选，相似或同源的序列是通过序列比对鉴定的。
多肽序列的“序列-保守性变体”是规定密码子内一个或多个核苷酸的改变没有导致由该密码子编码的氨基酸改变的那些。
“序列比对”是指排列两个或多个序列，从而获得最高水平的序列同一性的方法(且，在氨基酸序列的情况下，保守)，例如，为了评价序列相似性的程度。用于排列序列并评价相似性和/或同一性的很多方法都是本领域已知的，如，例如Cluster方法，其中相似性是以MEGALIGN算法为基础的，以及BLASTN、BLASTP、和FASTA(Lipman和Pearson，1985；Pearson和Lipman，1988)。当使用所有这些程序时，优选的设置是产生最高序列相似性的那些。
术语“异源的”是指非天然存在的元件组合。例如，异源DNA是指非天然位于细胞中，或细胞染色体位点中的DNA。优选，异源DNA包括对细胞而言是外源性的基因。异源表达调节元件是与不同基因可操纵连接的调节元件，它实际上是可操纵连接的。
修饰，其通常不会改变E6和E7融合多肽的初级序列，包括多肽的体内或体外化学衍生，例如，乙酰化、甲基化或羧化。本发明的变体多肽还包括通过糖基化修饰的这些多肽，例如，通过在其合成和加工过程中或在进一步加工的步骤中修饰多肽的糖基化模式制造的那些；或通过使多肽与影响糖基化的酶，如哺乳动物糖基化或脱糖基化的酶接触制造的那些。变体多肽还包括上面鉴定的诱变序列，其具有磷酸化的氨基酸残基，例如；磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸。
术语“宿主细胞”是指以任何方式选择、修饰、转化、生长、使用或操纵的任何生物的任何细胞，用于利用细胞产生物质，例如利用细胞表达基因、DNA或RNA序列、蛋白或酶。
此处所用术语“分离的”是指从正常发现它的环境中除去的参考物质。因此，分离的生物物质可没有细胞成分，即，发现或产生该物质的细胞成分。就核酸分子而言，分离的核酸分子包括PCR产物、分离的mRNA、cDNA、或限制片段。在另一实施方案中，分离的核酸优选是从可发现它的染色体中除去的，且更优选在染色体中发现时，不再与位于该分离核酸分子所含基因的上游或下游的非-调节、非-编码区，或其它基因连接。在另一实施方案中，所述分离的核酸缺少一个或多个内含子。分离的核酸分子包括插入到质粒、粘粒、人工染色体等中的序列。因此，在具体实施方案中，重组核酸是分离的核酸。分离的蛋白可与细胞中连接的其它蛋白或核酸，或两者连接，或如果它是膜-相关蛋白，则可与细胞膜连接。分离的细胞器、细胞或组织是从在生物中发现它的解剖位点除去的。分离的物质可以是，但并非必需是纯化的。
此处所用术语“纯化的”是指在减少或除去无关物质，即污染物，包括获得该物质的天然材料的条件下分离的物质。例如，纯化蛋白优选基本上没有细胞中与它连接的其它蛋白或核酸；纯化的核酸分子优选基本上没有可在细胞内发现它的蛋白或其它无关核酸分子。在进行物质的分析测试时，此处所用术语“基本上没有”是可操纵使用的。优选，基本上没有污染物的纯化物质为至少50％纯度；更优选至少90％纯度、且更优选至少99％纯度。纯度可通过色谱、凝胶电泳、免疫测定、组成分析、生物测定、和本领域已知的其它方法来评价。
纯化方法是本领域熟知的。例如，核酸可通过沉淀、色谱(包括制备型固相色谱、寡核苷酸杂交、和三股螺旋色谱)、超速离心、和其它方法纯化。多肽和蛋白可通过各种方法纯化，包括，但不限于，制备型圆盘-凝胶电泳、等电点聚焦、HPLC、反相HPLC、凝胶过滤、离子交换和分配色谱、沉淀和盐析色谱、提取、和逆流分布。就某些目的而言，优选在重组系统中生产多肽，其中所述蛋白包含促进纯化的附加序列标记，如，但不限于，聚组氨酸序列，或特异性结合抗体的序列，如FLAG和GST。然后可通过色谱法在适宜的固相基质上从宿主细胞的粗溶解产物中纯化多肽。可选择性地，针对蛋白或从其衍生的肽产生的抗体可用作纯化试剂。细胞可通过各种技术纯化，包括离心、基质分离(例如，尼龙织物分离)、淘选和其它免疫选择技术、缺失(例如，污染细胞的补体缺失)、和细胞分选(例如，荧光激活的细胞分选[FACS])。其它纯化方法也是可用的。纯化物质可包含少于约50％、优选少于约75％、且最优选少于约90％的细胞成分，该这些细胞成分是与其原始连接的。“基本上纯的”表示使用本领域已知的常规纯化技术可获得的最高纯度。
当在规定的严格条件下，一个多核苷酸的至少一个链可退火成另一个多核苷酸时，则多核苷酸可彼此“杂交”。杂交的严格程度是通过进行杂交和/或洗涤的温度，和b)杂交和洗涤溶液的离子强度和极性(例如，甲酰胺)，以及其它参数确定的。杂交要求两个多核苷酸包含基本互补的序列；取决于杂交的严格程度，然而，可允许不匹配。通常，两个序列在高度严格条件(如，例如，在0.5xSSC的水溶液中，65℃下)下杂交要求该序列在它们的整个序列中显示出某些较高程度的互补性。中等程度的严格条件(如，例如，2xSSC水溶液，65℃)和低度严格条件(如，例如，2xSSC水溶液，55℃)要求杂交序列间相应不十分完全的互补性。(1xSSC是0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠)。与此处的多核苷酸“杂交”的多核苷酸可以是任何长度。在其中一个实施方案中，这种多核苷酸的长度为至少10个、优选至少15个且最优选至少20个核苷酸。在另一实施方案中，杂交的多核苷酸为大约相等的长度。在另一实施方案中，杂交的多核苷酸包括在适宜的严格条件下退火且编码具有相同功能，如结合p53(在E6的情况下)或结合Rb(在E7的情况下)的能力的多肽或酶的那些。
这里讨论的一般基因工程工具和技术，包括转化和表达、宿主细胞、载体、表达系统等的使用是本领域熟知的。
此处所用术语“大约”或“近似”是指已知值的50％以内、优选20％以内、更优选10％以内、更优选5％以内、且最优选在已知值的1％以内。可选择性地，术语“大约”或“近似”是指数值可落在该类型值的系统可接受的误差范围内，其取决于所用的工具可给予怎样定性的测量值。“大约”或“近似”可限定平均值，而不是单一值周围的分布。
本发明的免疫原性组合物和药物组合物
本发明提供包含人乳头瘤病毒E6和E7的融合多肽和多核苷酸的免疫原性组合物和药物组合物。这些组合物可用于治疗和/或预防乳头瘤病毒-诱导的癌症，如宫颈癌，和宫颈损害如CIN。这些组合物还可用于治疗下部胃肠道癌，如肛门癌，和生殖系统的其它癌症，如阴茎和外阴癌。
在又一实施方案中，本发明提供包含多个乳头瘤病毒的多肽的融合体和多核苷酸的融合体的免疫原性组合物和药物组合物。例如，本发明提供包含来源于HPV家族的多个成员，如HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68的E6和E7蛋白融合体的免疫原性组合物和药物组合物。HPV E6多肽的例子在图2A-E中表示且来源于HPV 18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68的E6的氨基酸序列分别在SEQ ID NOS：15-26中给出。编码这些HPV E6多肽的核苷酸序列分别在SEQ ID NOS：42-53中给出。HPV E7多肽的例子在图3A-C中表示且来源于HPV18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68的E7的氨基酸序列分别在SEQ ID NOS：27-38中表示。编码这些HPV E7多肽的核苷酸序列分别在SEQ ID NOS：54-65中给出。通过序列比对鉴定的这些融合体所含的残基突变与此处所述HPV16中的突变残基相对应或与E6和E7共有序列所示的保守序列(分别为SEQ ID NOS：39和40)相对应，它们可阻碍蛋白的致癌性，但不会阻碍其诱导免疫反应的能力。在本发明其中一个实施方案中，该免疫原性组合物和药物组合物包含一个融合体，该融合体包含来源于乳头瘤病毒家族不同成员的E6和E7多肽。例如，融合体可在单一构建体内包含源于HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68的E6和E7的任何可能组合。
存在于一个融合体中的E6/E7多肽的数量仅受送递结构的大小限制或送递这些组合物的载体的限制。例如，受结构限制所限的病毒可仅包装特定量的核酸。本领域技术人员可了解到不同病毒包装核酸的能力并了解到筛选适合包装大小的核酸是常规的。
可选择性地，本发明的免疫原性组合物和药物组合物可包含多个、E6/E7的不同融合体。例如，所述免疫原性组合物或药物组合物可包含多个病毒颗粒，每个均含有来源于不同乳头瘤病毒的E6和E7序列的不同融合体。
包含来源于多个乳头瘤病毒的E6/E7融合体的免疫原性组合物和药物组合物是特别有益的，这是因为它们可对多个E6和E7蛋白产生免疫反应并因此预防由这些病毒中的每一个所引起的癌症和瘤形成。例如，HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68的每一个均与宫颈癌和/或上皮内瘤形成有关(Harrison＇sPrinciples of Internal Medicine Fifteenth Edition，2001，1119；Braunwald等人，Eds.，McGraw-Hill)。因此，例如，HPV16和18E6和E7多肽的融合体可预防和治疗两种不同病因学的癌症。包含来源于多个不同病毒的E6和E7多肽的组合物是特别有力的方式，可用于治疗和/或预防多种乳头瘤病毒-诱导的癌症，如宫颈癌、宫颈损害，如CIN，下部胃肠道癌，如肛门癌、和生殖系统的其它癌症，如阴茎和外阴癌。
本领域的技术人员应了解测定免疫原性组合物安全性的方法。例如，测定E6/E7融合体是否可降低或消除转化和永生化能力的举例性方法包括：例如，通过蛋白质印迹、软琼脂测定法测定p53和/或Rb水平，转染原代角质形成细胞或乳上皮细胞并鉴定衰老的损失，和转染细胞并鉴定细胞形态学的改变。除了这些功能测定法，还可使用生化测定法。例如，可测量E6和E7与细胞蛋白，如p53、E6TP-1、端粒酶和Rb的结合。
评价p53和Rb的水平是其中一种测定包含E6/E7融合体的重组病毒颗粒，如VEE安全性的方法。在用表达野生型HPV16E6和E7，作为融合体或单个蛋白、E7E6TetM融合蛋白的VRP、或作为阴性对照的GFP转染后，评价原代人MEC中p53和Rb的稳态水平。MEC的VRP感染揭示了分别含E6和E7野生型形式的培养物中的p53和Rb水平大大降低；与E6简单融合的E7不足以削弱任一蛋白的活性(图8A和B)。相反，用含E6(63C和106C)和E7(24C和26E)突变的E7E6TetM VRP转染的MEC含有正常水平的p53和Rb(图8A和B)，表明这4种突变可消除这些蛋白的原始致癌活性。
因为所建立肿瘤的消除要求针对肿瘤特异性病毒抗原E6和E7诱导较强的T细胞介导的免疫反应，因此选择委内瑞拉马脑炎(VEE)复制子作为免疫原性组合物的载体。然而，任何基因或蛋白送递方法均可用于送递和包装本发明的免疫原性组合物。例如，可使用本领域技术人员已知的其它病毒载体或通过质粒直接送递编码突变融合多肽的核苷酸。
重组AV载体，VEE是其一员，是特别通用的，这是因为它们可作为裸RNA、裸质粒DNA或颗粒被运载，后者是用于免疫原性组合物中的最有效制剂。与其它AV复制子相比，VRP的其中一个区别特性是它们对树突细胞的亲嗜性(MacDonald，G.H.等人，J Virol2000，74：914-922)。VRP-靶向树突细胞对于将抗原运载到淋巴结中而言是十分有效的载体且是有效的节省剂量的策略。
本发明的免疫原性组合物，特别是核酸可经由病毒载体，如慢病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺-伴随病毒、牛痘病毒、杆状病毒、甲病毒和具有所需细胞亲嗜性的其它重组病毒送递。各种甲病毒均可用作病毒载体，包括，例如，Sindbis病毒载体、Semliki森林病毒(ATCC VR67；ATCC VR 1247)、Ross River病毒(ATCC VR373；ATCC VR 1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR923；ATCC VR1250；ATCC VR1249；ATCC VR532)。这种载体系统的代表性例子包括美国专利号US5,091,309；5,217,879；和5,185,440；及国际专利公开号WO92/10578；WO94/21792；WO95/27069；WO95/27044；和WO95/07994中公开的那些。还提供了靶向细胞的特定区，例如，从而使融合多肽定位于细胞膜，如美国专利号US6,228,621所述。
因此，使用病毒载体或通过直接引入核酸，如DNA或复制子RNA，可体内、来自体内、或体外引入编码E6/E7多肽融合体的基因。靶向组织中的表达可通过将重组载体靶向特定细胞而完成，如使用病毒载体或受体配体，或通过使用组织-特异性启动子，或两者。靶向基因送递在国际专利公开号WO96/28494中描述。
通常用于体内或来自体内的靶向和治疗过程的病毒载体是基于DNA的载体和逆转录病毒载体。用于构建和使用病毒载体的方法是本领域已知的(见，例如，Miller和Rosman，BioTechniques 1992，7：980-990)。优选，所述病毒载体是复制缺损的，即，它们不能在靶细胞中自主复制。通常，在本发明范围内使用的复制缺损病毒载体的基因组缺少至少一个区，而该区是在受感染细胞中复制病毒所需的。这些区可被消除(全部或部分)，或通过本领域已知的任何技术使其成为非-功能性的。这些技术包括全部缺失、(被其它序列，特别是被插入的核酸)置换、(复制)必需区的一个或多个碱基的部分缺失或加成(从而引起移码)。这种技术可体外(在分离的DNA上)或原位进行，使用基因操纵技术，或用诱变剂处理。优选，复制缺损病毒仍然保留了包裹病毒颗粒所需的其基因组的序列。
病毒载体包括减毒或缺失的DNA或RNA病毒，如，但不限于，单纯性疱疹病毒(HSV)、Epstein Barr病毒(EBV)、腺病毒、腺-伴随病毒(AAV)、VEE等。优选缺损病毒，其完全或几乎完全缺失病毒基因。在引入到细胞中后，缺损病毒不会产生子代。缺损病毒载体的使用允许给予特定局部区域中的细胞，而无需考虑病毒载体是否扩散并感染其它细胞。因此，可特异性靶向特定组织。特定载体的例子包括，但不限于，复制缺损VEE系统，如Pushko等人(Virology1997，239：389-401)所述，和减毒腺病毒载体，如Stratford-Perricaudet等人(J.Clin.Invest.1992，90：626-630；还见La Salle等人，Science1993，259：988-990)所述的载体，和缺损的腺-伴随病毒载体(Samulski等人，J.Virol.1987，61：3096-3101；Samulski等人，J.Virol.1989，63：3822-3828；Lebkowski等人，Mol.Cell.Biol.1988，8：3988-3996)。
很多公司都商业生产病毒载体，包括但不限于Avigen，Inc.(Alameda，CA；AAV载体)、Cell Genesys(Foster City，CA；逆转录病毒、腺病毒、AAV载体，和慢病毒载体)、Clontech(逆转录病毒和杆状病毒载体)、Genovo，Inc.(Sharon Hill，PA；腺病毒和AAV载体)、Genvec(腺病毒载体)、IntroGene(Leiden，Netherlands；腺病毒载体)、Molecular Medicine(逆转录病毒、腺病毒、和AVV载体)、Norgen(腺病毒载体)、Oxford BioMedica(Oxford，UnitedKingdom；慢病毒载体)、Transgene(Strasbourg，France；腺病毒、牛痘、逆转录病毒和慢病毒载体)、AlphaVax(甲病毒载体，如VEE载体)和Invitrogen(Carlsbad，California)。
在另一实施方案中，可通过脂质转染，如裸DNA，或用其它转染促进剂(肽、聚合物、布比卡因等)将载体引入体内。合成的阳离子脂类可用于制备编码标记的基因的体内转染的脂质体(Felgner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1987，84：7413-7417；Felgner和Ringold，Science1989，337：387-388；Mackey等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1988，85：8027-8031；Ulmer等人，Science1993，259：1745-1748)。用于核酸转移的有用的脂类化合物和组合物在国际专利公开号WO95/18863和WO96/17823，和美国专利号US5,459,127中描述。脂类可与其它分子化学偶联，用于靶向(见，Mackey等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1988，85：8027-8031)。靶向肽，例如，激素或神经递质，和蛋白如抗体，或非-肽分子可与脂质体化学偶联。其它分子也可用于促进核酸体内转染，如阳离子寡肽(例如，国际专利公开号WO95/21931)、来源于DNA结合蛋白的肽(例如，国际专利公开号WO96/25508)、或阳离子聚合物(例如，国际专利公开号WO95/21931)。
还可将载体作为裸DNA质粒引入体内。通过本领域已知的方法，可将用于基因疗法的裸DNA载体引入到所需宿主细胞中，例如，电穿孔、微量注射、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、基因枪的使用(例如，可用于表皮基因送递的Helios基因枪系统(Bio-Rad；Hercules，CA))、或DNA载体转运蛋白的使用(见，例如，Wu等人，J.Biol.Chem.1992，267：963-967；Wu和Wu，J.Biol.Chem.1988，263：14621-14624；Hartmut等人，加拿大专利申请号2,012,311,1990年3月15日提交；Williams等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1991，88：2726-2730)。还可使用受体-介导的DNA送递方法(Curiel等人，Hum.Gene Ther.1992，3：147-154；Wu和Wu，J.Biol.Chem.1987，262：4429-4432)。美国专利号US5,580,859和5,589,466公开了外源DNA序列，没有转染促进剂，在哺乳动物中的送递。可选择性地，将DNA与转染促进剂配制在组合物中，其可促进免疫，如布比卡因和其它局部麻醉剂(美国专利号US6,127，170)。近来，已经描述过相对较低的电压、高效率体内DNA转移技术，即电转移(Mir等人，C.P.Acad.Sci.1998，321：893；WO99/01157；WO99/01158；WO99/01175)。
此处所用术语“免疫原性组合物”广义是指给药以在受体中引发免疫原性反应的任何组合物。免疫原性组合物通常包含免疫有效剂量的免疫原(例如，感染剂的抗原)和药学可接受的载体和，任选地，佐剂。所述药学可接受的载体可以是适合给予人的无菌水或无菌等渗生理盐水，以及任何和所有的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。适宜的载体对本领域技术人员是显而易见的且大部分取决于给药途径。
免疫原性组合物可通过，例如，吸入或吹入(通过口腔或鼻)、或口服、口腔、阴道、直肠或非肠道给药(例如，通过皮下、真皮内、肌内、眼眶内、囊内、脊柱内、胸骨内、腹膜内或静脉内注射等)给予生物。免疫原性组合物还可通过粒子-介导的转移给药(例如，使用“粒子枪”)。见，例如Gainer等人，J.Neurooncol2000，47：23-30；Koide等人，JpnJ.Pharmacol2000，83：167-174；Kuriyama等人，Gene Ther.2000，7：1132-1136；和Yamauchi等人，J.Exp.Zool.2000，287：285-293。这种粒子转移方法对DNA或载体免疫原性组合物是特别优选的，例如，使用“基因枪”。适宜的给药途径是根据所用免疫原性组合物的性质，和患者年龄、体重、性别和一般健康状况的评价和存在于免疫原性组合物中的抗原，及类似因素由医师决定。
免疫原性组合物可包含，例如，减毒或杀死的、引起感染性疾病的感染剂(例如，微生物如细菌或病毒，寄生虫或其它病原体等)的混悬液。可选择性地，本发明的免疫原性组合物可以是多肽免疫原性组合物或DNA免疫原性组合物。术语“多肽免疫原性组合物”是指包含免疫原性多肽的免疫原性组合物，例如来源于感染剂的多肽，其可以是抗原，且因此激活生物中的免疫反应。此处所用的术语“DNA免疫原性组合物”是指利用重组载体送递的免疫原性组合物。此处所用的可选择性术语是“载体免疫原性组合物”(因为某些有效的载体，例如甲病毒载体，是RNA病毒且因为在某些情况下，代替DNA的非-病毒RNA可被送递给细胞)。
术语“免疫有效剂量”是指足以产生所需活性的化合物或组合物用量。因此，为了描述免疫原性组合物，免疫有效剂量是指足以产生有效免疫反应的化合物或组合物(例如，抗原)的用量。总之，用于本发明免疫原性组合物的适宜免疫有效用量或给药剂量的选择也是以所用的特定免疫原性组合物、以及受治疗者的健康状况、最特别是包括受到免疫的受治疗者的一般健康状况和体重为基础的。这种选择和有效剂量的向上或向下调节也在本领域范围内。诱导免疫反应而没有明显副作用所需的活性成分的用量根据所用组合物而变化。
就含有编码本发明突变E6/E7融合多肽的DNA的重组，优选复制-缺损病毒而言，免疫有效量是在常规给药从而转染受治疗者所需细胞方面有效并提供充足的所选基因表达水平以提供所需作用的重组病毒用量。可监测免疫水平以确定是否需要加强，如果有的话。
术语“佐剂”是指提高对抗原的免疫反应的化合物或混合物。例如，佐剂可发挥组织仓库的作用，缓慢释放抗原，也可作为淋巴系统激活剂提高免疫反应(见，Hood等人，Immunology，Second Ed.，1984，Benjamin/Cumming：Menlo Park，California，p.384)。这种佐剂还包括，除了别的之外，MPLTM(3-O-脱酰化单磷酰基脂类A；Corixa，Hamilton，MT)，其在美国专利号US4,912，094中描述，其引入此处作为参考。还适合用作佐剂的是氨烷基葡萄糖胺磷酸盐化合物(AGP)、或其衍生物或类似物，它们可从Corixa(Hamilton，MT)得到，并在美国专利号US6,113,918中描述，其引入此处作为参考。其中一种这类AGP是2-[(R)-3-四癸酰氧基四癸酰氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-四癸酰氧基四癸酰基]-2-[(R)-3-四癸酰氧基四癸酰氨基]-b-D-喃葡萄糖，其也被称作529(从前称作RC529)。该529佐剂可配制成含水形式或稳定的乳液。
其它佐剂包括矿物油和水乳液，铝盐(明矾)，如氢氧化铝、磷酸铝等，Amphigen、Avridine、L121/角鲨烯、D-交酯-聚交酯/糖苷、胞壁酰基二肽、被杀死的博代氏杆菌、皂苷，如Quil A或StimulonTMQS-21(Antigenics，Framingham，MA.)，在美国专利号US5,057，540中描述，其引入此处作为参考，和从其产生的颗粒，如ISCOMS(免疫刺激复合物)、结核分支杆菌、细菌脂多糖、合成的多核苷酸，如含CpG基序的寡核苷酸(美国专利号US6,207,646，其引入此处作为参考)、霍乱毒素(野生型或突变形式，例如，其中29位氨基酸上的谷氨酸被另一氨基酸，优选组氨酸取代，按照国际专利公开号WO00/18434，其引入此处作为参考)、百日咳毒素(PT)、或大肠杆菌热-不稳定性毒素(LT)、特别是LT-K63、LT-R72、CT-S109、PT-K9/G129；见，例如，国际专利公开号WO93/13302和WO92/19265，其引入此处作为参考。各种细胞因子和淋巴因子均适于用作佐剂。其中一种这类佐剂是粒细胞-巨嗜细胞集落刺激因子(GM-CSF)，其具有美国专利号US5,078,996所述的核苷酸序列，该文献引入此处作为参考。已经将含GM-CSF cDNA的质粒转化到大肠杆菌中并在American Type Culture Collection(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209保藏，登记号为39900。细胞因子白介素-12(IL-12)是另一种佐剂，在美国专利号US5,723,127中描述，该文献引入此处作为参考。其它细胞因子或淋巴因子已经显示出具有免疫调节活性，包括但不限于白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、13、14、15、16、17和18，干扰素-α、β和γ，粒细胞集落刺激因子，和肿瘤坏死因子α和β，它们适合用作佐剂。
其它适宜的佐剂包括，但不限于：表面活性物质(例如，十六胺、十八胺、十八烷基氨基酸酯、溶血卵磷脂、二甲基-二十八烷基溴化铵)、甲氧基十六烷基甘油、和pluronic多元醇；多元胺，例如，吡喃、硫酸葡聚糖、聚IC、卡波姆；肽，例如，胞壁酰基二肽、二甲基甘氨酸、他福新；油状乳液；和矿物凝胶，例如，磷酸铝等和免疫刺激复合物。还可将免疫原掺入到脂质体中，或与多糖、脂多糖和/或其它聚合物结合用于免疫原性组合物中。
举例性佐剂包括，但不限于，不完全的Freund＇s佐剂、表面活性物质(例如，溶血卵磷脂)、pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油或烃乳液。举例性佐剂还包括潜在有效的人类佐剂如BCG(卡介苗)和小棒杆菌。此外，免疫刺激蛋白，如，趋化因子或编码趋化因子的核酸序列；可作为佐剂提供，以增加对免疫原性组合物的免疫反应。
短语“药学可接受的”是指当给予个体时，分子实体和组合物是生理可耐受的且通常不会产生变应性或类似不利反应(例如，胃部不适，头昏等)。优选，且特别是在人类中使用免疫原性组合物时，术语“药学可接受的”是指由管理机构(例如，U.S.Food and DrugAgency)批准或在用于动物中的通常认可的药典(例如，美国药典)中所列的。
术语“载体”是指稀释剂、助剂、赋形剂或载体，以用其给予化合物。无菌水或含水的生理盐水溶液和含水的葡萄糖及甘油溶液优选用作载体，特别是用于可注射的溶液。举例性的适宜药物载体在“Reminington′s Pharmaceutical Sciences”中由E.W.Martin描述。
化合物的毒性和治疗功效可通过标准药物过程测定，例如，在细胞培养测定法中或使用实验动物测定LD50和ED50。参数LD50和ED50是本领域熟知的，且分别指使50％人群死亡和对50％人群治疗有效的化合物剂量。毒性和治疗作用之间的剂量比被称作治疗指数且可表示为：LD50/ED50的比值。优选显示较大治疗指数的化合物。也可使用具有毒副作用的化合物。然而，在这种情况下，特别优选使用将这种化合物特异性靶向受影响组织部位的送递系统，以便将对其它细胞、组织或器官的潜在损害减到最小并降低副作用。
从细胞培养测定法或动物研究获得的数据可用于配制用于人类的给药剂量范围。用于本发明治疗方法中的化合物给药剂量优选落在循环浓度的范围之内，包括ED50浓度，但具有较小毒性或没有毒性(例如，低于LD50浓度)。用于任何应用的特定给药剂量可在该范围内改变，这取决于各种因素，如所用的特定给药形式、所用给药途径、个体(例如患者)的状况等。
除人类以外的动物包括，但不限于，实验室动物，如小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠等；驯养动物如狗和猫；畜牧动物如绵羊、山羊、猪、马、和母牛；以及除人类以外的灵长类动物。
治疗有效剂量最初可从细胞培养测定法估计并在动物模型中配制以获得包括IC50在内的循环浓度范围。化合物的IC50浓度是获得症状的一半-最大抑制的浓度(例如，根据细胞培养测定法确定)。然后使用该信息可更准确地确定用于特定个体，例如人类患者的适宜给药剂量。
术语“治疗”是指尝试对肿瘤细胞，即癌引发抗肿瘤反应。抗肿瘤反应包括，但不限于，增加存活时间、抑制肿瘤转移、抑制肿瘤生长、肿瘤消退、和对未修饰肿瘤细胞的延迟型过敏反应(DTH)的发展。
化合物在血浆中的测量值可在个体如患者中常规测量，如利用高效液相色谱(HPLC)或气相色谱技术进行。
用于本发明的药物组合物可使用一种或多种生理可接受的载体或赋形剂以常规方式配制。
因此，化合物和它们生理可接受的盐和溶剂化物可通过上述途径配制用于给药。
就口服给药而言，药物组合物可采用，例如，片剂或胶囊剂的形式，用药物可接受的赋形剂通过常规方式制备，如粘合剂(例如预胶凝的玉蜀黍淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或湿润剂(例如，十二烷基硫酸钠)。片剂可通过本领域熟知的方法包衣。用于口服给药的液体制剂可采用，例如，溶液、糖浆或混悬液的形式，或可以干燥产品的形式给出，在使用前用水或其它适宜的载体构成。这种液体制剂可通过常规方式，用药物可接受的添加剂制备，如混悬剂(例如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化可食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非-水载体(例如，杏仁油、油酯、乙醇或分馏的植物油)；和防腐剂(例如，甲基或丙基-p-羟基苯甲酸盐或山梨酸)。根据需要，所述制剂还可含有缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。
用于口服给药的制剂可被适当配制成控制释放活性化合物。用于口腔给药时，所述组合物可采用以常规方式配制的片剂或锭剂形式。
吸入给药时，用于本发明的化合物通常以气雾剂的形式从加压的包或雾化器中喷出；使用适宜的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适宜的气体。在加压气雾剂的情况下，给药剂量单位可通过提供阀门来送递计量用量而确定。用于吸入器或吹入器中的明胶胶囊和药筒可被配制成含有化合物与适宜粉末基质，如乳糖或淀粉的粉末混合物。
所述化合物可被配制用于通过注射非肠道给药，例如，大药团注射或连续输注。用于注射的制剂可以单位给药剂量形式提供，例如，在安瓿或多剂量容器中，含有添加的防腐剂。所述组合物可采用，如溶于含油或含水载体中的混悬液、溶液或乳液的形式，且可含有配制剂，如混悬、稳定和/或分散剂。可选择性地，活性成分可以是粉末形式，在使用前，用适宜的载体，例如，没有热原的水构成。
所述化合物还可被配制成直肠用组合物，如栓剂或保留灌肠，例如，含有常规栓剂基质，如椰子油或其它甘油酯。
除了前述制剂外，还可将化合物配制成贮存制剂。这种长时间发挥作用的制剂可通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射给药。因此，例如，可用适宜的聚合或疏水物质(例如，在可接受的油中配制乳液)或离子交换树脂配制该化合物，或作为少量溶解的衍生物，例如，作为少量溶解的盐。
如果需要，所述组合物可在包装或分散装置中给出，其可包括含活性成分的一个或多个单位给药剂量形式。该包装可例如包括金属或塑料箔，如发泡包装。所述包装或分散装置可伴有给药说明。
本说明书中所用的术语通常具有本领域中它们的常规含义，落在本发明的范围之内且在具体情况下，可使用各术语。某些术语在说明书中讨论，以在描述本发明的组合物和方法以及如何制造和使用它们时，为实践者提供额外指导。
实施例
通过下列实施例描述本发明。然而，说明书中任何地方使用的这些或其它实施例仅仅用于举例说明而不是对本发明范围和含义或任何举例说明的术语的限制。同样，本发明不限于此处所述的任何优选实施方案。事实上，在阅读了本说明书后，本发明的很多改进和变化对本领域技术人员都是显而易见的，且可在不背离它的精神和范围的前提下进行。
实施例1.HPV16免疫原性组合物构建体的设计和生产材料和方法
VEE-复制子构建体的生产.HPV16E6和E7基因是通过PCR方法(Horton等人，Gene1989，77：61-8)从pHPV-16(ATCC，#45113)获得的，并以两个不同的方向融合，对所有构建体产生编码248个氨基酸的744个碱基对(bp)的可读框(ORF)。除去每个下游ORF的甲硫氨酸起始密码子，以消除内部开始的任何可能性。使用QuikChange
Figure S038A4973X19950426D000303
定点诱变试剂盒(Stratagene；La Jolla，CA)使融合ORF的特异核苷酸发生诱变。将野生型(wt)和突变(mut)融合基因亚克隆到载体pVR200(AlphaVax；Durham，NC)中，一种来源于委内瑞拉马脑炎(VEE)Trinidad驴菌株的高度减毒的、非-神经营养突变体(V3014)的cDNA的质粒(Grieder，F.B.等人，Virology1995，206：994-1006)。pVR200质粒在Pushko等人(Virology1997，239：389-401，特别见p.390-391“细胞系和质粒”和p.393图1b)中描述。简单地说，该质粒具有T7启动子，之后是VEE的非-结构基因、亚基因组启动子26S、目标基因的克隆位点(在本发明中，E6/E7融合体)、和NotI线性化位点。
复制-机能不全的VEE复制子颗粒(VRP)是利用断裂辅助方法制备并按(Pushko等人，Virology1997，239：389-401)所述滴定的。简单地说，将pVR200质粒(克隆的目标融合体)共转染到细胞中，连同：(1)编码壳体的辅助构建体，和(2)编码糖蛋白的辅助构建体。这些辅助构建体均没有包装序列且因此不会掺入到VRP中。因此，所得VRP是复制缺损的。每种VRP制剂的效能，以感染单位/毫升(IU/ml)表示，是通过在幼小仓鼠的肾(BHK)-21细胞上滴定而测得的E7-阳性颗粒数限定的。所有VRP制剂的滴度均超过109IU/电穿孔；在这些研究中，按照先前所述，使用3x105IU/接种免疫的有效剂量(Velders M.P.等人，Cancer Res 2001，61：7861-7867)。
蛋白质印迹和免疫荧光.用所示VRP感染BHK-21细胞。感染后24小时，将细胞采集到SDS样品缓冲液中用于进行蛋白质印迹分析或用甲醇-丙酮固定用于免疫荧光。为了通过蛋白质印迹检测蛋白表达，通过SDS-PAGE分离细胞溶解产物中的蛋白、转移到聚乙烯(PVD)膜上并使用抗-HPV16 E7单克隆抗体(Zymed；San Francisco，CA)，利用Western Breeze检测系统(Invitrogen；Carlsbad，CA)分析。就免疫荧光分析而言，用初级抗-E7抗体，接着是FITC-标记的山羊抗-小鼠次级抗体(#554001，Pharmingen；SanDiego，CA)培养固定的细胞。使用Viaprobe(#555815，Pharmingen)将细胞核染色。
结果
为了设计抗HPV16-诱导的宫颈癌的有效且安全的免疫原性组合物，抗原多样性是通过表达E6和E7肿瘤特异性抗原而增加的。VRP免疫原性组合物中含有全长E6和E7基因对于使表达所有可能表位的可能性达到最大，用于刺激I类和II类HLA-多样性群体中的CD8+和CD4+T细胞。E6和E7ORF的融合体是以两个不同方向通过PCR获得的，且多达5个氨基酸被诱变(图1A和B)以得到表达构建体，用于生产特定的E6/E7融合多肽。
63C位置上单一氨基酸的置换已经显示出可破坏若干HPV16 E6功能：p53降解、E6TP-1降解、端粒酶激活、和，因此，原代上皮细胞永生化(Gao，Q.等人，J Virol 2001，75：4459-4466)。在106C处含有单一点突变的HPV 16 E6既不结合也不促进p53的降解且不能使人MEC永生化，一种依赖于p53降解的表型(Dalal等人，J Virol1996，70：683-688)。98氨基酸HPV16E7蛋白通过L-X-C-X-E基序结合Rb；该基序在24C和26E位置的突变可破坏Rb结合及降解(Munger，K等人，Oncogene2001，20：7888-7898)。除了E7中这两个点突变外，第三个氨基酸910C突变，从而破坏了E7的单一锌指。
这里被称作E6E7wt的第一个融合蛋白在氨基末端包含野生型E6多肽序列(SEQ ID NO：13)的氨基酸序列，在羧基末端包含野生型E7多肽序列(SEQ ID NO：14)的氨基酸序列。这种融合多肽的代表性氨基酸序列在SEQ ID NO：1中提供。编码这种野生型E6E7融合多肽的举例核酸序列在SEQ ID NO：2中给出。
还制备了被称作E6E7TetM的第二个融合多肽。像E6E7wt融合多肽一样，E6E7TetM在氨基末端包含E6多肽序列，在羧基末端包含E7多肽序列。然而，该构建体的E6多肽序列在E6多肽的残基63和106处包含甘氨酸，而不是在野生型E6氨基酸序列(SEQ ID NO：13)中发现的半胱氨酸。此外，该构建体的E7多肽序列在E7多肽的残基24和26处包含甘氨酸，而不是在野生型E7氨基酸序列(SEQ ID NO：14)中发现的半胱氨酸(24)和谷氨酸盐(26)。这种融合多肽的代表性氨基酸序列在SEQ ID NO：3中提供。编码这种E6E7TetM融合多肽的举例性核苷酸序列在SEQ ID NO：4中给出。
还制备了被称作E6E7PentM的第三个融合多肽。像E6E7TetM融合多肽一样，E6E7PentM包含E6多肽序列，其在氨基末端的残基63和106处包含甘氨酸，E6E7PentM还包含E7多肽序列，其在羧基末端的残基24和26处包含甘氨酸。然而，该融合蛋白的E7多肽序列还在E7多肽序列的残基91处包含甘氨酸，而不是在野生型E7氨基酸序列(SEQID NO：14)中发现的半胱氨酸。这种融合多肽的代表性氨基酸序列在SEQ ID NO：5中提供。编码这种E6E7PentM融合多肽的举例性核苷酸序列在SEQ ID NO：6中给出。
被称作E7E6wt的第四个融合多肽在氨基末端包含野生型E7多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)，并在羧基末端包含野生型E6多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)。这种融合多肽的代表性氨基酸序列在SEQ ID NO：7中提供。编码这种E7E6wt融合多肽的举例性核苷酸序列在SEQ ID NO：8中给出。
还制备了被称作E7E6TetM的第五个融合多肽。像E7E6wt融合多肽一样，E7E6TetM在氨基末端包含E7多肽序列并在羧基末端包含E6多肽序列。然而，该构建体的E7多肽在E7多肽的氨基酸24和26处包含甘氨酸残基，而不是在野生型E7氨基酸序列(SEQ ID NO：14)中发现的半胱氨酸(24)和谷氨酸盐(26)。此外，该构建体的E6多肽在E6多肽的氨基酸63和106处包含甘氨酸残基，而不是在野生型E6氨基酸序列(SEQ ID NO：13)中发现的半胱氨酸。这种融合多肽的代表性氨基酸序列在SEQ ID NO：9中提供。编码这种E7E6TetM融合多肽的举例性核苷酸序列在SEQ ID NO：10中给出。
还制备了被称作E7E6PentM的第六个融合多肽。像E7E6TetM一样，E7E6PentM包含E7多肽，其在氨基末端的E7多肽的残基24和26处包含甘氨酸，E7E6PentM还包含E6多肽，其在羧基末端的E6多肽的残基63和106处包含甘氨酸。然而，该构建体的E7多肽序列还在E7多肽的残基91处包含甘氨酸，而不是在野生型E7氨基酸序列(SEQID NO：14)中发现的半胱氨酸。这种融合多肽的代表性氨基酸序列在SEQ ID NO：11中提供。编码这种E7E6TetM融合多肽的举例性核苷酸序列在SEQ ID NO：12中给出。
E6和E7中的突变被设计用于：1)破坏3个锌指，因此使蛋白不稳定且加速降解(并因此增加免疫原性)(E6的63C和106C；E7的91C(Dalal等人，J Virol1996，70：683-8；Shi等人，J Virol1999，73：7877-81))；2)干扰E6-诱导的p53降解(106C；(Dalal等人，J Virol1996，70：683-8))和E6-TP1-结合(Gao等人，J Virol2001，75：4459-66)；和3)利用E7破坏Rb结合及降解(24C和26E；(Edmonds和Vousden，J Virol1989，63：2650-6))。认真选择这些突变以位于已知的HLA表位之外，除91C之外。虽然91C已知是跨越E7的氨基酸86-93的HLA A2表位的一部分(Ressing等人，J Immunol1995，154：5934-43；Ressing等人，Cancer Res1996，56：582-8；Evans等人，Cancer Res1997，57：2943-50)，但决定使该氨基酸突变以得到最大的免疫原性组合物安全性，是因为这种突变可破坏已知使其活性永生化活性所需的E7锌指(Jewers等人，J.Virol1992，66：1329-1335)。因为这种突变并不位于具有已知的HLA-A*0201结合性的肽的P2氨基酸锚定区中(Rammensee等人，Annu Rev Immunol1993，11：213-44)，因此C91G诱变的多肽可保留它们结合HLA-A*0201分子的能力是可能的。且，C91突变可影响跨越E7氨基酸82-90的其它HLA表位的裂解也是可能的。含那5个氨基酸突变的融合构建体被称作PentM。
虽然先前已经各自公开了HPV16E6和E7这些位点每一个处的突变，但是还不了解这些突变组合，如果有的话，是否仍可维持它们的免疫原性。
为了研制出可引发抗病毒致癌产物E6和E7的较强细胞-介导反应的治疗宫颈癌的免疫原性组合物，将这些融合体克隆到基于委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒复制子的系统中。重组VEE免疫原性组合物的优点包括高水平的异源基因表达、树突细胞亲嗜性(由此向淋巴组织，用于诱导免疫型的重要位点，靶向表达)，诱导编程性细胞死亡和较强的细胞及体液免疫反应和有效的重复免疫，这是因为对人类中的VEE还没有广泛存在的免疫性。此外，甲病毒，如VEE在细胞溶胶中复制目标RNA且是细胞病变的，由此显著降低E6和E7整合到细胞基因组中的危险。
为了评价这些融合构建体的表达，用重组VRP感染BHK细胞，随后通过蛋白质印迹和免疫荧光分析。蛋白质印迹分析揭示出E6E7融合蛋白通常以约30kDa的分子量在SDS-PAGE上迁移。虽然野生型和突变构建体的表达水平是可比较的，但是它们的胞内定位大不相同。这些融合蛋白的免疫荧光染色揭示了野生型E6和E7VRP的核重叠的点状染色模式，而对于TetM和PentM VRP则观察到了更扩散的、核周染色(没有给出数据)。这种扩散的核周定位表示蛋白聚集/错误折叠。这种错误折叠表示蛋白不稳定，进一步支持了这些融合蛋白具有较高的引发CTL反应的能力。
实施例2：由不同的免疫原性组合物构建体诱导的细胞免疫反应材料和方法
小鼠和细胞系.特殊的没有病原体的6-12周龄雌性C57BL/6小鼠是从Taconic Farms(Germantown，NY)获得的。将小鼠在Wyeth andLoyola University(Chicago)动物设施中饲养，条件为顶部过滤，随意进食喝水。特殊的没有病原体的6-12周龄雌性HLA-A*0201小鼠是从Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME)购买的。MC57G和EL4细胞用于细胞毒性测定。BHK-21细胞用于VEE RNA表达、VEE复制子颗粒(VRP)包装和滴定(效能测定)。肿瘤侵袭研究是使用E6E7-阳性肿瘤系C3(Feltkamp，M.C.W.等人，Eur J Immun1993，23：2242-2249)、TC-1(Lin，K.Y.等人，Cancer Res1996，56：21-26)、和HLF16进行的。所有细胞系(除了HLF16、C3和TC-1细胞)都是从American TypeCultureCollection(ATCC；Manassas，VA)获得的。
细胞毒性(CTL)测定.用3x105个VRP感染单位给C57BL/6小鼠皮下接种免疫。在用在背面足垫中给予的、单一剂量3x105个所示VRP给小鼠接种免疫后4周进行细胞毒性测定。用丝裂霉素-C-处理过的MC57G细胞再次刺激(20∶1)单细胞的脾细胞混悬液，所述MC57G细胞是以5次多重感染(MOI)，用编码E7或E6的重组修饰牛痘病毒Ankara(MVA)载体感染的。5天后测量CTL活性。E7-或E6-MVA-感染的MC57G细胞和HPV16E749~57H-2Db-限制肽(RAHYNIVTF(SEQ IDNO：41，其与SEQ ID NO：14的氨基酸49-57相对应)；Lin等人，CancerRes1996，56，21-6)-脉冲的EL-4细胞(ATCC)作为靶。以5MOI，用E7-MVA或E6-MVA感染MC57G细胞1小时。将EL-4细胞(1x107)与肽(20μg/ml)培养1小时。然后通过电穿孔，用铕(Eu+3；Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)标记靶细胞3小时。以所示比例培养效应子和靶细胞3小时，之后采集上清液并与增强子溶液(Wallac；Turku，Finland)混合。Eu+3的释放是通过时间-分辨荧光，使用1234Delfia荧光计(Wallac)量化的。特异性溶解的百分比按照(实验-自发释放/最大-自发释放)X100计算。自发释放百分比为5-10％。
结果
为了描述不同免疫原性组合物构建体诱导的免疫反应，用3x105个wt和PentM VRP构建体的感染性单位给C57BL/6小鼠的背部足垫皮下接种免疫。接种免疫1个月后，使用编码E6或E7的MVA感染的MC57G靶，通过铕释放测定法测定CTL-介导的溶解。图4A揭示出源于用野生型或PentM VRP接种免疫的小鼠的CTL均可杀死表达E7的靶。用E749-57肽脉冲的EL-4靶具有相同的结果(没有给出数据)。对E6靶的CTL-介导的溶解也很明显，该E6靶来源于用所有形式的VRP接种免疫的小鼠，虽然在突变VRP的受体中溶解大大降低(图4B)。有关E7和E6特异性溶解的这些结果在另外两个实验中再现，且使用TetM VRP接种免疫的小鼠也可观察到(没有给出数据)。
这些结果表明用编码突变型和野生型融合蛋白的VRP进行接种免疫可对免疫显性E749-57表位产生相似的CTL反应，其对于肿瘤排斥是很重要的。针对用表达野生型基因的VRP免疫的动物的E6靶的CTL反应是可清楚检测的，消除CTL反应则是在接受突变形式E6的小鼠中观察到的，表明63C和/或106C是H-2b-限制表位的重要成分。
实施例3：免疫原性组合物构建体在C3和TC1肿瘤模型中的肿瘤保护和治疗功效
材料和方法
肿瘤保护和治疗实验.通过腹膜内注射10mg/kg赛拉嗪(Sigma，St.Louis，MO)和100mg/kg氯胺酮(Abbott Laboratories，Chicago，IL)将每组14只C57BL/6小鼠麻醉，并通过在第21天和第7天将3x105VRP注射到背部足垫中而进行接种免疫。阴性对照小鼠接受3x105IU绿色荧光蛋白(GFP)VRP。一周后，每组中有一半小鼠通过皮下侧腹注射5x105C3细胞而受到侵袭(Feltkamp等人，Eur J Immunol1995，25：2638-42)，另一半用5x104TC-1细胞侵袭(Lin等人，Cancer Res1996，56：21-6)。每3天监测一次肿瘤的生长。就C3治疗实验而言，首先在侧腹中用5x105个C3肿瘤细胞侵袭小鼠，接着在第7、14和12天，以3x105/每次接种免疫的剂量用所示VRP接种免疫。就人肺成纤维细胞(HLF)治疗实验而言，HLA-A*0201转基因小鼠是通过在第0天将2x106个HLF16细胞皮下注射到左侧腹中侵袭的。在侵袭后第5、10和15天，如上所述将小鼠麻醉并通过将3x105个VRP注射到背部足垫中而进行接种免疫。每隔5天监测一次肿瘤生长。
也见：小鼠和细胞系(上文)
结果
比较编码野生型E7E6和E7E6PentM融合蛋白的VRP的体内预防抗肿瘤功效。所有组的小鼠都是在第0天和第21天用3x105个所示VRP接种免疫且随后用C3或TC-1肿瘤细胞侵袭的。接受GFP-VRP的所有小鼠作为阴性对照，在肿瘤侵袭约7天后长出肿瘤(图5A和B)。相反，接受E7E6野生型或PentM的所有小鼠均没有受到肿瘤侵袭，而与它们是否接受了C3(5x105)(图5A)或TC-1(5x104)(图5B)肿瘤细胞无关。这些数据表明保护不限于特异性鼠肿瘤侵袭模型，且该保护主要取决于VRP-编码的E6和E7基因产物。
作为更严格的抗肿瘤功效测量值，在下一个实验中，在第7、14和21天，用E7E6野生型、PentM、或TetM VRP接种免疫前，用C3肿瘤细胞侵袭小鼠。图6表示接受任何表达突变型或野生型E6和E7融合蛋白的VRP的小鼠中，有85％-100％排斥C3肿瘤，与之相比，阴性对照小鼠为0％-12％。如先前Velders等人(Cancer Res2001，61：7861-7)和图6所述，单独表达E7的VRP免疫原性组合物仅在65％-75％的小鼠中促进排斥。
最后，与单独的E7相比(67％-75％，图6)，包含编码作为融合配偶体与E7融合的E6的基因，可再现性地提高治疗性抗肿瘤功效(85％-100％，图6)，而与E6是野生型还是突变型无关。因此，E6中的突变，当与E7融合表达时，不会导致这些肿瘤模型中的抗肿瘤作用消除。然而，该结果举例说明对含突变氨基酸的表位的最佳CTL反应不会在某些用突变VRP接种免疫的个体中被引发。在人类中，这可能不是原因，I类和II类HLA等位基因的多样性可与C57BL/6小鼠表达的有限数量的H-2等位基因相比较。
实施例4：免疫原性组合物构建体在HLF16肿瘤模型中的治疗功效
虽然实施例2和3的结果显示出鼓舞人心的结果，但C57BL/6小鼠中HPV抗原的H-2b限制T细胞的识别为HLA限制的抗肿瘤反应提供有限的预测值。因此，有关相同的免疫原性组合物可对HLA-A*0201转基因小鼠中的HPV16E6和E7诱导HLA-A*0201限制反应的证实是特别重要的(Ressing等人，J Immunol1995，154：5934-5943)。
来源于HLA-A*0201转基因小鼠的CD8+T细胞已经显示出可识别相同的HLA-A*0201限制抗原，如HLA-A*0201限制人CTL识别的那些(Engelhard等人，J Immunol 1991，146：1226-1232；Shirai等人，J Immunol1995，154：2733-2742)。HLA转基因小鼠的使用可因此克服H-2限制肿瘤排斥的限制。然而，还没有HPV肿瘤模型可用于试验HLA-A*0201限制性抗-肿瘤反应。这里，提出了HLA-A*0201转基因小鼠的第一个HPV16肿瘤模型(还在Eiben GL等人，Cancer Research，Oct.152002，62，No.20中描述)。E6/E7融合体的免疫原性就是在该模型中测试的。
该肿瘤模型是通过用HPV16E6和E7和Ras V12转染HLA-A0201转基因C57BL/6小鼠的成纤维细胞，在HLA-A0201小鼠中产生致瘤细胞系(HLF16)而研究的。除去E7基因中的显性H-2Db表位，以确保抗-肿瘤反应不依赖于49-57表位且很可能通过HLA-A*0201介导。
构建体的TetM组用于HLF肿瘤模型中。这些构建体仅含4个突变：E6中的C63G和C106G；E7中的C24G和E26G。除去E7中的突变C91G(存在于PentM构建体中)，因为已知它是跨越E7氨基酸86-93的HLA-A*0201表位的一部分(Ressing等人，J Immunol1995，154：5934-43；Ressing等人，Cancer Res1996，56：582-8；Evans等人，Cancer Res1997，57：2943-50)。通过使用II类-结合算法(www.imtech.res.in/raghava/propred)，还可确定在E7的氨基酸87和95之间是否存在对若干II类单元型而言杂乱的预测表型。因为发现II类-介导的免疫反应在C3肿瘤模型中，是VRP免疫原性组合物的治疗功效所需的，因此假设PentM免疫原性组合物构建体中存在的C91G突变可破坏人II类表位。
材料和方法
HLF16肿瘤模型的构建体和描述.HLF16肿瘤细胞系来源于从HLA-A2 Dd转基因C57BL/6小鼠解剖下来的心肺组织。培养若干周后，用含E6/E7的pIRES双-顺式载体转化粘附的成纤维细胞，并激活H-ras，同时赋予遗传霉素抗性。除去来源于HPV16E749-57基因产物的唯一已知的H-2b I类限制表位(Velders等人，Cancer Res1997，61：7861-7867)以确保肿瘤不存在于该免疫显性的HPV16E7表位。在G418上选择转染子并克隆扩展。然后通过FACS分析测试各克隆的HLA-A*0201表达。随后测试显示最高水平HLA-A*0201表达的克隆在软琼脂中形成集落的能力。心肺成纤维细胞克隆16(HLF16)在软琼脂中显示出锚定的独立性生长，并选择用于进一步研究。用抗-E7单克隆抗体进行免疫荧光染色后，E7表达在HLF16的胞质和核中是显而易见的。为了确定HLF16系事实上是否在小鼠中形成肿瘤，用不同浓度的肿瘤细胞给HLA-A*0201转基因小鼠注射并监测35天。所有小鼠均长出肿瘤，但只有用最高剂量，2x106个HLF16细胞侵袭的那些才随着时间而仍然维持肿瘤。HLF16肿瘤大约在第5天出现，且继续逐渐生长，直到它在第35天变成大约12x12x12mm，并在该时间点处死小鼠。HLF16肿瘤细胞系的构建和描述还可见Eiben GL等人(Cancer Research，Oct.152002，62，No.20)。
软琼脂测定法.锚定-独立性生长能力是通过评价混悬于软琼脂中的细胞的集落形成效率而测定的。将转化细胞和对照细胞(0.5x106、0.25x106和0.1x106)接种在5ml 0.3％覆盖琼脂上，并加入到用20ml0.6％衬垫琼脂覆盖的10mm平板中。干燥平板并在37℃下培养。平板接种3周后计算集落数。
还可见：小鼠和细胞系、肿瘤保护和治疗实验、及蛋白质印迹和名义荧光(上述)
结果
通过BHK-感染细胞的蛋白质印迹和免疫荧光检测TetM构建体的表达。E6E7和E7E6TetM蛋白以约30kDa在SDS-PAGE上迁移并具有与PentM构建体非常相似的扩散性核周定位。
在HLF肿瘤模型中分析PentM和TetM免疫原性组合物构建体的肿瘤治疗功效(图7)。用2x106个HLF16细胞皮下侵袭转基因小鼠，并在侵袭后第5、10和15天，用GFP VRP、TetM VRP或PentM VRP给小鼠接种免疫。用E7E6TetM VRP接种免疫后出现完全的肿瘤排斥，而E7E6PentM VRP和E6E7PentM VRP则诱导90％小鼠的肿瘤退化，除了E6E7 TetM外(图7)。这些结果证实了用这里试验的若干VRP进行的治疗性接种免疫产生了较高程度的抗肿瘤功效，和E749-57特异的T细胞的贡献无关。此外，这些结果证实了其中E6在E7羧基末端的融合体(E7E6融合体)较之其中E6位于氨基末端的对应物(E6E7融合体)可提供更强的免疫保护。
根据C3和HLF16肿瘤模型的集合治疗功效数据(图6和7)，我们可总结出编码HPV16E6和E7突变形式的VRP，没有任何辅助蛋白、细胞因子、或佐剂，对消除所建立的鼠肿瘤而言十分有效。
实施例5：表达突变体E6和E7的VRP不会诱导p53和Rb的降解
用表达野生型HPV16E6和E7，作为融合蛋白或单个蛋白、E7E6TetM融合蛋白的VRP、或作为阴性对照的GFP感染后，评价原代人MEC中p53和Rb的稳态水平。
材料和方法
p53和Rb的检测.以MOI＝10用编码野生型或突变形式E6和E7的VRP感染原代人乳上皮细胞(MEC，Clonetics，San Diego，CA)并在16-20小时后采集总的细胞蛋白。为了提高p53检测，用1.0nM放线菌素D处理细胞(Sigma，St.Louis，MO)。每泳道上样25微克总蛋白，通过SDS-PAGE电泳，并印迹到PVDF膜上。使用抗-p53抗体(FL-393，Santa Cruz Biotech，Santa Cruz，CA)或抗-Rb抗体(Catalog#554136，BDPharmingcn，San Diego，CA)探测蛋白质印迹。通过用抗-微管抗体探测而监测微管蛋白水平作为上样对照(H-235，Santa Cruz Biotech，Santa Cruz，CA)。
结果
确定在VRP感染的情况下，与这些蛋白的野生型形式相比，突变形式的E6和E7融合蛋白是否会功能性灭活p53和Rb。选择E7E6TetM是因为它被证实具有较高的抗肿瘤功效(图6和7)并含有最小数量的突变。
用编码单独的HPV16E6、单独的E7、E7E6野生型或E7E6TetM的VRP感染原代人乳上皮细胞(MEC)。以MOI＝10，用这些VRP中的每一个感染原代人乳上皮细胞(MEC)约20小时后，通过SDS-PAGE将含等量总细胞蛋白的细胞溶解产物进行电泳，转移到PVDF膜上，并用p53(图8A)、Rb(图8B)的特异性抗体探测，微管蛋白作为上样对照。这些蛋白质印迹的结果在图8A和8B中表示，且代表两个独立的实验。
与含有可与阴性对照GFP-VRP感染样品相比较的p53水平、用E7E6TetM感染的MEC相比，用编码单独的E6或E7E6野生型融合蛋白感染的MEC含有不可检测水平的p53(图8A)。与用E7E6TetM VRP或GFP-VRP感染的MEC相比，用编码单独的E7或E7E6野生型融和蛋白的VRP感染的MEC含有不可检测水平的Rb(图8B)。含E7的融合蛋白在E7E6野生型和E7E6TetM VRP感染样品中的存在是通过用抗-E7单克隆抗体探测那些泳道而加以证实的(图8A和8B)。结果显示在VRP感染的情况下，表达E6和E7野生型形式的原代MEC中的p53和Rb水平大大降低，而在VRP感染后，在表达E7E6TetM的MEC中则是正常的。
总之，MEC的VRP感染揭示出分别含E6和E7野生形式的培养物中的p53和Rb水平大大降低；与E6简单融合的E7不足以损害任一蛋白的活性(图8A和B)。相反，用含E6(63C和106C)和E7(24C和26E)突变的E7E6TetM VRP感染的MEC含有正常水平的p53和Rb(图8A和B)，表明这4个突变可消除这些蛋白的原始致癌活性。对E7E6TetM VRP的永生化可能的评价揭示了MEC在感染后死亡，其是由复制子表达的AV非结构蛋白表达的预期结果(Griffith等人，Annu.Rev.Microbiol.1997，51：565-592)且进一步支持了该载体的安全性。
*****
本发明不限于此处所述具体实施方案的范围。事实上，除了此处描述的那些外，根据前面的描述和附图，本发明的各种改进对本领域技术人员而言是显而易见的。这种改进落在权利要求的范围内。
本发明的说明书中引证并讨论了若干参考文献，包括专利、专利申请和各种公开出版物。这种参考文献的引证和/或讨论仅被提供用于阐明本发明的描述，而没有承认任何这种参考文献都是此处所述本发明的“现有技术”。本说明书中引证和/或讨论的所有参考文献整体引入此处作为参考，且与每篇参考文献单独引入此处作为参考的程度相等。
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Claims (24)

1.一种由人乳头瘤病毒E6和E7多肽组成的分离的融合多肽，其中
该E7多肽在与SEQ ID NO：14的氨基酸24和26相对应的氨基酸处被突变成甘氨酸，
且该E6多肽在与SEQ ID NO：13的氨基酸63和106相对应的氨基酸处被突变成甘氨酸，
并且任选地所述E7多肽在与SEQ ID NO：14的氨基酸91相对应的氨基酸处被突变成甘氨酸；
其中所述分离的融合多肽保持免疫原性并缺乏降解Rb和p53的能力。
2.根据权利要求1所述的分离的多肽，其中E7多肽在E6多肽之前。
3.一种编码权利要求1的分离的多肽的分离的核酸。
4.根据权利要求3所述的核酸，其中E7的核苷酸序列在E6的核苷酸序列之前。
5.一种受表达控制序列控制的、包含权利要求3的核酸的表达载体。
6.一种包含权利要求3的核酸的宿主细胞。
7.一种表达权利要求1的分离的多肽的宿主细胞。
8.一种包含权利要求5的表达载体的宿主细胞。
9.一种免疫原性组合物，它包含：
(a)权利要求1的分离的多肽；和
(b)药学可接受的载体。
10.根据权利要求9所述的免疫原性组合物，它还包含佐剂。
11.一种免疫原性组合物，它包含权利要求3的核酸。
12.一种包含权利要求3的核酸的重组病毒。
13.根据权利要求12所述的重组病毒，其中该病毒是一种减毒的委内瑞拉马脑炎病毒。
14.足以产生免疫反应的量的权利要求9的免疫原性组合物在制备治疗和/或预防乳头瘤病毒诱导的癌症的药物中的用途。
15.足以产生保护性免疫反应的量的权利要求9的免疫原性组合物在制备治疗宫颈癌的药物中的用途。
16.足以产生保护性免疫反应的量的权利要求9的免疫原性组合物在制备预防宫颈癌的药物中的用途。
17.足以产生保护性免疫反应的量的权利要求5的表达载体在制备预防宫颈癌的药物中的用途。
18.足以产生保护性免疫反应的量的权利要求5的表达载体在制备治疗宫颈癌的药物中的用途。
19.一种分离的多肽，它的氨基酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQID NO：9或SEQ ID NO：11所示。
20.一种分离的核酸，它编码氨基酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5、SEQID NO：9或SEQ ID NO：11所示的多肽。
21.根据权利要求20所述的分离的核酸，它的核苷酸序列如SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12所示。
22.一种受表达控制序列控制的、包含权利要求20的核酸序列的表达载体。
23.一种受表达控制序列控制的、包含权利要求21的核酸序列的表达载体。
24.根据权利要求1所述的分离的多肽，其中该分离的多肽保持与由人野生型乳头瘤病毒E6和E7组成的分离的多肽至少相同的免疫原性。
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