CN1753617A - 可重构的干燥血液制品 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种制备干燥的颗粒状血液制品的方法，此颗粒含有置于保护物质中的无核血细胞，所述方法包括：从哺乳动物对象获取血样；在所述样品中加入抗凝剂；浓缩所述样品中的细胞；从所述样品中回收含有无核血细胞的浓缩液；用所述浓缩液浸渍含大分子保护物质的颗粒；在－20℃至+120℃温度范围内干燥已浸渍的颗粒，并且，任选地，用密闭容器包装干燥颗粒。

Description

可重构的干燥血液制品

本发明专利是涉及可重构的干燥血液制品(reconstitutable dried bloodproducts)，其制备及重构方法，及其医学和非医学(如研究)用途。

医院配有血液制品库(如红细胞浓缩物，血小板，血浆等)，用于外科手术等。包含无核血细胞(即没有细胞核的细胞，例如红细胞和血小板)的血液制品能迅速变质失效。血小板储存在常温下会迅速降解；如果没有冷藏和储存到大约1-4℃的冰箱中，红血球会迅速降解。即使冷藏了，一段时间以后，这些血液制品也会变质失效并且必须丢弃，例如，对红血球(红细胞)为3-6周，对血小板为4小时-7天，因为无核细胞已经死亡、变质、或基本上消失，或者由于细菌感染已达到了不可接受的程度。

卫生当局及医院通常依赖于不断地收集、分离和储存血液来满足他们的正常的需要，而且为了保持供给的最高水平，外科所需要的血液制品通常使用保存期内的储存时间最长的产品，即处于次优状态的产品。当所供给不能充分满足需要，例如遇到有大量伤亡的意外事件或者具有罕见血型的个体需要大量相容的血液制品，必须从远的地区运输新鲜的血液制品，因此如果供给及运输受到限制，患者的生命将受到威胁。

因此，在发生较大事故或大量伤亡事件的情况下，医院和卫生当局承担着可供输血用的血液制品不足的风险。在这种情况下，医院和卫生当局不能依赖能征集献血者并在需要时间内得到足够的血液，因为很重要的是，献血者的血液在使用前要经过检测，以确定没有各种疾病(如艾滋病感染等)。

虽然低温长期储存一些细胞是可行的，例如在-196℃的液氮中，但对于无核细胞，这是不可能的，除非采用了外源性的防冷冻措施及复杂昂贵的冷冻和重构(reconstitution)的处理方法。这些方法不仅复杂，而且在灾区或者武装冲突地区并不适用，在这些地区通常没有必要的连续可靠电力和液氮供应。

常规的冷冻技术很简单，不适用于包含无核细胞的血液制品。例如W.Tousel在他与H.Hindorf合作的文章“Principes et applications de lalyophilisation des produits biologigues，pharmaceutiques et alimentaires”(Science et Technique du Frod，Tokyo，Japan，1985，pages287-292)文后所附的讨论，当问到是否有冻干这些产品的经历时，答复是“冻干这些如血小板和红细胞等敏感的血细胞是不可能的。这些细胞可以通过液体贮存的方法保存，例如损失一些细胞的液氮的方法”。该讨论还建议：红细胞可以通过冷冻在-28℃在含有25％甘油的液体中保存，或者通过其他冷冻技术保存在-196℃至-80℃。

甘油或其他防冻剂的使用明显是不受欢迎的，因为这些制剂在血液制品进行输血液体前必须除去，而且如上所述，低温技术需要复杂及昂贵的设备、材料和方法，而这些在灾区(如地震、火山喷发或重大意外事故地区)或者武装冲突地区通常是不可得或不可行的。

这就需要一些保存期长于现有水平的血液制品，而且在需求增加时能够迅速重构输入患者体内，例如当正确配型的血液制品耗尽时。此外，对于血液制品有特别要求，就是作为现有输血液体制剂的安全可靠的替代品。另外，由于现有产品的体积和冷藏设备的原因，在边远的地区和较大的城区，血液制品的后勤保障都很复杂。

现在我们令人惊讶地发现以下是可能的：生产含有无核细胞的干燥的血液制品，在常温下保存或相对温和的冷藏保存，即使在明显超过同等的冷冻血液产品的最长保存期后，能够使产品重构成含有活细胞的输血液体。

因此，从一个方面看出，本发明提供了干燥的颗粒状的血液制品，这些颗粒包含存在于大分子保护物质中的无核血细胞。

干燥的产品通过溶解在生理耐受性水溶液中，达到相应物种的血液的正常范围内的等渗状态，并在相应物种的正常日间体温1℃内，包含完整的活细胞。

更进一步看出，本发明提供了一种制备干燥的颗粒状的血液制品的方法，这些颗粒包含存在于保护物质中的无核血细胞，所述的方法包括：

从哺乳动物供体(如人)获取血样；

在所述样品中加入抗凝剂；

浓缩所述样品中的细胞；

从所述样品中回收包含无核血细胞的浓缩液；

用所述浓缩液浸渍包含大分子保护物质的颗粒；

在-20℃到120℃的温度范围内(优选地-10℃到40℃，对于高温干燥机高达120℃是可行的)，干燥已浸渍的颗粒；

并且任选地，用密闭容器包装干燥的颗粒，尤其是在任何顶部空间都基本上无氧的容器，例如：真空包装。

本发明中所使用的大分子保护物质优选地是一种包含水溶性大分子的物质，分子量超过1000D，优选地超过2000D，更优选地为上述物质的混合物。优选地包含对所采血液的物种为内源性的大分子，特别地为选自多聚糖、蛋白(包括糖蛋白)及脂类(如磷脂)。尤其优选地包括天然存在于所采血液的物种中的大分子，如血浆蛋白、细胞内蛋白及细胞膜分子(如蛋白质和脂质等)。更具体地，所述物质优选包含源自无核血细胞尤其是红细胞的细胞膜分子。尤其优选地，物质包括血影蛋白(spectrin)。在特别优选的实施方案中，保护物质基本不含血红蛋白，例如相对于红细胞的血红蛋白(干燥的固体成分)，血红蛋白的浓度要低于50％wt，优选地低于25％wt，更优选地低于10％wt，尤其低于1％wt。

已浸渍的颗粒干燥优选在-5℃到37℃的温度范围内进行，尤其是-1℃到25℃，具体而言是0℃-15℃，更具体而言是1℃到10℃，例如3℃到5℃。干燥处理的持续时间将依赖于所使用的干燥技术，但优选的不能超过10小时。干燥时间的上限为8小时是优选的。

优选地进行干燥以便使干燥后产品的水分占1～20％wt，更优选的为2-17％wt，特别是5-12％wt，更特别为7-10％wt。

干燥可以使用任何合适的方法，例如：真空干燥、喷雾干燥、流化床干燥、旋转干燥、搅拌床干燥(agitated bed drying)、传动皮带(continuous belt)干燥等。然而，对细胞产生最小的物理性应力的技术是优选的，因此流化床干燥是特别优选的。

在干燥的过程中，可使用常规的干燥介质(如空气和氮气等)；而且优选地使用氮气、氧含量降低的空气或者惰性气体。

干燥过程中的气压优选地为环境大气压的10％以内。

替代传统的使用气体使粒子层流化的流化床干燥机，本发明改以机械手段流化粒子层的方法，例如通过反向旋转平行臂带动螺旋桨或桨叶。上述机械流化床被用于例如聚合工业，以便将茂合金属催化剂(metallocene catalysts)加入到颗粒载体中(见Borealis的专利申请的实施例)。如果使用机械流化，优选地，干燥机的气压低于环境的大气压。

在发明方法中，所浸渍的颗粒优选地为固体或胶体的形态，尤其是固体形态。颗粒的尺寸(即样品颗粒的直径)优选地为0.05-5mm，更优选地为0.5-3mm。因此，如果需要，在使用前对颗粒分级(即过筛)，以选择合适尺寸的颗粒。颗粒尺寸的基本均匀导致了浸渍颗粒基本均匀干燥，因此使无核细胞在干燥时受的压力最小化。

颗粒的浸渍可以使用任何合适的方法实现，例如将浓缩液喷雾或滴注到颗粒上、将颗粒浸入到浓缩液中，或者让浓缩液的流幕(curtain of falling)在颗粒上方通过(即移动浓缩液、颗粒或者两者都移动)。优选地，使用使无核细胞承受最小机械应力的技术，如液滴或使用流幕。如果需要，在浸渍过程中可以搅拌颗粒，如机械或气流搅拌(例如搅拌床或流化床)。

所用颗粒理想地是多孔的(例如超过10μm的孔径或缝隙)和/或水溶胀性的。

颗粒的浸渍可以选择性地，但次于优选地，通过混合浓缩物和保护物质的溶液并凝胶所形成混合物的滴液来达到，例如滴注或者喷雾混合物到一种体系中，在此体系中混合物能形成凝胶，例如所含试剂能和混合物的成分相互作用形成凝胶的溶液。因此，例如，混合物可含有藻酸盐，并通过滴入或喷雾到钙盐溶液中形成凝胶小滴。

在本发明可以替换的方面，颗粒的保护物质可用液体(通常是水溶液)、含细胞核的真核细胞(优选地是哺乳动物，具体而言是人的细胞)的分散体或悬浮液来浸渍，然后进行干燥生产出可重构的生物制品。

从另一方面看，本发明提供了一种干燥的、可重构的生物制品，包含存在于在大分子保护物质中的有细胞核的真核细胞。

从另一方面看，本发明提供了一种制备干燥的、可重构的生物制品的方法，此方法包括用包含含有细胞核的真核细胞的溶液来浸渍颗粒状的大分子保护物质，及干燥已浸渍的颗粒。

尤其优选地，可重构的生物制品(即可以再水化保持所需的生物活性的产品)是一种干燥的干细胞产品。

在本发明方法中使用抗凝剂优选地是一种可以抑制细胞聚集和/或作用于抑制纤维蛋白的形成的试剂。合适的抗凝剂的一个实例柠檬酸盐。在采集血样后加入抗凝剂来制备可输血用的血液制品是一种常规做法。实施中使用的典型的抗凝剂包括CPD、CP2D、CPDA-1、AS-1、AS-3及AS-5。

本发明方法中的细胞浓缩步骤可为任何合适的浓缩方法，例如过滤。而优选使用离心。通常在采集供血者的血液后进行离心来制备在储存前分离出来的血细胞的浓缩液和无细胞的血浆。离心，任选地几个循环的离心，通常用于制备血液中不同类型的细胞浓缩物，例如红细胞、血小板、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、B细胞、T细胞和NK细胞，因为在某些外科手术中(例如器官移植手术)，不总是需要各种细胞保持在正常比例的细胞输血液体。用于本发明方法中的含有细胞的浓缩液可包含血小板和/或红细胞及任选地其他的血细胞和血蛋白等。但是优选地，其含有的有核细胞相对无核细胞的丰富程度要低于血液。为达此目的细胞浓缩步骤可包括离心、分离、稀释、离心等的几次循环，以增加最终浓缩液中所需细胞类型的相对量。通常，具体而言在制备红细胞制品时，需要在离心前减少白细胞和细胞因子的浓度，例如使用管线白细胞滤除装置(in-line leucocyte reduction filter)(购自BaxtorHealthcare)。

细胞浓缩后，在进一步处理前，浓缩液冷冻(例如1-4℃)下保存高达35天。但是浓缩液的进一步处理优选地是在最小的延迟时间内，优选地不超过7天，更优选地不超过24小时。

为了使本发明的血液制品中的细胞活力最优化，应尽可能减少在血液采集和产品干燥之间的时间延迟，处理步骤中任何阶段的中间产品冷藏保存(例如1-4℃)。

尽管本发明适用于具有血液循环系统的所用动物，尤其适用于哺乳动物的血液，具体而言是人的血液。

在样品的收集阶段，优选地从健康供血者采集血液，例如利用来自相关的卫生当局的国际认可的推荐，或者在挪威，从挪威的卫生部。典型地，对于人的血液，每个供血者的样品体积在100到800ml的范围内，更优选地为200到600ml，例如400到500ml，尤其是440到480ml。优选地，供血者的血液要进行感染的筛查，尤其是病毒传染，具体而言是乙型肝炎、丙型肝炎和HIV。如果筛查结果显示血液被感染了，样品应不被采用，除非此干燥产品只用于供血者。通常不论如何所有被感染的样品将不被采用。但是本发明的干燥产品比全血或血液成分的样品对净化技术的范围更为易感，例如放射性照射、气体暴露中等，因此，也许没有必要丢弃发现有疾病标志的血液样品。血液应在无菌的条件下并使用无菌设备进行血液采集、储存和处理。采集样品应该如上所述加入抗凝剂。典型地，对于450ml的血样，应该收集到包含63ml的柠檬酸/磷酸盐/葡萄糖溶液的无菌水溶液(例如CPD、CP2D或者CPDA-1)。如果样品不能迅速的进一步处理，需要冷藏保存，例如在1-4℃。血液的采集例见2000年Mosby出版，Blaney等编写的“Basic and AppliedConcepts of Immunohaematology”的第11章。

然后将样品进行细胞浓缩，例如使用常规的离心方法。然后将得到的细胞悬液立即进一步处理或者在进一步处理前冷藏保存(例如1-4℃)至多5周。

如果需要，细胞浓缩的步骤可用来收集所有类型的血液细胞；然而，如需要，如果最终的产品需要包含特定的细胞而不是整个血细胞谱，仅需要收集特定类型的细胞，例如红细胞、血小板、干细胞、粒性白细胞或淋巴细胞。

如果需要也可以采集血浆，并进一步处理得到血蛋白(例如血浆蛋白，具体而言指γ-球蛋白、白蛋白和凝集因子)和细胞组织物质等。这些物质的收集和浓缩采用标准技术，例如亲和色谱及其他已知的分离技术。

具体而言，细胞浓缩的步骤是用于从无核细胞中分离有核细胞，然后用对有核细胞致命的技术进行浓缩液灭菌，例如放射性照射等。这可以对浓缩物进行或者对在制备、包装和储存的任何后续阶段的产品进行。

干燥的颗粒血液制品很方便地包装于容器中然后密封。优选地密闭容器中的气体为无氧的气体，例如氮气或氦气。密闭容器可在环境温度下储存，但理想地是冷冻或冷藏保存，例如-20℃至+10℃，优选地为-10℃至+4℃。

干燥的产品可通过与无菌含水溶液混合进行重构，优选的是和干燥的产品混和后形成一种与血液在10％以内等渗的溶液，例如相当于0.8-1.0％的盐溶液。具体而言，理想地，得到的重构溶液包含血浆中主要的金属离子，即钠、钙、钾及镁。也希望重构溶液里包含葡萄糖、三磷酸腺苷和2，3-二磷酸甘油酯。

为了优化储存和重构，本发明方法中浸渍的保护物质颗粒的平均尺寸(例如以D(v，0.5)表示)的优选范围为0.05到5mm，尤其是0.5到3mm。如果必要，保护物质可依大小区分，如筛分，以筛选具有所需颗粒尺寸的颗粒部分。

用于制备干燥血液制品的保护物质在所用量的范围内不能生理耐受，重构将涉及完全或部分去除保护物质。为此，产品可溶于重构溶液中，然后离心一次或更多次，回收细胞沉淀并进一步用重构溶液稀释。

可替换地，溶解产品可以过滤，残留物，即细胞被回收并在必要时进一步用重构液稀释。另一个可替换的步骤中，溶解的产物可使用允许保护物质通过的膜进行透析。

因此从另一方面看，本发明提供了一种输血液体的生产方法，所述方法包括，将根据本发明干燥的颗粒血液制品分散到生理耐受的无菌的水溶液中，并且如果必要，处理得到的分散体以减少其中的保护物质的含量。

从另一方面看，本发明提供了一种试剂盒，包括含有根据本发明的干燥血液制品的第一种容器，以及含有无菌的可生理耐受的重构溶液的第二种容器。

当要求输血液体中含有超过一种类型的血液组成时，例如红细胞、血小板和血浆蛋白，可以联合使用单独分离生产的干燥的血液制品。可以在重构之前和之后进行联合使用。当所用的保护物质不一定要除去时，或者除去时不会分离不同的血液产品时，在重构前混合是可行的。因此例如，当保护物质具有低的分子量，例如低于500D，可以使用离心或透析。为此可使用常规的血细胞的处理机(blood cell processor)。

本发明的方法尤其适用于这种联用输血液体的生产。因此原始血液样品的离心可以以系列的阶段进行，每一个相连的阶段使用更高的离心力分离出分子量逐次降低的血液成分。例如要收集血浆蛋白，可以用能导致红细胞破裂的离心力，因为此阶段的样品将不含有细胞。

因此尽管本发明主要针对于干燥的、包含无核细胞的颗粒制品的生产，如上所述，本发明也可用于制备包含其他血液成份的干燥颗粒，尤其是细胞碎片和其它细胞成分。本发明也可以用于制备包含除了血细胞外的其他哺乳动物细胞的干燥颗粒成分，例如骨髓细胞、胎儿细胞及胚细胞(特别是干细胞)等等。尤其优选地，产品包含间充质干细胞(MSC)，例如来源于成人骨髓，或来源于外周血的造血干细胞。MSC尤其有用，因为它们更少地受到受体的排斥。这些产品和其生产过程及用途也形成了本发明的几个方面。

使用本发明的方法有可能制备出干燥的含细胞的产品，其从体内采集后超过4个月甚至最多10年后仍然保持细胞活力。

除了延长保存期以外，本发明的干燥制品的其他的优势是所需储存空间小于全血。因此，能够比全血更易大量储存或输送到血量需求增加的地区。

现在参考以下非限制性实施例进一步地说明。

实施例1

大分子保护物质地制备

将冷冻的红细胞浓缩液在液氮中进一步冷却，温热至-25℃，然后搓碎(grate)。将所得到的颗粒过筛，使颗粒大小为0.5到2mm。颗粒在-30℃真空冷冻干燥得到干粉。这些粉末温热到20℃并保存。

进一步，类似地，使用流化床在-20℃干燥来制备粉末；并且通过使用两种干燥技术，此时省略了液氮处理。

实施例2

干燥的含有红细胞的产品的制备

在2℃，将红细胞的浓缩液(是通过离心加过柠檬酸盐的血液制备的)滴入到实施例1的粉末上。然后，将所得到的已浸渍的粉末在流化床干燥机上在4℃干燥超过6小时，至湿度为大约8％ wt。

实施例3

干燥的含有红细胞的产品的重构

将100μl的磷酸盐缓冲液加入到大约4μl干燥的包含红细胞的产品中，产品如实施例2中描述并且所含颗粒的大小为0.01到5mm。将产品真空包装并可以在采血后在周围环境中储存超过120天。在大约5分钟后，光镜下观察(Reichert，Austria)，重构的悬液中可见包含细胞。

实施例4

不含血红蛋白的保护物质的制备

浓缩的红细胞用注射水稀释以使细胞裂解。如果需要可以使用双极电场(例如，电压梯度超过1000V/cm)进行细胞电泳。将稀释混合物离心或超离心，并将血红蛋白以下的大结构/大分子部分分离出来。将分离出的级分再次用注射水稀释并离心。重复此过程直到分离出的部分不再含有血红蛋白的红色，或者具有强度大大减弱的颜色。然后，如实施例1所述，将分离出的部分冷冻固化、研磨成粉、过筛并干燥。得到的粉末然后可以用于实施例2和3。

Claims (13)

1.一种制备干燥的颗粒状血液制品的方法，所述的颗粒含有置于保护物质中的无核血细胞。所述方法包括：

从哺乳动物对象获取血样；

在所述样品中加入抗凝剂；

浓缩所述样品中的细胞；

从所述样品中回收含有无核血细胞的浓缩液；

用所述浓缩液浸渍包含大分子保护物质的颗粒；

在-20至+120℃温度范围内干燥已浸渍的颗粒；及任选地，

用密闭容器包装干燥颗粒。

2.权利要求1的方法，其中所述血样来源于人对象。

3.前述权利要求中任一项的方法，其中所述大分子保护物质包含分子量大于2000D的水溶性大分子物质。

4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述大分子保护物质包含的大分子是天然存在于提供血液的物种的血液中。

5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述大分子保护物质的血红蛋白含量小于红细胞中血红蛋白的1％wt。

6.前述权利要求中任一项的方法，其中干燥步骤在1℃和10℃之间的温度下进行。

7.前述权利要求中任一项的方法，其中干燥步骤涉及流化床干燥。

8.一种干燥的颗粒状血液制品，其中所述的颗粒含有置于大分子保护物质中的无核血细胞。

9.一种干燥的可重构的生物制品，包含置于大分子保护物质中的有核的真核细胞。

10.一种干燥的可重构的生物制品的制备方法，所述的方法包括：用包含细胞核的真核细胞的液体浸渍颗粒状的大分子保护物质并干燥已浸渍的颗粒。

11.一种生产输血液体的方法，所述的方法包括，将根据权利要求8或9的干燥的颗粒状血液制品分散在生理耐受的无菌水溶液中，并任选地处理所得到的分散体以降低其中保护物质的含量。

12.一种试剂盒，包括：包含权利要求8或9的干燥的颗粒状血液制品的第一种容器，以及包含无菌的生理耐受的可重构含水溶液的第二种容器。

13.权利要求12的试剂盒，其中所述的第一种容器放置在第二种容器中，并且第一种容器是能开的，从而能将其内容物释放到所述溶液中。