3 209 9743,209,974
Vynález sa týká spCeobu přípravy kyseliny digalakturonovej enzýmovou hydrolýzou.The present invention relates to a process for the preparation of digalacturonic acid by enzymatic hydrolysis.
Kyselina digfllakturonová sa doteraz priemyselne nevyrábe. Bola připravená v niekol’-kých laboratóriách cestou chemickéj hydrolýzy (Hatanaka C., Ozawa J. J. Agr. Chem. Soc.Japan Vol. 40 str. 96,0.966); Rexová-Benková L.,Chem. Zvěsti 24 CL970) str. 59; van Honden-hoven F., Wittp D., Vieeer J. Carbohyd. Res. str. 233 (1974)). Všetky poísané postupy súviacstupňové a značné sa odlišujú heterogenitou získaného produktu. Spoločným rysom týchtopostupov je, že vedú k malým výťažkom kyseliny digalakturonovej popři vysokom výtažku vyš-ších oligogalakturonových kyselin. Získanie kyseliny digalakturonovej v čistom stave zozmeei oligogalakturonových kyselin má mnohé nevýhody ako je pracnost, časová náročnost aviacstupňové izolácie,.Digflacturonic acid has not been industrially produced yet. It has been prepared in several laboratories by chemical hydrolysis (Hatanaka C., Ozawa J. J. Agr. Chem. Soc. Japan Vol. 40 pp. 96,0.966); Rex-Benková L., Chem. Rumors 24 CL970) p. 59; van Honden-hoven F., Wittp D, and Vieeer J. Carbohyd. Res. p. 233 (1974)). All of the procedures described are gradual and considerable differing in the heterogeneity of the product obtained. A common feature of these processes is that they result in low yields of digalacturonic acid in addition to high yields of higher oligogalacturonic acids. The recovery of digalacturonic acid in the pure oligogalacturonic acid composition has many disadvantages, such as labor, time-consuming and high-grade isolation.
Tieto nedostatky odstraňuje spfisob výroby kyseliny digalakturonovej enzýmovou hydro-lýzou, ktorého podstata spočívá v tom, že sa na zmes oligogalakturonových kyselin pfisobíenzýmom endo-D-galakturonanázou pri teplote 30 až 40 °C a pH 4,2 až 5, pričom kyselina di-galakturonová sa oddělí chroraatograficky na koloně a efluent sa odpaří alebo vysuší mrazo-vou sublimáciou. Výhodou tohto postupu je, že endo-D-galakturonáza sa nemusí izolovat v čistom stave.Na enzýmovú hydrolýzu sa mfiže použit endo-D-galakturonanáza z komerČných preparátov pekto-lytických enzýmov (Pectinase, Rohament, Pectinex, Ultra, Pekticín, Leozym a i.) bežne po-užívaných v konzervárskom priemysle. Jedinou požiadavkou na použitý enzýmový preparát jenízký obsah exo-D-galakturonanázy. Ďalšou velkou přednostou uvedeného spfisobu je, že hydrolýza prebieha formou jednostupňovej reakcie a pře priebeh reakcie nie je potřebný 3alšísubstrát alebo koenzým.These drawbacks are remedied by the production of digalacturonic acid by enzymatic hydrolysis, which consists in a mixture of oligogalacturonic acids with bisphosphonate endo-D-galacturonanase at a temperature of 30 to 40 ° C and a pH of 4.2 to 5, wherein di-galacturonic acid they are separated by chromatography on a column and the effluent is evaporated or dried by freeze-drying. The advantage of this procedure is that endo-D-galacturonase does not need to be isolated in a pure state. Endo-D-galacturonanase from commercial preparations of cytolytic enzymes (Pectinase, Rohament, Pectinex, Ultra, Pecticin, Leozym, and others) can be used for enzyme hydrolysis. .) commonly used in the canning industry. The only requirement for the enzyme preparation used is the high exo-D-galacturonanase content. A further great advantage of the process is that the hydrolysis takes place in the form of a one-stage reaction and no further substrate or coenzyme is required for the reaction to proceed.
Kyselina digalakturónová je látka dfiležitá z hlediska teoretického štúdia enzýmova pektínových látok a pre charakterizáciu v priemysle používanýeh pektolytických enzýmov. Příklad 1 500 mg oligogalakturonových kyselin sa za miešania rozpustí v 70 ml octanového tlmi-vého roztoku (pH = 4,6) a 20 mg enzýmového preparátu (Leozym, endo-D-galakturonanáza)sa rozpustí v 30 ml octanového tlmivého roztoku. Po přefiltrovaní roztoku enzýmu sa obidvaroztoky spoje. Enzýmová hydrolýza prebieha pri 40 °C za miešania alebo trepania 10 až 12hodin. Enzýmom katalyzovaná reakcia po kontrole chromatografiou sa ukončí 20 minútovýmvarom. Po ochladení sa roztok přefiltruje a zahustí vákuovým odpařováním při 40 °C. 2,5 ml zahuštěného hydrolyzátu sa nanesie na stípec molekulového šita (Sephadex G-10)a efluent s kyselinou digalakturonovou sa odpaří, alebo vysuší mrazovou sublimáciou. Výťažok kyseliny digalakturonovej je až 80 %. Příklad 2Digalacturonic acid is a substance that is relevant to the theoretical study of enzyme pectin substances and pectolytic enzymes used for characterization in industry. Example 1 500 mg of oligogalacturonic acids are dissolved in 70 ml of acetate buffer (pH = 4.6) with stirring and 20 mg of enzyme preparation (Leozyme, endo-D-galacturonanase) is dissolved in 30 ml of acetate buffer. After filtration of the enzyme solution, the solutions of the joint are mixed. Enzyme hydrolysis takes place at 40 ° C with agitation or shaking for 10 to 12 hours. The enzyme-catalyzed reaction after chromatography is terminated with a 20 min. After cooling, the solution is filtered and concentrated by vacuum evaporation at 40 ° C. 2.5 ml of the concentrated hydrolyzate are loaded onto a molecular suture column (Sephadex G-10) and the digalacturonic acid effluent is evaporated or freeze-dried. The yield of digalacturonic acid is up to 80%. Example 2
Postupovalo sa ako v přiklade 1 s tým rozdielom, že enzýmový preparát (8 mg Rohament)rozpustil v octanovom tlmivom roztoku o pH 4,8 a enzýmová hydrolýza prebiehala pri teplote30 °C počas 4 až 6 hodin. Výťažok kyseliny digalakturonovej bol až 70 %. V$ztíbbl vynálezu spočívá v použití kyseliny digalakturonovej na testovanie rfiznychThe procedure was as in Example 1 except that the enzyme preparation (8 mg Rohament) was dissolved in pH 4.8 acetate buffer and the enzyme hydrolysis was performed at 30 ° C for 4-6 hours. The yield of digalacturonic acid was up to 70%. It is an object of the present invention to use digalacturonic acid for the detection of enzymes