CS210222B1 - Spósob výroby kyseliny digalakturónovej enzýmovou hydrolýzou - Google Patents

Description

Vynález sa týká spĎeobu prípravy kyseliny digalakturónovej enzýmovou hydrolýzou.

Kyselina digalakturonová sa doteraz priemyeelne nevyrába. Bola připravené v niekol'kých laboratoriách cestou chemickéj hydrolýzy (Hátanaka C., Ozawa J. J. Agr. Chem. Soc. JapanVol. 40 str. 98 (1966); Rexová-Benková L., Chem. zvěsti 24 (1970), str. 59; van Hondenhoven F., Wittp. D., Viaser J. Carbohyd, Res. 34, str. 233 (1974)). Všetky popísané postupy aú viacstupňové a značné sa odlišujú heterogenitou získaného produktu. Spoločným rysom týchto postupov je, še vedú k malým výťažkom kyseliny digalakturónovej popři vysokom výtažku vyšších oligogalakturónových kyselin. Získanie kyseliny digalakturónovej v čistom stave zo zmesi oligogalakturónových kyselin má mnohé nevýhody ako je pracnost, časová náročnost a viacstupňové izolácie,

Tieto nedostatky odstraňuje spdsob výroby kyseliny digalakturónovej enzýmovou hydrolýzou, ktorého podstata spočívá v tom, že sa na kyaelinorozpustnú polygalakturónovú kyselinu pĎsobí enzýmom endo-D-galakturonanázou pri teplote 30 až 40 °C a pH 4,2 až 5, pričom kyselina digalakturonová sa oddělí chromatograficky na koloně a efluent sa odpaří alebo vysuší mrazovou sublimáciou.

Výhodou tohto postupu je, že endo-D-galakturonáza aa nemusí izolovat v čistom stave.

Na enzýmovú hydrolýzu sa mdže použit endo-D-galakturonanáza z komerčných preparátov pektolytických enzýmov (Pectinase, Rohament, Pectinex Ultra, Pekticín, Leozym a i.) bežne používaných v konzervárenskom priemysle. Jedinou požiadavkou na použitý enzýmový preparát je nízký obsah exo-D-galakturonanázy. fialšou velkou přednostou uvedeného apdsobu je, že hydrolýza prebieha formou jednoatupňovej reakcie a pře priebeh reakcie nie je potřebný eialší substrát alebo koenzým.

Kyselina digalakturonová je látka dfiležitá z hlediska teoretického štúdia enzýmov a pektínových látok a pre charakterizáciu v priemysle používaných pektolytických enzýmov.

Příklad 1

Pri príprave substrátu (kyselinorozpustnej polygalakturónovej kyseliny) pre hydrolýzu sa postupovalo podlá upraveného postupu Mc Creadi Seegmiller: Archiv of Biochim. and Biophys. 50, 440, 1954. 50 g pektínu sa za stálého miešania přidává do 2 1 IN kyseliny sírovej. Po rozpuštění sa suspenzia zahrieva pri 100 °0 60 minút. Suspenzia sa chladí a v kyselině nerozpustný podiel sa oddělí filtráciou. Supernatant sa zráža 2 litrami etylalkoholu a nechá stát 24 hodin. Vyzréžaná kyselinorozpustná polygalakturónové kyselina sa oddělí centrifugováním při 10 000 g. Supernatant sa zráža štyrmi litrami 96 % etylalkoholu a postup sa opakuje ako v prvom případe. Obidva podiely vyzrážanej kyselinorozpustnej polygalakturónovej kyseliny aa epoja, dvakrát premyjú 70 % etylalkoholom a nakoniec 1 krát acetonem. Preparát sa volné vysuší pri laboratórnej teplote alebo sa rozpustí v destilovanej vodě a vysuší mrazovou sublimáciou.

Příklad 2

500 mg kyselinorozpustnej polygalakturónovej kyseliny o priemernom polymerizačnom stupni 10, pripravenej podlá příkladu 1, aa postupné za miešania rozpustí v 70 ml octanového tlmivého roztoku (pH = 5). 10 mg enzýmového preparátu (Pektinase) sa rozpustí v 30 ml octanového tlmivého roztoku. Po přefiltrovaní roztoku enzýmu sa obidva roztoky spoja. Enzý mová hydroláza prebieha pri 40 °C za miešania alebo trepania 4 až 6 hodin. Priebeh enzýmovej hydrolýzy sa kontroluje chromatograficky. Ak v reakčnom médiu aú přítomné len kyselina digalakturónová a kyselina D-galaktopyranuronová reakcia sa ukončí 20 minútovým varom. Boz tok po ochladení sa přefiltruje a supernatant sa vysuší mrazovou sublimáciou. Potom sa na kolonu naplnenú molekulovým sitom (Sephadex G-10) dispergovaným vo vodě nanesie 180 mg lyo filizátu a efluent s kyselinou digalakturonovou sa odpaří, alebo vysuší mrazovou sublimáciou. Výťažok kyseliny digalakturonovej je až 90 %.

Příklad 3

Postupovalo sa ako v přiklade 2 s tým rozdielom, že sa enzýmový preparát (Pektofoeditín) rozpustil v acetonovom tlmivom roztoku o pH = 4,4 a enzýmová hydrolýza prebiehala pri teplote 30 °C počas 3 až 5 hodin. Výťažok kyseliny digalakturonovej bol až 70 %.

Příklad 4 * .

Kvalitativně stanovenie kyseliny digalakturonovej sa uskutočnilo chromatografiou na tenkých vrstvách silikagélu na platniach (Silufol) v systéme n-butanol-kyselina mravčia-voda (2:3:1) a detekciou anilínftalátom. Kyselina digalekturonová sa identifikovala na základe hodnoty log /Bf/ 1-Bf/, ktorá je lineárně závislá od stupňa polymerizácie oligogalakturónových kyselin. Ako referenčná vzorka sa použila kyselina D-galaktopyranuronová. Druhým kritériom čistoty bol poměr obsahu karboxylový ch skupin k obsahu redukujúcich skupin stanovených podía Bittera a spo. (Bitter T., Muir Η. M. Annal. Biochem. 41, 330, 1962)

Význam vynálezu spočívá v použití kyseliny digalakturonovej na testovanie rdznych enzymatických preparátov používaných v konzervárskom, kožiarskom a textilnom priemysle.

Claims (1)

1. PBEDMET VYNÁLEZU

   SpSsob výroby kyseliny digalakturonovej enzýmovou hydrolýzou vyznačujúci sa tým, že sa na kyselinorozpustnú polygalakturónovú kyselinu pdsobí enzýmom endo-D-galakturonanázou pri teplote 30 až 40 °C a pH 4,2 až 5, pričom kyselina digalekturonová sa oddělí chromatograficky na koloně a efluent sa odpaří alebo vysuší mrazovou sublimáciou.