CS211190B1 - Kmeň virusu Aujeszkyho choroby avirulentný pre ošipané a sposob jeho šťachtenia - Google Patents

Abstract

Získanie avirulentného kmeňa Aujeszkyho virusu neškodného pre ošipané každého veku, vyznaoujúceho sa velmi dobrými imuni-r začnými vlastnostami. Sposob vyšlachtenia kmeňa spočívá v sériovom pasážovaní vybraného kmeňa virusu Aujeszkyho choroby na kuřácích embryonálnych buňkách pri 37 °C s použitím medií definovaného zloženia a cielene volenej multíplicity infekcie, derivovaní čistých linií pomoeou plakovej techniky, následnom adaptovaní a pasážovaní. vybraných linií pri nízkých teplotách, ich adaptovaní a pomnožovaní na primárných kultúrach z fetálnych bovínnych obličiek v prvej subpasáži za definovaných podmienok infekcie a množenia a zabezpečení homogenity vírusovej populácie vybranej linie cestou plakovej purifikácíe s níekolkonásobným opakováním.

Description

Vynález sa týká kmeňa Aujeszkyho choroby /ďalej Au. ch./ avirulentného pre ošípané schopného priemyselnej multíplíkácie na buňkových kulturách pěstovaných in vitro pre přípravu žívej očkovacej látky., s.p$3£hu. jeh$ izQlác-le. a .p,Q,uňitÍA· pra. imunizáci.u ©šípaných.

Au. ch. sa stala v poslednom desaťroči jednou z najvýznamnéjšich nákaz ošípaných vírusovej povahy. Je tomu tak preto, že sa doposiaí nepodařilo vyporiadať sa s Au. ch, ani v jednom z dávnejšie zamořených štátov, ba naopak, objavujesa v státoch v ktorých bola donedávna neznámou a v niektorých štátoch so sporadickým výskytom došlo k posledných vokoch k jej epizootickému rozšíreniu /Herrick J. B: Highlights of the Pseudorabies Fact-Finding Conference, Vet.-Med. Smáli Anim. Clin. , 1 360-1 362 , 1 977, Torna B.., Goret P.: La maladie ďAujeszky en France, Can. Méd. Vét., 43, 225-236, 1974/. Zlyhanie uplatňovaných protinákazových opatřeni a vysoké hospodářské škody ktoré Au. ch. v podmienkach velkochovov zapříčiňuje, si vyziadali zavedenie špecifickej profylaxie.

Až donedávna neúspěšné výsledky všetkých pokusov o přípravu účin.nej inaktivovanej vakcíny /Wittman G.: Die Šchutzimpfuňg gegen Aujeszkysche Krenkheit /AK/ mít inaktivierten Vakzinen Dtsch. Tierárztl. Wschr. Š6, 316-322, 1979/ viědli k tomu, že sa hlavná pozornost zamerala na výskům a používanie živých vakcín. Živé vakcíny připravené z kmeňov atenuovaných na zvieratách /Toneva V.: Variabilitě du virus de la maladie d“Aujeszky. Vaccin contre la maladie d^-Aujeszky. Vaccin contre la maladie d^-Aujeszky obtenu de souche du virus Aujeszky atténué a l'aide de passages par der pigeons, Vet.-Med. Nauki, I. 35--42, 1964/ boli příliš virulentně a preto pre přípravu živých vakcín nevhodné. Ani živé vakcíny připravené z kmeňov atenuovaných sériovými pasážami na kuřácích zárodkoch /Bran L., Suhaci I., Ursache R.: Imminizing value of the egg-adapted pseudorabies virus strain Bucarest after a various number of chick embryo passages, Archiva Teter., 5., 75-81 , 1968, Bazylev P. Μ. , Prochorova Ε, M,: Suchaja virusvakcina protiv bolezni Aujeszki iz stamma GNKI, Veterinarija, č. 2, 44-45, 1970, nezodpovedali vedecky předloženým požiadavkám pre přípravu živých vakcín.

Moderně živé vakcíny majú představovat homológne populácie virusu napestovaného z geneticky stabilných klónov derivovaných z virusových kmeňov plakovou technikou. Bartha /Bartha A.: Experimental reduction of virulence of Aujeszkys disease virus, Mágy. Állatorv. Lap.,

16, 42-45, 1961/ odštiepil z virulentného kmeňa sériovo pasážovaného na prasačích obláčkových kulturách maloplakový klon ”K, ktorý slúži pre přípravu žívej vakcíny v mCr /Bartha A.ί Le vaccin hongroic contre la maladie d^-Aujeszky, Cah. Méd. Vét., 43, 338--340, 1974/.

Žuffa izoloval z kmeňa Bukurešt, sériovo pasážovaného na kultúrach kuřácích embryonálnych buniek štyri linie vykazujúce rozdielny stupeň reziduálnej virulencie pre laboratorně a hospodářské zvieratá. Línia s označením Buk-TK-300/9,2 slúži k príprave vakcíny NORVAK 1 /Žuffa A.: Imunizácia proti Aujeszkého chorobě - Xzolovanie klonu avirulentného pre králíky a morčatá a hodnotenie jeho imunogenity, Vet.-Med. /Praha/ 1 6, 525-538. 1971, Žuffa A.: Salaj J.: Imunizácia proti Aujeszkého chorobě. Imunogenita avirulentného klonu Buk-TK-900/6.K k príprave žívej vakcíny NORVAK 2 /Žuffa A.: Salaj I.: Imunizácia proti Aujeszkého chorobě imunogenita vysokoatenuovaného kmeňa Buk-TK-900/IV, a pre ošípané, Vet.-Med. /Praha/16, 221-223, 1971/, ktoré sa používajú k imunizácii kožušinových zvierat, oviec a hovádzieho dobytka.

Pre přípravu živých vakcín SUIVAK 1 a SUIVAK 2 určených pre očkovanie ošípaných slúžia linie Buk-TK-900/IV, a /Žuffa A., Salaj J.: Imunizácia potí Aujeszkého chorobě - imunogenita vysokoatenuovaného kmeňa Buk-TK-900/IV, a pře ošípané. Vet.-Med. /Praha/ 1 6 , 221-233, 1971/ resp. Buk-TK-200/3.PPM /Žuffa A.: Immunisierung gegen die Aujeszkysche Krankheít, I. Gewinnung des modifizierten Virus der Aujeszkyschen Krankheít, Arch. exp. vet.-Med., 17, 1 325-1 344, 1963/. Z kmeňa Bukurešt derivovali Skoda a kol. linie /Skoda R., Brauner I., Sádecký E.,

Maxer V.: Iramunization against Aujeszký s disease with live vaccine I. Attenuation of virus and some properties of attenuated strains. Acta virol., é[, 1-9, 1964/ na úrovni 336, a 621.

pasáže na kuřácích fibrob lastoch a použili ich k príprave pokusných živých vakcín: pre nežiaducí stupeň reziduálnej virulencie, ktorý si zachovali aj po překonaní 1 000 tkaninových pasa211190 ží /Jamrichová 0., Skoda R.: Multiplicatíon and dístributíon of attenuated pseudorabies virus in the organism of vaccinater pigs. Acta virol., 13, 42-51 , 19697se však pre komerčnú výrobu nepoužili.

Virusovú líniu avirulentnú pre hovádzí dobytok izolovali Svobodová a kol. /Svobodová J., Sabo A., BlaŠkovič D.: Immunogenicity of an attenuated pseudorabies virus in cattle, Acta virol., 1 4, 263, 1970/ z atenuovanébo kmeňa Buk-621 cestou dlhodobej perzistentnej infekcie kultúr z telacích obličiek, ktorého imunogenita sa kontrolovala len na králikoch a dobytku. Analogicky ako Žuffa pri selekcii linie Buk-TK-300/9,2 postupoval aj Torna /Torna B.: Study of a temperature sensitive strain of Aujeszky virus, Proč. 5th vorls 9.P.V.S. Congresa, Zagreb, 1978/ a z virusu dlhodobé pasážovaného na kultúrach kuřácích embryonálnych buniek izoloval termosenzitívny kmen Alfort, a použil ho pre přípravu žívej vakcíny. Konečne Tatarov /Tatarov G.: Apathogener Mutant des Aujeszky-Virus, induzieert von 5-Jodo-2-Deoxyuridin /JUDR7, Zbl. Vet.-Met., B, 1 5, 847-853, 1968/ izoloval avirulentnú mutantu MK z virusu pomnožovaného na kultúrach z kuřácích zárodkov selekciou plakov rezistentných proti 5~jodo-deoxyuridinu,

Pri štúdiu neškodnosti a imunizačnej účinnosti jednotlivých avirulentných a a-tenuovaných kmeňov virusu Au. ch. používaných pre přípravu živých vakcín sa zistilo, že sú medzi nimi významné rozdiely. Kmeň Buk-TK-900/IV, a je avirulentný pre všetky věkové kategorie ošípaných pri lubovolnom spósobe aplikácie, ale súčasne neschopný množit sa v organizme očkovaných zvierat a preto požadovanú imunitnú odpověď u ošípaných vyvolá len pri aplikácii velkej dávky virusu; přítomnost protilátok kolostrálneho povodu interferuje pri očkovaní cicajúcich prasiat a odstavciat s vývojom aktívnej imunity. Očkovanie prasnic stimuluje tvorbu protilátok len do nízkých až středných titrov, a preto obsah protilátok v kolóstre neposkytuje ciciakom spolahlivú ochranu proti ochoreniu /Žuffa A., Grunert Z.: Les· vaccins utilisés en Tchécoslovaquie contre la maladie ďAujeszky, Csh« Méd. Vét., 43, 334-337, 1974/. Interferující účinok koloetrálnych protilátok s vývojom aktívnej imunity si pri očkovaní prasiat týmto vírusom vyžaduje pre dosiahnutie spolahlivej ochrany dvojrázové očkovanie pričom druhé sa musí uskutečnit až po vylúčení materinských protilátok.

Kmeň K” je virulentný pre prasačie plody počas celého intrauterínneho vývoja /Sokol A., Gallo T.: Dístributíon of Bartha^-s vaccin strain of Aujeszkys disease virus in pig foetuses after intraperitoneal application, Folia microbiol., 16, 544, 1971/ a preto jeho použitie pre imunizovanie gravidných prasnic je spojené s určitým rizikom. Naviac iraunitná odp⁽oveď po jednorázovora očkovaní je nedostatočná, a preto sa vyžaduje dvojrázové očkovanie odstavčiat v intervale 3 až 4 týždňov a prasnic vždy v poslednom trimestri gravidity /Bartha A.:

Le vaccin hongrois contre la maladie d^-Aujeszky, Cah. Méd. Vét., 43, 338-340, 1974/.

Rovnako sa postupuje aj pri iraunizácii ošípaných pomocou živých vakcín připravených z kmeňov MK /Tatarov G., Boyadjiew St., Wesselinova A., Gergow P.: Untersuchung der Pathogenese der Aujeszkyschen Krankheit, Tagung zur ”Probleme und Prophylaxe der industriemassigen Schweineproduktion”, Vratze, Bulgarion, 14, 1975/ a termorezistentného kmeňa Alfort /Torna B., Brun A., Chappuis G., Terre J.: Propoiétés biologiques d”une souche thermosensible /Alfort· 26/ de virus de la maladia ďAujeszky, Res. Méd. Vét., 1555, 245-252, 1 979/. Kmene Buk-TK-200/3. PPM /Žuffa A.: Immunisierung gegen die Aujeszkyschen Krankheit. I. Gewinnung des modifizierten Virus der Aujeszkyschen Krankheit, Arch. exp. Vet.-Med., 17, 1 325-1 344, 1963/ a Buk-621 /Skoda R., Brauner I., Sádecký E., Mayer V.: Immunization against Aujeszky’s disease with live vaccine I. Attenuation of virus and some properties of attenuated strains, Acta virol., 8, 1-9, 1964/ sú imunogénne pre ošípané aj pri aplikácii malých dávok, ale po injekčnom podaní sa ranožia nielen v tkanivách miesta vpichu a přilehlých lymfatických uzlinách ale prenikajú příležitostné aj do krvi, ústredného nervstva, mandlí a sliznic horných dýchacích ciest, čo je spojené s nebezpečím vyluČovania virusu sekretami do vonkajšieho prostrediá a přenosu na spoluustajnené vnímavé ošípané./Žuffa A.:. Immunisierung gegen die Aujeszkysche Krankheit. I. Gewinnung des modifizierten Virus der Aujeszkyschen Krankheit, Arch. exp. Vet.-Med., 1 7, 325-1 344, 1963/. Pre nedostatočný stupeň atenuovania virulencie sú tieto kmene z epizootologického hladiska pre přípravu živých vakcín proti Au. ch. nevhodné.

Napriek tomu, že v posledných rokoch boli vyvinuté účinné inaktivované vakcíny proti

Au. ch. /Wíttmann G.: Die Schutzimpfung gegen Aujeszkysche Krankheit /AK/ mit inaktivierten

Vakzinen, Dtsch. tierarztl. Wschr., 86 , 316-322, 1979/ ostává imunoproxylaxia tejto nákazy v oblastiach s enzootickým připadne epizootickým výskytom metodou volby použitím živých vakcín /Žuffa A., Salaj J.: Resistence of pigs Immunized with live or inactivated Aujeszkys disease vaccines against experimental infection, IPVS Congress, Copenhagen, Denmark, 1980. In Pres7.

Aj keď sa inaktívovaným vakcínam prípísujú očité epizooto1ogické přednosti, nie sú efektívnejšie ani pri zničovaní hospodářských strát, ani pri eliminovaní virulentného virusu zo zamořených chovov /Skoda R.: The control of Aujeszky^-s disease in Karge swine units by use of attenuated live vaccines, IPVS Congres, Ames Iowa, USA, 1976, G6/.

Prihlíadajúc k technickej náročnosti, nákladom spojeným s očkováním ale aj vývojom lokálnych a celkových reakcii spojených s používáním ínaktivovaných vakcín /Wittnamnn G.:

Die Schutzimpfung gegen Aujeszkysche Krankheit /&.YJ mit inaktivierten Vakzinen, Dtsch. tierárztl. Wschr., 8 6, 3 1 6-322 , 1 979/ je pri endemickom zamoření chovov oš.ípaných Aujeszkyho vírusom výhodnejšie robit imunoprofylaxiu pomocou neškodných účinných živých vakcín.

Uvedené nedostatky spojené s kvalitou živých očkovacích látok proti Au. ch. sú riešené podlá vynálezu, ktorého podstata spočívá vo vyšlachtení avirulentného ímunogénneho virusového klonu cestou dlhodobého pasážovania kmeňa BukureŠť na primárných kulturách z kuřácích zárodkov pri teplote 36 °C až 38 °C - 150 až 250 sériových pasáží následnej selekcii linie, metodou hráničných riedení alebo plakovou technikou so šesťnásobným opakováním, ktorá sa ďalej pasážuje na rovnakom druhu tkaniva pri postupnom znižovaní kultivačnej teploty o 1 °C na hodnotu 30 °C až 33 °C a pri tejto teplote pasážuje 20 až AOkrát, adaptovaní získaného virusu na rast na fetalne bovínne oblickové kultury a selekcii virusového klonu plakovou technikou na kuřácích embryonálnych buňkách so šesťnásobným opakováním.

Vyšlachtení vakcinačný kmen vykazuje výhodné rastové vlastnosti na bukových kulturách připravených známým sposobom z kuřácích zárodkov alebo kačacích zárodkov, s obsahom 10? až 10 ΤΚΙΟ^θ vírusu/ml v infekčných tekutinách z uvedených tkaniv. Je neškodný pre ošípané každého veku pri parenterálnej, i. nas. alebo inhalačnej aplikácii, nepoškodzujú vyvíjajúce sa plody pri očkovaní prasnic v lubovolnom stádiu gravidity, vyvolává imunitnú odpověď u cicajúcich prasiat aj za přítomnosti nízkých a středných titrov materinských protilátok, vyvolává vysoký stupeň ochrany proti ochoreniu pri prirodzenej a experimentálněj infekcií po jednorázovej aplikacii aj poměrně malej dávky virusu, a očkováním prasnic v zamořených chovoch vyvolá spolahlivú ochranu cicajúcich prasiat proti klinickému ochoreniu protilátkami přijatými kolostrom; po parenterálnej aplikácii sa virus z očkovaných ošípaných nevylučuje a nešíri kontaktom na spoluustájnené vnímavé ošípané.

Imunobiologické vlastnosti vyšlachteného kmeňa dovolujú připravit 2 něho živú vakcínu, aplikáciou ktorej sa dosiahne v endemicky zamořených chovoch ochrana celej populácie ošípaných proti klinickému ochoreniu za použitia najjednoduchšej imunizačnej schémy aká sa doposial pri imunoprofy1axii Au. ch. použila.

Kmeň Buk-TK/650 uložený v zbierke mikroorganizmov na Výskumnom ústave veterinárněho lekárstva v Brně Medlánkach, Hudcova 60 pod číslom CAMP V-265 bol izolovaný sposobom podlá vynálezu z virulentného kmeňa Bukurešt zo zbierky Pasteurovho ústavu v Bukurešti, kde sa nachádza pod označením Bucarest /Bran L., Suthaci I., Ursache R. : Immunizing value of the egg-adapted pseudorabies virus strain Bucarest after a varicus number of chick embryo passages, Archiva Teter., _5, 75-81, 1968/ tak, že sa tento prepasážoval 200krát na primárných kultúrach z kuřácích zárodkov. Virus v 200. tkanivovej pasáži bol postupným zničováním kultivačnej. teploty a tým selekciou virusových Častíc s dobrými multiplikačnými vlastnosťami pri nízkých teplotách, adaptovaný na rast pri teplote 30 až 33 °C s výhodou pri 32 °C. V tejto fáze selekčného procesu sa na úrovni 30. sériovej pasáže pri 32 °C metodou hraničných riešení so šesťnásobným opakováním na skúmavkových kulturách z kuřácích embryí prostých Specificky paLogénnych zárodkov /SPF/ izolovala línía, ktorá bola testovaná na . štvortýžďnových prasatách prostých protilatok proti Aujeszkého virusu so zřetelem na rezíduálny stupen virulencie a ímunogénne schopností.

Reziduálna virulencia tejto linie bola cfalej atenuovaná pasážovaním na buňkových kulturách z fetalnych obličiek. Postupovalo sa přitom následovně: Skúmavkové kultury fetálnych bovínnych obličiek v prvej subpasáži sa infikovali za 24 hod. od naloženia, t. j. před vytvořením súvislého monolayera po zliatí rastového média dávkou 0,2 ml neriedeného virusu, virus nechal adsorbovat 1 bod. pri 37 °C a kultury zaliali 1 ml Earlovho média s 2 % fétalneho bovínneho séra. Infikované kultury sa inkubovali pri 37 °C počas 3 až 4 dní v období takmer úplného vírusšpecifického rozpadu tkaniva. Rovnako sa postupovalo aj pri dalších pasážach virusu na. fetálnych bovínnych obličkových kulturách s inkubovaním počas 3 až 5 dní, pričom vývoj cytopatických zmien postupné klesal až v 5. priamej pasáži na uvedenom druhu tkaniva sa přítomnost vírusovej infekcíe prejavovala len nevýrazným poškodením tkaniva charakterizovaným okruhlobunečnou degeneráciou ojedinělých buniek. V tomto stádiu sa virus pomnožil na kulturách kuřácích embryonálnych buniek, na ktorých vyvolal úplnú lýzu tkaniva s vysokým obsahom infekČného virusu v tkaninových tekutinách.

Takto pomnožený virus sa použil pre pasážovanie na kulturách z bovínnych fetálnych obličiek, pričom sa postupovalo rovnakým sposobom. Virus z 5. priamej pasáže sa opat podnožil na kultúrach z kuřácích zárodkov, a dalej pasážoval výhradně na fetálnych bovínnych obličkových kulturách. Podraienkou rastu virusu na uvedenom druhu tkaniva s vývojom výrazných cytopatických zmien bolo infikovanie kultur v subpasáži po 24 hod. rastu před vytvořením súvislého monolayera. Takýmto postupom překonal šlachtený kmen 10 priamych pasáží na fetálnych bovínnych obličkových kultúrach. Z tohoto virusu bol na kuřácích embrionálnych buňkách selektovaný plakovou technikou so šesčnásobným opakováním klon predstavujúcí homolognu vírusovú populáciu. Homogenita vírusovej populácie sa potvrdila zachováním nezmenenej virulencie pre vnímavé cicajúce prasata po desačnásobnom prepasážovaní na králíkoch. Takto získaný virusový klon vykazuje dobré rastové vlastnosti na kultúrach připravených z kuřácích a kačacích zárodkov.

Uvedeným postupom sa získal kmen, s označením CAMP V-265 Buk-TK/650 ktorý má vlastnosti virusu vhodného pre pripravu žívej vakcíny proti Au. ch., nakolko sa vyznačuje stratou virulencie pre ošípané každého veku pri parenterálnej, i. nas. a inhalačnej aplikácii, po parenterálnom podaní sa nedokazuje v krvi, tkanivách ústredného nervového systému, mandliacb ani slizniciach horných dýchacích ciest, nevylučuje sa sekrétami ani exkrétami do vonkajšieho prostredia a neprenáša kontaktom na spoluustágnené vnímavé ošípané. Pri splnění všetkých požiadaviek na neškodnost je vyšlachtený kmenň vhodný pre výrobu žívej vakcíny proti Au. ch. pre ošípané najmá v tom, že vyvolá iraunitnú odpoved aj prí aplikácii malej dávky virusu /10 ΤΚΙϋ^θ a viac/, vyvolá ochranu proti klinickému ochoreniu prí prirodzenej aj experimentálnej infekcíí aj po jednorázovom podaní, ochrana navodená jednorázovým očkováním trvá najmenej jeden rok, dvojřázové ockovanie Vírusom v dávke 10^ TKXD^q a viac vyvolá tvorbu protilátek v středných az vysokých titroch s vývojora klinickej aj parciálnej bíologickej imunity, očkovanie prasnic jedenkrát ročně poskytuje cicajúcim prasatám cestou kolostra taký stupeň pasívnej imunity, ktorá ich chrání proti ochoreniu až do 10. týzdňa veku, vyvolá pozitivnú imunitnú reakciu aj u prasiat s nízkými až střednými titrami materinských protilátok.

Používáním žívej vakcíny pripravenej z vyšlechtěného kmeňa uvedených imunobiologických vlastností sa dosiahne ochrana celej populácie ošípaných proti Au. ch. pri aplikovaní najjednoducbšej imunizačnej schémy aká sa pri imunoprofylaxii tejto nákazy doposial použila; imuni“ začný postup spočívá pri výkrmových ošípaných v jednorázovom očkovaní odstavčiat pri ich naskladňovaní do výkrmní, pri chovných ošípaných v jednorázovom očkovaní prasničíek a kancov vo veku 10 až 12 týždňov a preočkovaní před připuštěním a jednorázovom očkovaní ročně produkČných kancov a prasnic bez ohladu na štádium gravidity. Pri porovnaní žívej vakcíny z vyšlachteného kmeňa Buk-TK/650 s ostatnými živými vakcínami domácej aj zahraníčnej proveniencíe sa táto ukázala ako najlepšia čo do neškodnosti, ímunogenity, chránenosti očkovaných ošípaných a jednoduchosti imunizačnej schémy.

Novovyšlachtený kmen podlá vynálezu Buk^TK/650 je rozlišitelný od východiskového virulentného kmena Rucarest podlá rastových vlastností a charakteru cytopatických zmien zisto’· váných na bukových kulturách, žvieratách a irouno&iologických vlastností zisřovaných na zvieratách.

Podlá rastových vlastností na bukových kulturách sa novovyselektovaný kmeň odlisuje od východiskového virulentného kmeňa rýchlejším množením a vyšším výčažkom virusu pri pěstovaní na kulturách z kuřácích zárodkov, okrúhlobunečnou degeneráciou ako aj nižšími infekčnými titrami a nižšou akurauláciou fluoreskujúcich antigénov na kultúrach z prasačích obličiek alebo bunkovej linií PK, lokalizáciou fluoreskujúcich antigénov takmer výlučné v cytoplazme buniek stabilnej linie TL-72. Xntranázálna aplikácia východiskového virulentného kmeňa vnímavým odstavčatám vyvolá intenzívně množenie virusu na slizniciach horných dýchadiel s obsahom až 10^ TKID /ml, virus přetrvává na slizniciach orofaryngu do 14. až 21. dna, pravidelné preniká do ústredného nervstva a vyvolá klinické ochoreníe charakterizované horúčnatým stavom, zápalom dýchacích orgánov a porúch CNS, s uhynutím okolo 50 Z infikovaných pr asia t.

Vyselektovaný vyšlachtený kmeň sa na slizniciach horných dýchacích ciest po i. nas. aplikácii nemnoží a dokazuje len do 24. hod. a zdravotný stav zvierat ostane celkom neporušený. Zvíeratá infikované virulentným východiskovým kmeňom vytvoria v krvnom sere neutralizačně protilátky v titroch 1:64 až 1:1024, kým zvíeratá ošetřené vyšlachteným kmeňom len v titroch 1:1 až 1:16. Aplikácia východiskového aj vyšlechtěného kmeňa králikom vyvolá ich uhynutie, pri čom však v prvom případe je domínujúcím príznakom ochorenia intenzívny pruritus, kým hynutíe králikov ošetřených vyšlachteným kmenom je bez príznakov svrbenia.

Příklad prevedenia

Virulentný kmeň virusu Au. ch. Bukurešř sa séríovo pasážuje na primárných kultúrach z kuracich zárodkov s použitím bežne zauživaných laboratórnych metod. Přítomnost virusu v tkaninových tekutinách sa na rozličnej úrovni pasážovania kontroluje vývojom vírusšpecifických cytopatických zmien. Postup atenuovania virulencie kmeňa sa kontroluje aplikáciou 0,5 ml log.jQ riedení virusu i. cer, a 2 až 4 ml neriedeného virusu i. nas. š tvor týždňovým prasatům, zistovaním obsahu virusu v nosných sekrétoch, vývoja lokálnych zmien, termických a celkových klinických reakcií. Po dosiahnutí takého stupňa oslabenia virulencie pasážovaného kmeňa, pri 4 6 ktorom nevyvolá i. cer. aplikácia 10 ΤΚΙϋ.^θ virusu a in. nas. aplikácia 10 ΤΚΙϋ^θ virusu klinicky pozorovatelné narušenie zdravotného stavu ošetřených prasiat, s raaxiraálnym zvýšením telesnej teploty o 1 °C v období do 14 dní od podania, sa virus purifikuje metodou hraničných riedení alebo plakovou technikou a adaptuje sa rast pri subnormálnych teplotách.

Postupuje se přitom tak, že infikované kultúry sa inkubujú najskor pri 35 °C a v pasážovaní virusu na skúmavkových kultúrach sa pokračuje dotial, kým nástup a vývoj cytopatických zmien až do úplného rozpadu tkaniva neprebehne najneskor do 72. až 96. hod. inkubácie. Potom * sa znižuje teplota, pri ktorej sa infikované skúmavkové kultúry inkubujú vždy o 1 °C podlá rovnakých kritérií ako bolo uvedené vyššie. Následné sa robia priame pasáže pri 32 °C a reziduálna virulencía virusu testuje na 2 až 4 týždňových prasatách. Aplikuje sa im 1 ml neriedenej infekčnej tkanivovej tekutiny do predkolennej ríasy a kontroluje přítomnost virusu na slizriiciach nosa a trachy, mandliach a CNS vyšetřováním vždy aspoň dvoch prasiat na 3., 5. a 7. deň od očkovania. Pasážovanie virusu prí 32 °C sa ukončí, keď sa izolačnými pokusami na buňkových kulturách alebo na králikoch dokáže že uvedené tkaniva sú prosté infekcného virusu.

Tento virus sa séríovo pasážuje na skúmavkových kultúrach fetálnych bovínnych obličiek, pričom sa v období v ktorom sa na kultúrach manifestuje prítomnosč infekcie len morfologickýrai změnami .ojedinělých buniek, pomnoží virus na kuřácích embrycionálnych kultúrach, a v pasažování virusu na bovínnych obličkových buňkách sa rovnakým spósobom pokračuje. Po adaptovaní virusu natento druh tkaniva sa urobí 10 až 20 priamych sériových pasáží. Podmienkou úspěchu je, aby sa k pasášovaniu virusu použili fetálne bovínne obličkové kultúry v subpasáži po hod. rastu před vytvořením súvislého monolayera. Z virusu z 20. pasáže na bovínnych obličkových buňkách sa pomocou plakovej techniky so šesčnásobným opakováním izoluje na kuřácích embryonálnych buňkách línia, ktorá sa podrobí kontrolnym skúškam na identitu, stupeň atenuovania a imunogenity.

Identita virusu sa potvrdí: a. neutralízáciou infekčnosti Specifickým antisérora připraveným na králikoch imunizovaných niektorým zo zbierkových kmeňov Aujeszkyho virusu v inaktivovanom stave s obsahom oblejových adjuvans, b. pomocou iraunofluorescencie ofarbením kultur infikovaných vyšlachteným kmenom Specifickým konjugovaným AV-imunoglobulínem, c. dokazom rezistencie očkovaných prasiat proti i. nas. infekcii známým virulentným kmenom.

Stupeň atenuovania virulencie sa kontroluje na 2 až 4 týždňových vnímavých prasatách. Kontroluje sa přítomnost virusu u prasiat očkovaných dávkou okolo 10 ΤΚΙϋ^θ virusu na slizniciach nosa, mandliach, sliznici trachey a v CNS očkováním orgánových suspenzií na buňkové kultury a králíky.

Iraunogenita virusu sa kontroluje očkováním vnímavých odstavčiat log._n riedeniami v dávke 2 6 po 2 ml s obsahom 10 až 10 TKID virusu v inokuluj zvieratá sa vyšetrujú na obsah protilátok a infikujú i. nas. virulentným vírusom. Infekciu musia prežič prasatá, pri ktorých obsahovalo inokulum 10 ΤΚΙΏ^θ virusu a viac, kým aspoň 75 % neočkovaných rovnakým sposobom infikovaných kontrolnych ošípaných musí uhynut. Dvojrázové ínjekČné podanie virusu v dávke 10⁵ ΤΚΙϋ^θ a viac musí vyvolat tvorbu protilátok v titroch 1:16až 1:128, s priemerným títrom najmenej 1:40.

Novovyšlachtený kmen podlá vynálezu Buk-TK/650 s dobrými rastovýrai vlastnosťami na kulturách z kuřácích s kačacích embryí je neškodný pre ošípané každého veku pri lubovolnej aplikácii, vyvolá ochranu proti ochoreniu po jednorázovej aplikácii v malej dávke trvajúcu aspoň jeden rok a tvorbu neutralizaČných protilátok v středných až vysokých titroch po dvojrázovom podaní v dávke 10 ΤΚΙϋ^θ a viac. Uvedené vlastnosti kmeňa podlá vynálezu dovolujú výrobu bezpečnej a účinnej žívej vakcíny proti Au. ch. použitím ktorej sa dósiahne spolahlivá klinická ochrana celej populácie ošípaných proti ochoreniu pri uplatněni najjednoduchšej imunízaČnej schémy, aká sa pri imunoprofylaxii Au. ch. u ošípaných doposial použila.

Claims (2)

1. PREDMET VYNÁLEZU

   1. Sposob šlachtenia kmeňa virusu Aujeszkyho choroby vyznačujúci sa tým, že kmen virusu

   Aujeszkyho choroby Bukurešt sa najprv 150 až 250 krát pasážuje na primárných kultúrach kuřácích zárodkov pri teplote 36 °'C až 38 °C, z virusu sa selektuje metodou hraničných riedení alebo plakovou technikou so šesťnásobným opakováním línia, ktorá sa ďalej pasážuje na ^{0 0} rovnakom druhu tkaniva pri postupném znižovaní kultivačnej teploty o 1 C na hodnotu 30 C až 33 °C a pri tejto teplote prepasážuje 20 až 40 krát, tento virus sa adaptuje na rast na fetálne bovínne obličkové kultúry a z něho selektuje na kuřácích embryonálnych buňkách plakovou technikou so šestnásobným opakováním hoihológna geneticky stabilná línia.
2. 2. Kmen virusu Aujeszkyho choroby avirulentný pre ošípané Buk-TK/650 CAMP V-265 so zvýšenou schopnosťou reprodukcie vlastnej vírusovej substancie na buňkových kultúrach, získaný sposobom podlá bodu 1.