CS219575B1 - Sposob přípravy chromogénneho substrátu na testovanie Ci zložky celulázovej aktivity - Google Patents

Abstract

Vynález rieši přípravu chromogénneho celulózového substrátu vhodného na testovanie celulázovej Ci aktivity. Podstata vynálezu spočívá v tom, že mikrokryštalická celulóza sa v alkalickom prostředí vyfarbí vhodným farbivom, po vyfarbení sa chemicky naviazané farbivo vymyje a vyfarbený substrát sa vysuší. Uvádzajú sa optimálně reakčné parametre viazania farbiva ako i účinný sposob vymývania nezreagovaného farbiva. Vynález má využitie vo -výskume pri stanovení celulázovej Ci aktivity a pri výrobě celulázových enzýmov.

Description

Vynález sa týká sposobu přípravy chromogénneho substrátu na testovanie Ci zložky celulázovej enzýmovej aktivity.

Stanovenie Ci zložky celulázovej aktivity sa doposiaT robí podlá zdlhavej gravimetrické j metody (Halliwell G.: Biochem. J. 79, 1985/1961), ktorá spočívá v tom, že reakčné médium obsahujúce C_x zložku celulázovej aktivity sa nechá za štandardných podmienok inkubovať s filtračným papierom dostatočne dlhý čas a potom sa filtračný papier vyperie od hydrolyzo,váných rozpustných produkte v, enzýmovej hydrolýzy, papier sa vysuší a zváží a z úbytku na váhe sa vypočítá enzýmová aktivita Ci celulázy přítomná v testovacom médiu alebo sa rozpuštěná celulóza stanoví vo filtráte oxidačně s dvojchromanom (Selby K., Maitland C.

C.: Biochem. J. 104, 716/1967).

Táto metoda je hlavně z časového hradiska velmi zdlhavá a pre sériové analýzy hlavně pri nízkých aktivitách sledovaného enzýmu nevhodná.

V posledných rokoch sa na polysacharidhydrolázové enzymové aktivity používá s úspechom chromogénny polysacharidový substrát, ktorý po enzýmovej hydrolýze produkuje farebný filtrát, intenzita ktorého je úměrná prítomnej enzýmovej aktivitě.

Na tomto principe sú známe zahraničně i čs. chromogenné substráty Phadebas Amylase Test, (Clinical and technical Information, Almquist, Wiksells Boktryckeri (1979),

A. O. č. 192 202, A. O. č. 192 210), ktoré sa úspěšně používajú najma v klinickej praxi pri stanovení aktivity alfa-amylázy v biologických tekutinách pre diagnostické účely.

DoposiaT známa příprava chromogenného substrátu pre celulázovú aktivitu připravovala sa zdíhavým a energeticky náročným postupem, tak že sa prášková hydrocelulóza připravená pomocou kyseliny fosforečnej vyfarbovala pri 50 °C s farbivom Remazol briliant blue za použitia 200 % síranu sodného na hmo-tnoisť hydrocelulózy pri pH 11 za použitia fosforečnanu sodného (A. O. Stamm: Helv. Chim. Acta 46, 3008 1963).

Takto připravený substrát je však vhodný hlavně pre C_x zložku celulázovej aktivity a nie prezložku Ci celulázovej aktivity.

Obdobný sposoh přípravy založený na farbení filtračného papiera Whatman 1 (Polncelot R. P., Day P. R.: Appl. Microbiol. 23, 5, 875/1972] je rovnako energeticky náročný, lebo pracuje až pri 100 °C.

Pri selekcii mikroorganizmov produkujúcich Cx zložku celulázovej aktivity je potřebné mať velmi presnú a rýchlu metodu na stanovenie Cj zložky celulázovej aktivity, aby bolo možné priedežne sledovat optimálně kultivačně podmienky resp. hodnotit spofahlivo vysokoprodukčné mutanty. V pre2 vádzke je to důležité pri riadení priemyslovej kultivácie pre maximálnu produkciu Ci celulázovej aktivity.

Preto sme vypracovali podmienky pre přípravu chromogénneho substrátu s požadovanými vlastnosťami vysokéj - citlivosti na Gj celulázovú aktivitu, čo je predmetom novej přihlášky vynálezu.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že mikrokryštalická celulóza z drevnej celulózy s výhodou z bavlny sa nechá v prvom stupni reagovat 30 minut pri teplote 15 až 30 °C v 5 až 7-násobnom hmotnostnom množstve vodného roztoku zloženia 0,7 až 1,5 % hmot. hydroxidu sodného a 5 až 10 % hmot. octanu sodného alebo síranu sodného za stálého miešania, načo v druhom stupni sa přidá 5 až 10 °/o hmot. farbiva s výhodou dvojsodnej soli kyseliny 8-amino-5-(-3/sulfoetylsulfonyl/anilino)-6-antrachinonsulfonovej a nechá sa pri teplote-15 až 30 °G reagovat 1 až 3 hodiny, a v treťom stupni sa chromogénna mikrokryštalická celulóza dokonale vymyje od -nezreagované-ho farbiva najprv vodou, potom postupné zriedeným etanolom až koncentrovaným etanolom alebo acetónom a vysuší volné na vzduchu alebo vákuovo pri 60 až 70 °C.

Najvhodnejším substrátom pre Ci celulázovú aktivitu je celulóza s maximálnym krystalickým podielom a preto je na tento účel najvhodnejšia mikrokryštalická celulóza připravená parciálnou kyslou heterogennou hydrolýzou bavlny. Představuje nájčistejšiu celulózu s minimálnymi podielmi extraktívnycli látok, popola a podielom amorfnej celulózy maximálně 10 až 15 %.

Můžu sa však použiť i mikrokryštalické celulózy připravené zo zušfachtených dřevných-buničím najlepšie s- minímálnyrú obsahom ligninu (nie vyšším ako 0,1%). Optimálny polymeračný stupeň použitých mikrokryštalických celulóz je 150 až 250. Polymeračný stupeň pod 100 nie je vhodný pre horšiu filtrácíu pri enzýmovej analýze i vlastnej přípravě farebného substrátu.

Optimálně množstvo farbiva aplikované do reakcie je okolo 10 % na hmotnost suchej mikrokryštalickej celulózy. Pri nižších množstvách je substrát nedostatečné citlivý při enzýmovej reakcii a pri vyšších množstvách sa substrát zle filtruje a premýva a tiež klesá kryštalický podiel celulózy, takže je dobrým substrátom i pre zložky C_s celulázu.

Očinnosť reakcie viazania farbiva na mikrokryštalickú celulózu je 50 až 70 % a reakcia prebieha dostatočne rýchlo pri laboratórnej teplote, pri ktorej nedochádza ku degraůácii celulózovej substancie v alkalickém prostředí.

Ako elektrolyt zvyšujúci účinnost viazania

219 575 farbiva na celulózu je výhodné používat octan sodný, ktorý sa lepšie vymývá z produktu ako síran sodný, najma ked sa premýva koncentračným gradientom etanolu resp. acetonu.

Výhodou postupu podl'a vynálezu je, že: umožňuje prvýkrát připravit chromogénny substrát vhodný pre sériové meranie enzýmovej aktivity zložky Ci celulázy spek. trofotometrickou metodou, spósob přípravy chromogenného substrátu je technologicky a energeticky nenáročný, chromogénny substrát je stabilný a móže sa skladovat neobmedzený čas v suchom stave, na jedno stanovenie aktivity zložky Ci celulázy postačuje 50 až 100 mg chromogénneho substrátu, mikrokryštalickým chromogénnym substrátom možno stanovit i nízké zložky Ci celulázovej aktivity v pťiebehu do 2 hodin.

Příklad 1

100 g miikriQkryštalickej celulózy z bavlny sa nechá reagovat 30 minut při izbovej teplete v 500 ml vody, v ktorej sa predom rozpustilo 5 g hydroxidu sodného a 50 g octanu sodného. Potom sa po častiach do reakčnej zmesi přidává 10 g farbiva dvojsodnej soli kyseliny 8-amino-5-(-3/sulfoetylsulfonyl/anilin]-6-antrachinonsulfonovej tak, aby sa pridávanie ukončilo do 30 minut. Reakčná zmes sa mieša pri laboratórnej teplete po dobu 2 hodin, potom sa přidá 7 ml konc. kyseliny octovej a reakčná zmes sa odfiltruje a na filtri premýva najprv destilovanou vodou, potom postupné zmesou vody a etanolu so stúpajúcim koncentračným gradientom etanolu alebo acetonu tak dlho, až je filtrát bezfarebný. Premytý chromogénny substrát sa vysuší vol'ne na vzduchu alebo za vákua při teplete 60 až 70 °C. Výsledný produkt obsahuje 5 až 7 % viazaného farbiva a je dobrým substráton pre zložku celulázovej aktivity.

Příklad 2

Postup podlá příkladu 1 s tým rozdielom že sa do reakcie aplikuje 5 g farbiva.

Výsledný produkt obsahuje 3 až 3,5 % via zaného farbiva, t. j. takmer o polovici menej citlivý na rovnakú aktivitu Ci zložkj celulázy.

Příklad 3

Postup podlá příkladu 1 s tým rozdielom že ako pomocný elektrolyt sa použije 50 £ síranu sodného.

Výsledný produkt má podobný obsah via zaného farbiva ako v příklade 1.

Příklad 4

Postup podlá příkladu 1 s tým rozdielom že ako póvodná celulóza sa použije mikrokryštalická celulóza z bukovej sulfátové] celulózy zušlachtenej celulózy používané] pre viskózové vlákna.

Výsledný produkt obsahuje 5,5 % viazaného farbiva.

Příklad 5

Postup podlá příkladu 1 s tým rozdielom, že ako celulóza sa použije mikrokryštalická celulóza zo smrekovej zušlachtenej sulfitovej celulózy s pólymeračným stupňom 220, ktorá velmi dobré filtruje pri spracovaní.

Obah farbiva v hotovom substráte je 6 °/o.

Vynález má použitie pri sériových analýzách přesného a rýchleho stanovenia zložky celulázovej aktivity pri šlechtění mikroorganizmov produkujúcich Ci zložky celulázy a v priemyslovej kultivácii mikroorganizmov produkujúcich uvádzané enzýmy.

Claims (1)

1. Spósob přípravy chromogénneho substrátu na testoivanie C₂ zložky celulázovej aktivity význačný tým, že mikrokryštalická celulóza z drevnej celulózy s výhodou z bavlny sa v prvom stupni nechá reagovat 30 minut pri tep lote 15 až 30 °C v 5 až 7násobnom hmotnostnom množstve vodného roztoku zloženia 0,7 až 1,5 % hmot. hydroxidu sodného’ a 5 až 10 % hmot. octanu sodného alebo síranu sodného za stálého miešaníia, načo sa v druhom stupni přidá 5 až 10 % hmot. farbiva s výhodou dvojsodnej soli kyseliny 8-amino-5-(-3/sulfoetylsulíonyl/anilino) -6-ántrachinonsulfonovej na hmotnost mikrokryštaliekej celulózy a nechá sa pri teplota 15 až 30 °C reagovat po dobu 1 až 3 hodiny a v treťom stupni sa chromogénna mikrokryštalická celulóza dokonale vymyje od nezreagovaného farbiva najprv vodou, potom postupné zriedeným etanolom až koncentrovaným etanolom alebo acetónom a nakoniec sa premytý produkt volné vysuší na vzduchu alebo vakuové pri teplote 60 až 70 °C.