CS237101B1 - Sposob přípravy vodorozpustných chromolytických polysacharidových enzýmových substrátov - Google Patents

Abstract

Sposob přípravy vodorozpustných chromolytických polysacharidových enzýmových substrátov. Účelom vynálezu je příprava vodorozpustnýeih chromolytických polysacharidových substrátov vhodných na meranie enzýmových aktivit. Uvedeného účelu sa dosiahne tak, že nerozpustné polysacharidy sa najpr derivatizujú alkyláciou na vodorozpustné produkty, ktoré sa v druhom stupni vyfarbujú farbivom Remazol briliant blue R a po vyfarbení sa zbavia fyzikálně viazaného farbiva premývaním alebo extrakciou metanolom. Připravený chromolytický substrát s obsahom kovalentne viazaného farbiva 3 až 8 >% hmot. sa velmi dobře rozpúšfa vo vodě a tým može slúžiť ako vodorozpustný substrát pre meranie polysacharid-hydrolázových enzýmových aktivit. Vynález má využitie všade, kde je potřebné rňerať presne a rýchlo aktivitu polysacharid-hydrolázových enzýmov, či už pri medzioperačnej kontrole výroby enzýmov, alebo pri meraní enzýmovej aktivity pre diagnostické účely.

Description

Vynález sa týká sposobu přípravy vodorozpustných chromolytických polysacbaridových enzýmových substrátov, vhodných pre stanovenie příslušných polysacharid-hydrolázových enzýmových aktivit.

K velmi efektívnym a preto najviac v posledných rokoch rozšířeným spósobom stanovenia polysacharid-hydrolázových enzýmových aktivit je spósob fotokolorimetrický. Spočívá na tom, že sa enzým nechá reagovat s nerozpustným polysacharidovým gélom, na ktorom je kovalentne viazané vhodné farbivo. Počas hydrolýzy účinkom přítomných příslušných polysacharld-hydroláz prechádza farebný polysacharid postupné do roztoku, pričom intenzita zafarbenia roztoku je úměrná aktivitě enzymu.

Pochopitelné toto platí iba za předpokladu, že polysacharidový ohromolytický gél je dokonale přístupný molekule enzýmu a že koivalentne viazané farbivo na polysacharide nemá inhibičný účinok na samotnú enzýmovú reakciu [J. Kennedy: Advances in carbohydrate chemistry and biochemistry, 29, (1974) str. 350 až 357],

Reakcia viazania farbiva na polysacharide musí byť vedená tak, aby distribúcia molekúl farbiva bola homogenná na makromolekule polysacharidu, čo možno dosiabnuť správnou volbou reakčných podmienok pri vyfarbovaní polysacharidu.

Známe sú postupy, keď reakcia viazania farbiva najmá na rozpustný polysacharid sa robí v roztoku a po vyfarbení sa rozpustný polysacharid prevedie sieťovaním do nerozpustné] formy, resp. v niektorých prípadoch sa móže použit aj v rozpustnej formě. V takom případe sa polysacharid oddělí z reakčného roztoku dialýzou a vyzrážaním s organickým rozpúšťadlom [MSkinen Κ. K., Paunio I. K.: Anal. Biochem. 39, 202, (1971)]. Uvádzaný spósob sa použil pri vyfarbovaní „Blue Dextran 2000“, používaný ako farebný standard pre testovanie gélov pri gélovej permeačnej chromatografii.

Pre diagnostické účely je známy spósob stanovenia aktivity alfa amylázy v biologických tekutinách pomocou farbeného rozpustného amylopektínu pod názvom DYAMYL [Bábson S. R., Babson A. L.: Clinica Chimíca Acta 44, 193 (1973)]. Ako farbivo sa v tomto chromolytickom substráte používá farbivo Reacton Rot 2M-Geigy, s maximom absorbancie 546 nm.

Vo váčšine prípadov pre stanovenie enzýmových aktivit sa doposial' používali nerozpustné chromolyticlké substráty, sletované róznymi sietovacími reagentami a rózneho stupňa napúčania vo vodě.

Určitou obecnou nevýhodou takýchto substrátov bolo, že pre jednotlivé analýzy bolo potřebné použit značný prebytok substrátu, ktorý sa pohyboval v medziach 50 až 150 miligramov na jedno stanovenie. Pochopitelné, že ak sa použije substrát rozpustný je možné stanovit enzýmovú aktivitu příslušného' enzýmu i s použitím 5 mg rozpustného chromolytického substrátu, t. j. s množstvom substrátu minimálně lOkrát nižším. Táto skutočnosť je obzvlášť dóležitá pri stanovení takých enzýmov, ktořých substráty sú poměrně tažko dostupné, cenovo náročné alebo v prípadoch, kde v rutinnej diagnostické] praxi je potřebné prevádzať denne poměrně vysoký počet analýz enzýmovej alktivity.

Pri rozpustných polysacharidoch akými sú napr. glykogén, α-manan, pululan, pektová kyselina a iné, obyčajne nebývá problémom připravit vodorozpustný chromolytický substrát, nakolko správnou volbou stupňa substitúcie farbiva sa rozpustnost i zafarbeného polysacharidu zachová.

Zložitejšie to bývá ako ukázali naše výskumné práce u nerozpustných polysacharidov ako sú celulóza, škrob, lichenan, chitín, xylan, /3-manan a iné. Ani opakovanou substitúciou aplikovaného farbiva sa nepodaří obyčajne získat ohromolytický, dobré rozpustný polysacharid. Naviac pri vyššom stupni prefarbenia polysacharidu možno talkmer pravidelné pozorovat značný inhibičný účinok viazaného farbiva na enzýmovú hydrolýzu, ČO' by podstatnou mierou znižovalo citlivost enzýmovej reakcie.

Uvedené nedostatky přípravy rozpustných chromolytických polysacharidových substrátov vhodných na stanovenie polysacharid-hydrolázových aktivit rieši nová přihláška vynálezu na základe ktorej je možné z nerozpustného polysacharidu připravit rozpustný enzýmový substrát, ktorý splňa všetky podmienky pre meranie príslušnej enzýmovej aktivity.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že v prvom stupni sa nerozpustný polysacharid alkyluje v alkalickom prostředí s etylénoxidom a/alebo kyselinou monochlóroctovou, a/alebo propylénoxidom, a/alebo alkylhalogenidom s počtom uhlíkov 1 až 2 a/alebo β-ohloretylsulfonátom sodným na taký stupeň substitúcie, pri ktorom je už polysacharid vo vodě rozpustný, načo sa v druhom stupni na alkyl-polysacbarld naviaže remazolové farbivo Remazol briliant blue R (dvojsodná sol' kyseliny 8-amino-5[3-(sulfoetylsulf onyl) anilino ] 6-antrachlnonsulf onovej) v množstve 3 až 10 % hmotnostných na hmotnost polysacharidu pri teplote 15 až 25 °C a koncentrácii hydroxidu sodného 0,7 až 1,0 °/o hmotnostných po dobu 30 až 90 minút, a v treťom stupni sa alkylovaný chromolytický polysacharid vyzráža z roztoku alkoholom okyseleným kyselinou octovou na neutralizáciu volných alkálií v reakčnej zmesi a nakoniec sa vyfarbený polysacharid zbaví fyzikálně viazaného' farbiva premývaním, alebo extrakciou s metanolom.

iPokial sa týká výšky stupňa substitúcie, ktorý podmieňuje dobrú rozpustnost polysacharidu vo vodě, tá závisí od typu polysacharidu a od alkylačného reagentu. Tak napr. karboxymetylcelulóza sa stává roz237101 pustnou ivo vodě při stupni substitúcie 0,4, zatial' škrob je rozpustný už pri stupni substitúcie 0,2. Pri alkylácii polysacharidov s etylénoxidom na dosiahnutie rozpustnosti vo vodě je potřebné substituovat polysacharidy len na stupeň substitúcie 0,2 až 0,3, a pri alkylácii /3-chloretylsulfonátom sodným len na 0.1 až 0,2.

Alkylácia sa prevádza v přítomnosti hydroxidu sodného o koncentrácii 20 až 40 % hmot. pri teplotách 50 až 60 °C po dobu 2 až 4 hodin. Po potrebnej alkylácii sa reakčná zmes zriedi vodou tak, aby koncentrácia hydroxidu sodného dosahovala hodnotu 0,8 až 1,0 % hmot., pri ktorej koncentrácii sa přidává po častiach farbivo tak, aby dávkovanie farbiva sa ukončilo v priebehu 20 minút a po přidaní celkového množstva farbiva sa nechá reakčná zmes reagovat ešte 60 minút pri teplote 15 až 20 °C. Potom sa vyfarbený polysacharid vyzráža s okyseleným alkoholom. Množstvo kyseliny sa volí tak, aby postačila len na neutralizáciu volného hydroxidu sodného. Vyzrážaný chromolytický polysacharid sa potom vypiera, alebo extrahuje najlepšie metanolom, připadne zmesou .metanol-aceton až do kvantitativného odstránenia fyzikálně viazaného farbiva na polysacharid.

U polysacharidov, ktoré sú už rozpustné i bez alkylácie možno farbivo viazať priamo v alkalickom prostředí. Třeba však volit také množstvo farbiva, ktoré ešte neznižuje rozpustnost hotového produktu, čo je asi 3 až 10'% hmot. na hmotnost suchého polysacharidu.

Výhodou navrhovaného sposobu je predovšetkým skutečnost, že umožňuje aj z nerozpustných polysacharidov predchádzajúcou alkyláciou s nasledovným kovalentným viazaním farbiva na polysaoharid připravit vodorozpustné chromolytické substráty spíňajúce všetky kritériá enzýmových substrátov vhodných na meranie příslušných enzýmových aktivit. Ďalšie výhody sú v tom, že připravené substráty sú pre enzýmové reakcie citlivejšie ako substráty nerozpustné a preto na analýzu je potřebné lOkrát menej substrátu pri rovnakej citlivosti stanovenia. Podstatnou výhodou je možnost stanovenia aktivity v podstatné menšom objeme vzorky, ako v případe nerozpustných Sletovaných substrátov.

Dalšie výhody a přesnější popis nového sposobu sú evidentně v nasledovných príkladoch, ktoré nie sú vyčerpávajúce, ale len ilustrativně.

Příklad 1 g práškovej celulózy o polymeračnom stupni 650 sa suspenduje v 600 ml isopropanolu, do ktorého sa predom emulgovalo 20 .ml roztoku hydroxidu sodného o koncentrácii 25 % hmot. Reakčná zmes sa mieša pri laboratórnej teplote 1 hodinu, načo sa přidá 8 g chloroctanu sodného a reakčná teplota sa za stálého miešania zvyšuje postupné počas 1 hodiny na 60 °C, pri ktorej sa nechá reagovat 3 hodiny. Nerozpustná karboxymetylcelulóza sa na filtri odsaje a premyje alkoholom. Dobré odsátá karboxymetylcelulóza sa zaleje v ikadičke 300 až 400 mililitrov destilovanej vody, v ktorej sa celulóza rozpustí a po rozpuštění sa přidává po častiach, celkom 1,3 g farbiva Remazol briliant blue R a nechá sa za miešania reagovat celkove 1 hodinu za postupného pridávania octanu sodného celkove 8 g. Po ukončení reakcie sa roztok pomaly nalieva do 4 litrov alkoholu (za intenzívneho miešania) okyseleného takým množstvom kyseliny octovej, aby právě stačilo na neutralizáciu volného hydroxidu sodného v reakčnom roztoku chromolytickej karboxymetylcelulózy. Vyzrážaný produkt sa odfiltruje a premýva na filtri metanolom, resp. extrahuje metanolom v Soxlethovom extrafktore.

Hotový chromolytický produkt, vodorozpustná hydroxyetylcelulóza obsahuje 5 % viazaného farbiva a stupeň substitúcie s monochlóroctovou kyselinou 0,42.

Příklad 2

Postup ako v příklade 1 len namiesto celulózy ako polysacharid použijeme chitín.

Výsledný produkt chromolytický karboxymetylchitín má 5,5 % viazaného farbiva a stupeň substitúcie s kyselinou monochloroctovou 0,48.

Příklad 3

Postup ako v příklade 1 s tým rozdielom, že ako polysacharid použijeme lichenan a množstvo farbiva 1,7 g.

Výsledný produkt chromolytický karboxymetyllichenan má 6,2 % viazaného farbiva a stupeň substitúcie kyselinou monochloroctovou 0,44.

Příklad 4

Postup ako v příklade 1 s tým rozdielom, že ako polysacharid sa použije xylán.

Výsledný produkt chromolytický karboxymetylxylan obsahuje 4 % hmot. viazaného farbiva a stupeň substitúcie monochloroctovou kyselinou 0,38.

Příklad 5

Postup podlá příkladu 1 s tým rozdielom, že ako polysacharid sa použije zemiakový škrob a množstvo chloroctanu sodného len 4,5 g a množstvo farbiva 1,7 g.

Výsledný produkt chromolytický karboxymetylškrob obsahuje 7 % hmot. viazaného farbiva a stupeň substitúcie s kyselinou monochloroctovou 0,25.

Příklad 6

Postup pódia příkladu 1 s tým rozdielom, že ako alkylačné reagens sa použije 2,5 g etylénoxidu a reakcia sa vedie pri 40 až 50 °C po dobu 2 hodin.

Vzniknutý derivát hydroxyetylcelulózy sa ďalej modifikuje naviazaním farbiva podlá příkladu 1.

Hotoivý produkt, chromolytický vodorozpustný derivát hydroxyetylcelulózy, so stupňom substitúcie 0,3 vzhladom na hydroxyetyl a obsahom viazaného farbiva 4,3 % je vhodný ako rozpustný substrát pre stanovenie celulózovej aktivity.

Příklad 7

Postup podlá příkladu 6 s tým rozdielom, že ako polysacharid sa použije ./3-manan.

Rozpustný chromolytický substrát má podobné vlastnosti z hladiska stupňa sabstitúcie a množstva viazaného farbiva ako v příklade 6 a je vhodný na meranie mansnázovej aktivity.

Příklade

Postup podlá příkladu 6 s tým rozdielom, že ako polysacharid sa použije lichenan.

Výsledný produkt hydroxyetyllichenan s kovalentne viazaným farbivom je vhodným rozpustným substrátem na stanovenie lichenázovej aktivity.

Příklad 9

Postup podlá příkladu 6 s tým rozdielom, že ako polysacharid sa použije zemiakový alebo kukuřičný škrob.

Výsledný produkt chromolytický hydroxyetylškroh je vhodným rozpustným substrátom na stanovenie aktivity alfa amylázy.

Příklad 10 g sodnej soli kyseliny pektovej sa suspenduje v 200 ml izopropanolu a za stálého miešania sa přidá 5 ml hydroxidu sodného o koncentrácii 5 % hmot. Po 30 minutách sa přidá 0,8 g farbiva Remazol briliant blue R a mieša sa 1 hodinu pri teplote 15 až 20 *C.

Výsledný produkt, vodorozpustný chromolytický pektát sodný je dobrý substrát na stanovenie endopolygalakturonázovej aktivity.

Příklad 11

Postup ako v příklade 10 s tým rozdielom, že alko polysacharid sa použije a-manan.

Výsledný produkt, chromolytický vodorozpustný «-manan je vhodný enzýmový substrát na stanovenie «-mananázovej aktivity.

Příklad 12 g metylcelulózy s obsahom metoxylu 28 % hmot. sa suspenduje v 100 ml etanolu a za miešania sa přidá 5 ml vodného roztoku hydroxidu sodného o koncentrácii 2 % hmot. a reakčná zmes sa nechá miešať 30 minút pri izbovej teplote, potom sa přidá po častiach 1,0 g farbiva Remazol briliant blue R a nechá sa reagovat za miešenia pri teplote 15 až 20 °C 1 hodinu. Po 1 hodině sa přítomné alkálie neutralizujú s kyselinou octovou a nezreagované farbivo sa vymývá alebo extrahuje ako v příklade 1. Výsledný produkt, vodorozpustná chromolytická metylcelulóza je velmi dobrým substrátom pre meranie celulázovej enzýmovej aktivity.

Příklad 13 g zemiakového škrobu sa suspenduje do 100 ml izopropanolu v iktorom sa predom rozpustilo 8 ml vodného roztoku hydroxidu sodného o koncentrácii 40 % hmotnostných. Po zhomogenizování reakčnej zmesi sa přidá 3,5 g /3-chloretylsulfonátu sodného a reakčná zmes sa vyhřeje na 55 °C, pri ktorej teplota sa nechá reagovat 90 minút. Potom sa reakčná zmes ochladí na 20 stupňov Celsia a přidá sa 1,7 g farbiva Remazol briliant blue R a nechá sa za miešania reagovat 1 hodinu. Potom sa chromogénny vodorozpustný sulfoetylškrob odfiltruje a premýva, alebo extrahuje metanolom od nezreagovaného farbiva.

Hotový substrát je velmi dobrý na stanovenie alfa amylázovej enzýmovej aktivity.

P r í k 1 a d 14

Postup podlá příkladu 1 s tým rozdielom, že ako alkylačné reagens sa použije 3,0 g propylénoxidu a reakčná zmes sa nechá reagovat pri teplote 55 °C po dobu 2 hodin.

Vzniknutý derivát hydroxypropylcelulózy sa ďalej modifikuje naviazaním farbiva podlá příkladu 1.

Hotový produkt, chromolytidký vodorozpustný derivát hydroxypropylcelulózy, so stupňom substitúcie 0,35 a obsahom viazaného farbiva 5,2 % hmotnostných je vhodný ako rozpustný substrát pre stanovenie celulózovej aktivity.

Příklad 15 g vodorozpustnej etylcelulózy so stupňom substitúcie 0,58 sa suspenduje v 100 ml metanolu, v ktorom sa predom rozpustilo 5 ml vodného roztoku hydroxidu sodného o koncentrácii 2·% hmotnostných.

Reakčná zmes sa nechá miešať 30 minút při laboratorně] teplote, potom sa přidá po častiach 1,0 g farbiva Remazol briliant blue R a nechá sa reagovat za miešania pri teplotě 15 až 20 °C po dobu 1 hodiny. Po 1 hodině sa přítomné alkálie neutralizujú s kyselinou octovou a nezreagované farbiivo sa vymývá, alebo extrahuje ako v příklade 1.

Výsledný produkt, vodorozpustná chromolytická etylcelulóza je velmi dobrých substrátom pre meranie celulózovej enzýmovej aktivity.

Vynález má široké využitie všade, kde je potřebné stanovit enzýmové polysacharid-hydrolázové aktivity, či už v medzioperačnej kontrole pri výrobě jednotlivých enzýmov, alebo pri diagnostickom stanovení enzýmových aktivit v biologických tekutinách.

Claims (1)

1. PREDMET

   Spósob přípravy vodorozpustných chromolytických polysacharidových enzymových substrátov vyznačený tým, že v prvom stupni sa nerozpustný polysacharid alkyluje v alkalickom prostředí s etylénoxidom a/alebo kyselinou monochlóroctovou, a/alebo propylénoxidom, a/alebo alkylhalogenidom s počtom uhlíkov 1 až 2, a/alebo ,/3-chlóretylsulfonátom sodným na taký stupeň substitúcie, pri ktorom je už polysacharid vo vodě rozpustný, načo sa v druhom stupni na alkyl-polysacharid naviaže remazolové farbivo Remazol briliant blue R (dvojsodná

   VYNALEZU sol' kyselina 8-amino-5-[3-(sulfoetylsulfonyljanilino] 6-antrachinonsulfonovej) v množstve 3 až 10 % hmotnostných na hmotnost polysacharidu pri teplote 15 až 25 °C a koncentrácie hydroxidu sodného 0,7 až 1,0 % hmotnostných po dobu 30 až 90 minút, a v trefom stupni sa alkylovaný chromolytický polysacharid vyzráža z roztoku alkoholom okyseleným kyselinou octovou na neutralizáciu volných alkálií v reakčnej zmesi a nakuniec sa vytarbený polysacharid zbaví fyzikálně viazaného farbiva premývaním, alebo extrahováním s metanolom.