CS230983B1

CS230983B1 - A method of isolating the thermolabile enterotoxin by Bschericbia coli

Info

Publication number: CS230983B1
Application number: CS831376A
Authority: CS
Inventors: Oto Sova; Miroslav Viest
Original assignee: Oto Sova; Miroslav Viest
Priority date: 1983-02-28
Filing date: 1983-02-28
Publication date: 1984-09-17
Also published as: CS137683A1

Abstract

Vynález sa týká nového sposobu izolácie •'termolabilného enterotoxínu baktérií Eschtrichia coli, vhodného pre velkokapacitní! výrobu. Uvedený izolovaný enterotoxín slúži bud k imunizáoii prašných prasnic, alebo telných kráv osve alebo ako doplnok k iným,vakcínam proti Sxevným zápalom a hnačkóm novorodencov. Naohádza použiti® v živočíšnej velkovýrobě a prispieva k podstatnému znižovaniu úhynu novorodencov.The invention relates to a new method of isolating the thermolabile enterotoxin of Eschtrichia coli bacteria, suitable for large-scale production. The isolated enterotoxin is used either for the immunization of lactating sows or lactating cows or as a supplement to other vaccines against neonatal gonorrhea and neonatal diarrhea. It is used in large-scale animal production and contributes to a significant reduction in neonatal mortality.

Description

Vynález sa týká spósobu izolácie a výroby terraolabilného enterotoxínu baktérií Escherichia coli, ktorý slúži buď k imunizacii prašných prasnic, alebo telných krav osve, alebo ako doplnok k iným vakcínam prot i črevným zápal om a hnačkám.The invention relates to a process for the isolation and production of a terraolabile enterotoxin of Escherichia coli, which serves either to immunize dusty sows or calf cows or to supplement other vaccines against intestinal inflammations and diarrhea.

Kolienteritidu akolihnačky novorodených teliat a prasiat spósobujú enteropatogenně baktérie Escherichia coli, ktoré sa adherujú na črevnú stenu postihnutých zvierat a potom vylučováním enterotoxínov spósobujú črevný zápal a hnačky, v dósledku ktorých novorodenci často hynú. Zdolanie tohoto črevného zápalu je velmi vážným problémom* Najúspešnejším postupom je imunizácia zvierat antigénom adherencie, ktorý zabraňuje baktériám přilnut’ ku črevnej stene a tým aplikovat? v potrebnom množstve svoje toxíny a tak spósobovať onemecnenie. Napriek zníženiu adherencie však v niéktorých prípadoch baktérie pasážujúce črevným traktom stačia vylúčiť také množstvá entero toxínu, že k ochoreniu dojde. Tým sa vytvára sitttácia, keď vedla imunizácie voči antigénom adherencie je potřebná zviera?tá imunizovat’ aj voči enterotoxínu* Izelácia enterotoxínov v priemyselnom měřítku je však velmi zložitá, pretože vyžaduje niekolkostupňové chemické izolačně postupy a nákladné zariadenia*Escherichia coli enteres pathogenic colitiseritis and newborn calf and porcine diarrhea, which adheres to the intestinal wall of the affected animals, and then causes enteric inflammation and diarrhea, resulting in which newborns often die. Managing this intestinal inflammation is a very serious problem * The most successful procedure is to immunize animals with an adherence antigen that prevents bacteria from adhering to the intestinal wall and thereby applying it? in their required amount of their toxins and thus cause disease. However, in spite of a reduction in adherence, in some cases the bacteria passing through the intestinal tract are sufficient to exclude amounts of entero toxin that cause the disease. This creates a sitttation when immunization against adherence antigens is needed for an animal to be immunized against enterotoxin * However, the isolation of enterotoxins on an industrial scale is very complex because it requires multi-step chemical isolation procedures and expensive equipment *

230 983230 983

Uvedené nedostatky v podstatnej miere odstraňuje uvedený sposob izolácie termolabilného enterotoxínu baktérií Escherichia coli podlá vynálezu, ktorého podstata spočívá v tom, že sa enterotoxín z rozbitých bakteriálnych tiel po ich odstředění izoluje izoelektrickou auto!okusáciou do takej koncentrácie, že vykazuje jasnú přecipitačnú líniu v agare voči antiséru anti Ent až do riedenia 1 i 64·The above-mentioned deficiencies are substantially eliminated by the method of isolation of the thermolabile enterotoxin of Escherichia coli according to the invention, which consists in isolating the enterotoxin from the broken bacterial bodies after centrifugation by isoelectric auto-biting to such a concentration that it shows a clear precipitate line antisera anti Ent up to 1 and 64 dilution ·

Výhodou uvedeného spósobu výroby termolabilného entero toxínu je jednoduchost, energetická nenáročnost*,, vylúčenie trvalej obsluhy aparatúry a potřeby chemikálií, pretože separácia prebieha jedine v apyrogénnej sterilnej destilovanej vod··The advantage of this method of production of thermolabile entero toxin is its simplicity, low energy consumption, eliminating the permanent operation of the apparatus and the need for chemicals, since the separation takes place only in pyrogen-free sterile distilled water.

Příklad·Example·

Baktérie Escherichia coli, produkujúce tělový termolahilný enteratoxín sa po bežnej kultivácii, zabezpecujúcej vysoký obsah tohoto enterotoxínu v telách baktérií odstredia a bakterín bez supematantu sa resuspenduje v 2 % roztoku nátríumlaurylsulíátu, čiže nátriumdodecylsulíátru v sterilnej destilovanej vodě pri teplote 4 °C pomocou homogenizátora po dobu 5 až 10 min pri 3 000 1/min a teplote 4 °C· Tým sposobom nastane rozbitie baktérií· Potom sa homegenát odstředí pri 100 000 m.s”² pri teplote 4 °C po dobu jednej hodiny a supematant, ktorého vodivost sa upraví na hodnoty do SOO^uS přidáním sterilnej destilovanej vody, alebo přidáním ďalšieho substrátu následnou homogenizáciou ďalšieho bakterínu v tom istom roztoku, sa aplikuje do horizontálnej izoelektroíokusačnej velkokapacitnej aparatúry s mechanicky stabilizovaným deleným roztokom· Do aparatúry sa aplikujeEscherichia coli bacteria producing body thermolahile enteratoxin are centrifuged after conventional cultivation to ensure high levels of this enterotoxin in bacteria and are resuspended in 2% sodium lauryl sulphate solution, so that the sodium dodecylsilane is homogenized at a temperature of 4 ° C. up to 10 min at 3,000 rpm and 4 ° C · This will cause bacteria to break down · Then the homogenate is centrifuged at 100,000 ms ² at 4 ° C for one hour and the supernatant whose conductivity is adjusted to a value of up to 10 min. SOO ^ uS by adding sterile distilled water, or by adding another substrate followed by homogenization of another bacterin in the same solution, is applied to a horizontal isoelectric focusing large capacity apparatus with mechanically stabilized split solution.

230 983 jednosměrný elektrický prúd maximálně 3 VA a roztok fokusuje pri teplote 4 °C kým neklesne pod 3 mA pri napatí 1. 000 V.230 983 a direct current of maximum 3 VA and the solution is focused at 4 ° C until it drops below 3 mA at 1,000 V.

Po fokusácii sa zmeria vo všetkých priehradkách aparatúry pH. Termolabilný enterotoxín fokusuje automaticky k pH 6· - 7. V tomto rozmedzí interferuje len minimum iných hielkovín, ktoré majú izoelektrické pí vačšinou okolo pH 5,5. Z priehradok s pH v rozmedzí 6 až 7 sa zhromažďuje termolabilný enterotoxín· » Jeho koncentrácia sa upraví tak, aby vykazoval difúziou v agare zretelnú přecipitačnú líniu voči antiséru Ent alebo vAfter focusing, the pH is measured in all compartments of the apparatus. The thermolabile enterotoxin automatically focuses on a pH of 6 - 7. Within this range, only a minimum of other proteins that have an isoelectric pi typically interfere with a pH of about 5.5. Thermolabile enterotoxin is collected from pH 6 to 7 compartments. Its concentration is adjusted to exhibit a visible precipitation line against the Ent antiserum or by diffusion in agar.

cholerovému antiséru aj pri riedení 1 : 64. Po dosiaBnutí tejto koncentrácie sa k roztoku termolabilného enterotoxínu buď přidá vhodné adjuvans, například olejové a podává sa ako samostatná imunizačná vakcína parenterálne, subkutánne alebo intramuskuláme injekčne v dávke 2 ml asi 6 týždňov před pórodom prašnéj prasnici, či telnej krave, alebo sa používá ako přídavek k vytvorenia komplexněj imunizačnej vakcíny společné například s K 88 alebo K 99 antigénom.Once this concentration has been reached, a suitable adjuvant, such as oily, is added to the thermolabile enterotoxin solution and administered as a separate immunization vaccine parenterally, subcutaneously or intramuscularly at a dose of 2 ml approximately 6 weeks before the birth of the dusty sow. or a cow cow, or used as an adjunct to make a complex immunization vaccine common to, for example, the K 88 or K 99 antigen.

Vynález može nájsť široké uplatnenie pri priemyselnej výrobě imunizačných vakcia a v živočíšnej velkovýrobě.The invention can be widely used in the industrial production of immunization vaccines and in large-scale animal production.

Claims

A method for isolating Escherichia coli thermolabile enterotoxin, characterized in that the enterotoxin-disrupted bacterial bodies are isolated after isolation by iso-electric autoclaving to a concentration such that it has a clear agar precipitation line against anti Ent antiserum, or cholera antiserum up to a 1: 64 dilution