CS231514B1 - Inaktivovaná olejová vakcína proti Aujeszkyho chorobě a sposob jej výroby - Google Patents

Description

Inaktivovaná olejová vakcína proti Aujeszkyho chorobě je určená na špecifickú profylaxiu Aujeszkyho choroby u vnímavých druhov hospodářských a úžitkových zvierat. Připravuje sa z atenuovaných kmeňov virusu Aujeszkyho choroby, ktoré sú neškodné pre ošípané všetkých věkových kategorií pri lubovolnej aplikácii, so zachovanou úplnou alebo čiastočnou patogenitou pre králíky. Virusová suspenzia so připravuje pomnožením v buňkových kulturách a následné sa inaktivuje účinkom formaldehydu a saponínu. Emulguje sa so zmesou adjuvantných olejov tak, aby vznikla dvojitá emulzia voda v oleji vo vodě.

Vynález sa týká inaktivovanej olejovej vakcíny proti Aujeszkyho chorobě vnímavých druhov hospodářských a užitkových zvierat a spósobu jej výroby.

Virus Aujezskyho choroby vyvolává nakažlivé ochorenie u viacerých druhov hospodářských a úžitkových zvierat, to je ošípaných, hovadzieho dobytka, oviec, psov, mačiek a kožušinových zvierat, ktoré sa vyznačujú vysokou morbiditou a mortalitou a zapříčiňuje vysoké národohospodářské straty. Ochranné očkovanie proti Aujeszkyho chorobě sa doposial' robí prevážne pomocou živých vakcín, vyrábaných z atenuovaných, respektive avirulentných kmeňov [Zuffa, A., Grunert, Z., 1974: Les vaccines utilisés en Tchecoslovaquie contre la maladie D‘Aujeszky., Cah. Méd. Vét. 43, 334 — 337; Bártha, A., 1961: Kísérletek az Aujeszky-féle virus virulenciájának szelídítésére., Mágy. állatorv. Lapja 16 (2), 42 — 45], Živé vakcíny z avirulentných kmeňov sú neškodné a ich aplikácia v primeranej dávke vyvolává u očkovaných zvierat ochranu proti klinickému ochoreniu pri ich kontakte s infekciou [Žuffa, O., 1976: The signifikance of specific prophylaxie for control of Aujeszky‘s disease., Proč. 4-th Int. Pig Vet. Soc. Congr. Ames USA, G 10 (En]; Szabó, A., Grunert,

Z., 1971: Presistence of virulent Pseudorabies Virus in Herdis of Vaccinated and Nonvaccinated Pigs., Acta Virologica, 15, 87 až 94], Proti používaniu živých vakcín sa vyslovujú námietky, že sa nimi vnáša do chovu a populácie ošípaných infekčně agens, ktoré móže u vakcinovaných zvierat přetrvávat a pri přesune vakcinovaných zvierat do zdravých chovov sprostredkovať přenos infekcie [Škoda, R., 1976: The control of Aujeszky‘s disease in large swine units by use of attenuated live vaccines. Proč. 4-th Inst. Pig Vet. Soc. Congr., Ames. USA, G (6), Baskerville, A., Ferran, J. B., Dow, C., 1973: Aujeszky‘s disease in pigs., Vet. Bull. 43, (9), 465 — 480]. Tieto námietky proti používaniu živých vakcín sa stali opodstatněnými najma potom, čo sa dokázalo, že virus Aujeszkyho choroby, rovnako ako iné herpetické virusy 1'udí a zvierat, móže po primárné] infekcii, doprevádzanej klinickým ochorením alebo prebiehajúcej inaparentne, navodit pretrvávajúcu latentnú infekciu [Sabó, A., Rajčáni, J. 1976: Latent pseudorabies virus infection in pigs., Acta virologica, 20, 208 — 214],

Používanie živých vakcín je preto indikované v oblastiach enzooticky zamořených Aujeszkyho vírusom, kým v oblastiach a štátoch so sporadickým výskytom Aujeszkyho choroby sa odporúča používat vakcíny inaktivované.

Osobitný význam a uplatnenie nájde účinná inaktivovaná vakcína proti Aujeszkyho chorobě pri ochrannom očkování hovadzieho dobytka, oviec a másožravcov. Tieto druhy zvierat sú totiž na infekciu Aujeszkyho Vírusom velmi vnímavé, pričom ochorenie prebieha vo všetkých prípadoch letálne. Živé vakcíny, neškodné pre najnižšie věkové kategorie uvedených druhov zvierat, musia sa preto vyrábať z avirulentných kmeňov s limitovanou schopnosťou reprodukcie v organizme očkovancov. To však znamená, že při antigénnej stimulácii sa uplatňuje len malé množstvo inokulovaného vakcinačného virusu, čoho prejavom je poměrně slabá imunitná odpověď. Pri inaktivovanej vakcíne možno do aplikačnej dávky koncentrovat poměrně velké množstvo virusového materiálu, ktorého antigenitu možno dalej potencovat vazbou na vhodné adjuvans.

Inaktivované vakcíny, vyrábané z orgánov experimentálně infikovaných zvierat, sa ukázali ako neúčinné. Prvé pokusy o přípravu účinnej inaktivovanej vakcíny proti Aujeszkyho chorobě z virusu napestovaného na buňkových kulturách a inaktlvovaného formaldehydom (Koch, A., Abraham, E., 1952: Immunisationsversuche mit dem Aujeszkyschen Virus., Acta vet. Hung. 11/4/, 270 — 279; Žuffa, A., 1963: Versuch zur Immunisierung von Laboratoriumstiere und Schweinen mittels Formaldehyd- und UV/ /Strahlen inaktieviertem Aujeszky-Virus., Arch. f. Exptl. Vet.-med. 17/3/, 593 — 613], alebo ultrafialovými lúčmi [predtým citovaný Žuffa, A., Beládi, I., Ivánovics, D., 1954: Immunisierung von Laboratoriumstieren mit dem Virus der Aujeszkyschen Krankheit nach Dessen Inaktivierung mit Ultraviolettstrahlen, Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. 2(1-2), 151 — 160], s použitím gélu hydroxidu hlinitého ako adjuvans, sa ukázali neúspěšné. Ani rozrušenie infekčnosti Aujeiszkyho virusu, napestovaného na buňkových kulturách, pomocou kyseliny dusitej neviedlo k príprave účinnej inaktivovanej vakcíny. Vo vakcínach připravených z vírusov inaktivovaných pomocou saponínu [Barbinschl, C., Papadopol, M., 1966: Cercetari privind imuzares in boala lui Aujeszky cu vacciu preparát din virus des cultura absorbit si saponinat. Lucr. Inst. Pasteur III (1-1964), 71 — 84], alebo kryštáfovej violeti [Nedjalkov, S. a spol,, 1968: Versuche zur Herstellung von Vakzine gegen Aujeszkysche Krankheit sus inaktiviertem Virus.

1. Mitt. Arch. exp. Vet. Med. 22, 499 — 507], nemožno vylúčiť přítomnost infekčného virusu [predtým citovaný Baskerville a spol. 1973], Efektivně jsou sa ukázala vakcína připravená Haralambievom a spol. [Haralambiev, H„ Mermerski, K., Simeonov, S„ 1967: Untersuchungen uber die Immunogenitat der mit Aethanol inaktivierten Vakzine gegen die Aujeszkysche Krankheit., Arch. exp. Vet. Med., 21(2), 501 — 507] z tkaninového virusu inaktivovaného pomooou eranolu s přidáním parafínového oleja ako adjuvans. Nakolko ide o jednoduché zmiešanie vody s olejom, dochádza po krátkodobom stati emulzie vakcíny k rozdeleniu na vodná a olejová fázu. Simeonov a spol. [Si231514 meonov, S., Vasilev, V., Jotov, M., 1973: Sravnitelno izpitvanie na saponinovi vaksiny protiv bolesta na Aujeszky., Vet. Med., Nauki 10(2), 83 — 88] nahradili nlejové adjuvans saponínora. Porovnávali účinnost troch inaktivovaných vakcín, připravených pomocou formaldehydu, kryštáTovej violeti a saponínu. Borgen, H. C., Expensen, L., 1970: Immunizing efect of photoinactivated pseudorabies virus., Zhl. Bakt. I. Orig., 214(1), 13 — 16, předložili v uvedenej publikácii dokaž o tom, že vystavenie Aujeszkyho virusu posobeniu ultrafialových lúčov vedie k rozrušeniu jeho infekčnosti bez porušenia povrchových štruktúr virionov a tým k zachovaniu antigenity. Keďže testovanie imunizačných schopností virusu inaktivovaného ultrafialovými lúčmi sa robilo aplíkáciou velkých, pre praktické účely nepoužitelných dávok, a nakofko technické ťažkosti inaktivácie a technologické problémy spracovania inaktivovaného virusu na vakcínu ostali nedoriešené, nenašiel tento sposob inaktivácie Aujeszkyho virusu pri výrobě vakcíny proti Aujeszkyho chorobě praktické uplatnenie. Preukaznú imunitnú odpověď vyvolala vakcína predstavujúca virus napestovaný na bunkojev kultúre stabilnej škreščej linie BHK-21, inaktivovaný etyletylenimínom a viazaný ,na dietylamínoetyl dextran [Škoda, R., Wittmann, G., 1973: Die Immunisierung von Schweinen mit Vakzinen aus Inaktiviertem Aujeszkv-Viirus. Zbl. Vet. Med. B(2Q), 127 — 138]. Jednorázové podanie vakcíny ošípaným v primeraných dávkách vyvolalo aktívnu tvorbu protilátok a chránenosť proti infekcii definovaným množstvom virulentného virusu. Neudává sa však stupeň imunity po aplikácii nižších dávok vakcíny, resp. u dobytka len po dvojnásohnom očkovaní, ako sa to vyžaduje pre: praktické používanie vakcíny.

De Lagneau a spol. [DeLagneau, J. F. a spol. 1975: Immunisation contre la maladie D‘Aujeszky a 1‘aide d‘un nouveau vaccin huileux a virus inactivé, Rec. Méd. Vet. 151(151), 561 — 575] použili pre inaktivovanie Aujeszkyho virusu, pomnoženého na bunkovej linii 1B-RS-2, klasický sposob, to je formaldehyd a pre stlmulovanie antigenity virusu lipoidné adjuvans. Dvojnásobné podanie vakcíny vyvolalo u laboratornych zvierat a ošípaných tvorbu protilátok v tltroch 1: 16 až 1: 128 a chránenosť proti infekcii definovaným množstvom letálnych dávok. Očinnú inaktivovanú vakcínu proti Aujeszkyho chorobě připravil Genov a spol. tak, že virus inaktivoval 1,3-propiolaktónom a následné ho viazal na adjuvans predstavujúci gél hydroxidu hlinitého [Genov. I., Řezačka, A., Genová, A., 1967: Polučavane inaktivirana s betapropiolakton vakcína srešču bolestta na Aueski s štam Ruse]. Nedostatkom tejto vagíny je použitý inaktivačný prostriedok, ktcurý bol vyřaděný zo· zoznamu látok, použitelných pre přípravu biopreparátov, nakoTko sa dokázala jeho mutagenita [Pasrish, B. J., Searle, C. D., 1966: Carcinogenity of beta-propiolacton and 4-nitro quinoline N-Oxide for the skin of Guinea pig., Brit. ]. Gancer 2.3, 200 — 205 j. Žuffa a spol. připravili účinnú inaktivovanú vakcínu proti Aujeszkyho chorobě zo zmesi virulentného a atenuovaného virusu Aujeszkyho chorobě inaktivovaného eíalalkoholom, .naviazanej na olejové adjuvans [Zuffa, A., Brányik, A., Salaj, J., Žuffová, ]., Menšík, ]., Štěpánek, J., 1980: Inaktivovaná adjuvantná vakcína proti Aujeszkyho chorobě a sposob jej přípravy. Autorské osvedčenie č. 201 802],

Nevýhodou doposial' navrhovaných inaktivovaných vakcín proti Aujeszkyho chorobě je, že na ich výrobu sa používajú virulentně kmene virusu Aujeszkyho choroby jednotlivo alebo v 1'ubovol'nom pomere zmiešané s kmeňmi s čiastočne zníženou virulenciou. Ďalšou nevýhodou je nízká autigénna stabilita virusu Aujeszkyho choroby inaktivovaného etanolom v době před emulgáciou s olejovým adjuvans. Táto skutečnost nedovoluje súčasne vyrábať inaktivované aj živé avirulentné očkovacie látky, vzhladom na vážné nebezpečenstvo laboratórnej kontaminácie a okrem toho znemožňuje výrobnú spoluprácu s krajinami, ktorých předpisy nedovolujú používat virulentně virusové kmene vo výrobných podmienkach.

Uvedené nedostatky sú riešené inaktivovanou olejovou vakcínou proti Aujeszkyho chorobě vnímavých druhov hospodářských a úžitkových zvierat, obsahujúcou v ml 10⁷ až 10⁹ TKIDso inaktivovaného atenuovaného kmeňa Buk-TK-900/IVa uvedeného v Československé] zbierke mikroorganizmov na Výskumnom ústave veterinárneho lekárstva v Brně, Hudcova 60, pod označením CCM V-94, alebo 10' až 10⁹ TKíDso inaktivovaného atenuovaného kmeňa Buk-TK/650 uvedeného v Československej zbierke mikroorganizmov na Výskumnom ústave veterinárneho lekárstva v Brně, Hudcova 60, pod označením CAMP V-265, emulgovaného· v olejovom adjuvans a spoeobom jej výroby z atenuovaného kmeňa virusu Aujeskyho choroby neškodných pre ošípané všetkých věkových kategorií pri fubovolnej aplikácii, so zachovanou úplnou alebo čiastočnou patogenitou pre králiky, s výhodou použitia kmeňov

Buk-TK-900/IVa, alebo· Buk-TK/650, jednotlivo alebo v zmesi v TubovoTnom pomere, účinnej inaktivácie formaldehydom a saponinom pri zachovaní antigenity a poměru inaktivačných látok k antigénom virusových kmeňov. Sposob výroby vakcíny je založený na tom, že atenuované kmene virusu Aujeszkyho choroby neškodné pre ošípané všetkých věkových kategorií pri 1'ubovolnej aplikácii, so zachovanou úplnou, alebo· čiastočnou patogenitou pre králiky, sa jednotlivo pomnožujú na primárných kul231514 túrách, alebo subkultúrach kuřácích alebo· kačacích embryonálnych buniek, narastených na skle, v suspenzii alebo na mikronosičoch. Pre pomnoženie vírusov je možné tiež použiť vnímavé stabilně linie buniek s kontrolovanými biologickými vlastnosťami. Na kultiváciu buňkových kultúr použitých prs pomnoženie atenuovaných kmeňov Aujeszkyho virusu sa použijú vhodné živné média, najma tie, ktoré obsahujú fragmenty bovínnsho mliečneho albuminu a potřebné množstvo cicavčích, alebo vtáčích sér [Portefield, J. S., 1967: Animal Tissue Culture, v zborníku pod edičným vedením Maramorosha, K. a Koprowského, H., Acad. Press, New York], Nevylučuje sa použitie definovaných médií obsahujúcich látky ovplyvňujúce metabolickú aktivitu buniek vo vrstvových, alebo suspenzných kulturách. Buňkové kultúry sa infikujú atenuovanými kmeňmi virusu Aujeskyho choroby, pri multiplicite infekcie od 0,1 do 1,0 TKIDso na jednu buňku. Po 24 až 48 hodinovej inkubácii infikovaných kultúr pri 37 °C sa získá pomnožený virus v objeme udržovacieho média s infekčným titrom 10⁷ až 10⁹ TKIDso v 1 ml suspenzie. Připravená virusová susipenzia sa zbaví buňkového detritu filtráciou cez gázu. Virusové suspenzie atenuovaných kmeňov virusu Aujeszkyho choroby s uvedenou hodnotou infekčného titru sa jednotlivo alebo v zmesi v 1'ubovol'nom pomere zmiešajú a následné inaktivujú působením formaldehydu vo výslednej koncentrácii od 0,05 do· 0,20 hmotnostných percent pri teplote 25 až 35 °C počas 18 až 72 hodin, účinkom saponínu, ktorý je súčasne zložkou adjuvancia, vo výslednej koncentrácii od 0,05 do 0,20 hmotnostných percent pri teplote 25 až 35 °C po dobu 18 až 72 hodin, kombinovaným účinkom formaldehydu a saponínu v jednom roztoku, alebo následným přidáváním jednotlivých látok bezprostředné po sebe, alebo do uplynutia 72 hodin v uvedených koncentřáciách počas 18 až 72 hodin v rozsahu uvedených teplot. Po kontrole inaktivácie virusu, ktorá sa uskutočni intramuskulárnou aplikáciou vírusovej suspenzie králikom v dávkách 2 až 10 ml, sa antigény emulgujú so známými olejmi v definovanom pomere vodnej fázy k olejom. Zmes adjuvantných olejov, obsahuje minerálny olej o viskozite 20.10® až 120.10⁶ m².s^-1 a emulgátory v takom poměre, aby vytvárali dvojitú emulziu voda v oleji vo vodě, ktorých zastúpenie vo vak•cíne představuje 13 až 52 hmotnostných percent, s výhodou 17,4 hmotnostných percent.

Uvedený příklad predmet vynálezu nijak neobmedzuje, ani nevyčerpáva.

Příklad prevedenia

Primárné kultúry z kuřácích alebo kačacích embryí, ich subkultúry, alebo vnímavé stabilně linie buniek s kontrolovanými biologickými vlastnosťami, nařaste,né na skle, v suspenzii alebo na mikronosičoch, sa zbavia rastového média pozostávajúceho z Earleho roztoku s prídavkom 7 hmotnostných percent tefacieho séra a 0,3 až 0,5 hmotnostných percent hydrolyzátu laktalbumínu. Buňkové kultury se opláchnu 1 až 2krát fyziologickým roztokom tlmeným fosfátrni a infikujú atenuovaným kmeňom Buk-TK-900/IVa, alebo· Buk-TK/650 virusu Aujeszkyho choroby, uvedenými v popisnej časti, pri multiplicite infekcie 0,1 až 1,0 TKIDso na buňku. Infikované buňkové kultúry sa zalejú Earlovým roztokom, obohateným o 0,3 až 0,5 hmotnostných percent hydrolyzátu laktalbumínu a inkuflbujú počas 24 až 48 hodin pri 37 °C. Po špecifickej degenerácii bunkovej kultúry, stanovenej mikroskopicky, ea virusová suspenzia zbaví buňkového detritu filtráciou cez gázu do sterilných fliaš z neutrálneho skla. Přidá sa formaldehyd do výslednej koncentrácie 0,2 hmotnostných percent a saponín do výslednej koncentrácie 0,1 hmotnostných percent vo virusovej suspenzii. Inaktivačné prostriedky sa pridávajú v spoločnom roztoku, alebo následným přidáváním jednotlivých látok bezprostředné po sebe. Inaktivácia prebieha počas 72 hodin pri teplote 30 °C. Po kontrole inaktivácie virusu, ktorá sa uskutoční intramuskulárnou aplikáciou inaktivovanej vírusovej suspenzie králikom v dávke 5 ml, sa inaktivovaná virusová suspenzia zmieša s 17,4 hmotnostnými percentami zmesi adjuvantných olejov a zmes sa emulguje homogenizáciou v príslušnom zariadení pri laboratórnej teplote.

Účinnost inaktivovanej olejovej vakcíny proti Aujeszkyho chorobě, podlá vynálezu, potvrdzujú výsledky v nasledujúcej tabul'ke, v ktorej sa uvádzajú titre neutralizujúcich protilátok v krvnom sére zvierat vnímavých na infekciu vírusom Aujeszkyho choroby v závislosti na množstve i. m. aplikované] vakcíny a chránenosf proti vyvolávajúcej infekcii definovaným množstvom smrtelných dávok.

Titre NV-protilátok v krvnom sére po dvojrázovej aplikácii

--ml vakcíny

5

Tabulka 1

Druh zvierat

Chránenosť prod vyvolávajúcej infekcii .. .LDjo u zvierat očkovaných ... m,l vakcíny

5

Masožravce	, 4 — 16	8 — 32	N	102	103	N
Ošípané	4 — 16	4 — 64	16 — 256	103	IQ4	104
Hovadzí doby-	N	8 — 64	8 — 128	104	IQ6	10®
tok

PREDMET

Claims (4)

1. Inaktivovaná olejová vakcína proti Aujeszkyho chorobě vnímavých druhov hospodářských a úžitkových druhov zvierat vyznačujúca sa tým, že 1 ml obsahuje 10⁷ až 10⁹ TKID50 inaktivovaných atenuovaných kmeňov virusu Aujeszkyho choroby neškodných pre ošípané všetkých věkových kategorií pri 1'ubovol'nej aplikácii, so zachovanou úplnou alebo čiastočnou patogenitou pre králiky, jednotlivo alebo v zmesi v 1'ubovol'nom pomere, emulgované v olejovom adjuvans.

2. Inaktivovaná olejová vakcína, podl'a bodu 1, vyznačujúca sa tým, že obsahuje inaktivováný atenuovaný kmen virusu Aujeszkyho choroby Buk-TK-900/IVa CCM V-94.

3. Inaktivovaná olejová vakcína podl'a hodu 1, vyznačujúca sa tým, že obsahuje inaktivovaný atenuovaný kmeň virusu Aujeszkyho choroby Buk-TK/650 CAMP V-265.

4. Sposob výroby vakcíny podl'a bodov 1 až 3, vyznačujúce sa tým, že autenuované temene virusu Aujeszkyho choroby neškodné pre ošípané všetkých věkových kategorií pri 1'ubovolnej aplikácii, co zachovanou úplnou alebo čiastočnou patogenitou pre králiky, sa pomnožujú na primárných kultúrach, alebo subkultúrach kuřácích alebo kačacích embryonálnych buniek, alebo vnímavých stahilných líniách buniek s kontrolovanými biologickými vlastnosťami, narastených na skle, v suspenzii alebo na mikronosičoch sa jednotlivo alebo v lubovolnom pomere zmiešajú a následné inaktivujú posobením formaldehydu vo výslednej koncentrácii od 0,05 do 0,20 hmotnostných percent pri teplote 25 až 35 °C počas 18 až 72 hodin, účinkom saponínu vo výslednej koncentrácii od 0,05 do 0,20 hmotnostných peroent pri teplote 25 až 35 °C po dobu 18 až 72 hodin alebo kombinovaným účinkom formaldehydu a saponínu v jednom roztoku v uvedených koncentračných pomeroch pri teplote 25 až 3^:5 °C počas 18 až 72 hodin a následné sa emulguje virusová suspenzia s 13 až 52 hmotnostnými pereentami zmesi adjuvantnýoh olejov, ktorá obsahuje 1'ahký mlnerálny olej a emulgátory.