CS236096B1 - Způsob přípravy roztoku sérového albuminu s nízkým obsahem nízkomolekulárních sloučenin - Google Patents

Abstract

Vynález řeší způsob přípravy roztoku sérového albuminu s nízkým obsahem nízkotóolekulárních sloučenin. Uvedené sloučeniny, doprovázející izolovanou albuminovou frakci, se vyznačují vlastnostmi, které v některých případech kontraindikují možnost aplikace a nemají terapeutické účinlyt Podstatou vynálezu je odstranění shora uvedených sloučenin, přítomných v neomezené koncentraci, diafiltrací na definovaných membránách tubulárního nebo plošného typu, určených pro zahušťování roztoků biomakromolekul. Izolovaná albuminová frakce ve vodném roztoku je diafiltrována při výchozí koncentraci 2 až 20%hmot. bílkovin proti vodě pro injekci, přidávané plynule za konstantního objemu nebo v určených objemech. Způsob se vyznačuje nízkou spotřebou vody a tím i nízkou energetickou spotřebou a vysokou účinností a rychlostí, která snižuje riziko kontaminace.

Description

Vynález řeší způsob přípravy roztoku sérového albuminu s nízkým obsahem nízkomolekulárních sloučenin..

V současné době používané způsoby izolace sérového albuminu pro terapeutické nebo jiné účely, jako je výroba kosmetických a dietetických přípravků, získávají preparát, který je doprovázen nízkomolekulárními sloučeninami. V případě, že má být preparát použit pro terapeutické účely, je jeho účinnost přítomností uvedených látek snižována, v některých případech je aplikace dokonce kontraindikována. Z tohoto důvodu někteří výrobci zařazují za izolační postup purifikační kroky, kterými obsah nízkomolekulárních podílů před konečným koncentrováním albuminové frakce a farmaceutickým zpracováním snižují.

Potřeba odstranění nízkomolekulárních podílů vzniká u všech dosud známých způsobů izolace albuminové frakce, ať už se jedná o ní zkomol ekulámí sloučeniny, pocházející z výchozího materiálu plasmatických bílkovin - plasmy dárců, séra, sušené plasmy nebo t.zv. náhradních surovin, t.j. retroplacentárního séra, nesterilních zbytků plasmy, erytrocytárních mas a K-plasmy, nebo o nízkomolekulární sloučeniny, použité při některém z dále uvedených způsobů izolace:

Izolační techniky lze rozdělit do několika skupin:

238 09β

- 2 postupy založené na selektivní precipitaci, ionexové chromatografii, gelové chromátografii, afinitní chromátografii a na selektivní tepelné denaturaci, nebo na kombinaci těchto postupů. Nejčastěji používané metodiky izolace albuminu srážením etanolem za nízkých teplot vychází z původní práce Cohn E.J., Strong L.E., Hughes W.L., Mulford D.J., Ashworth J.N·, Melin M· and Taylor H.L.: J.Amer.Chem.Soc. 68,459-475»

1946» z které vychází i isolační metoda použitá pro dále uvedené příklady provedení podle Α·0· 194957 - Pokorný M., Foukal Z., Pardon J.: Způsob isolace lidského sérového albuminu. Potřeba odstranění nízkomolekulárních sloučenin je aktuální i u dalších metod, kdy je jako srážecího činidla použito síranu amonhého (Schultze H., Schonenberger M., Matheka H.D.: Behringweřkw Mitt. 26,21,1952), rivanolu (Hořejší J«, Smetana R.: Acta Med.Scand. 155,65-68, 1956), kyseliny kaprylové (Chanutin A., Curnish R.R.: Arch.Biochem.Biophys. 89, 218-220, 1960), polyethylenglykolu (Polson A., Potgieter G.M., Largier J.F.,

Mears G.E.F., Joubert F.J.: Biochim. Biophys. Acta 82, 463475, 1964). Srážení polyethylenglykolem kombinuje s ionexovou chromatografií Curling (Curling J.M., Berglof J., Lindqůist L.O., Erikssdn S.: Vox Sang 33, 97-107, 1977), použití afinitní chromatografie pro přípravu čistého albuminu popisuje Harvey (Curling J.M. (ed.): Methods of plasma protein fractionation,

Academie Press, 1980)^/>*«*'*Λ pfifv&utfenew pí*6>*<**<?

-frakci popiitAje. z>£O ' Společným znakem uvedených postupů je sice selektivní oddělení albuminu od ostatních bílkovin krevní plasmy, ale zároveň zvýšení nízkomolekulární složky o další anorganické nebo

-3.236 098 organické sloučeniny, zejména chlorid sodný, octan sodný a nízkomolekulární peptidy, vzniklé štěpením bílkovin během frakcionace, nebo obsažené ve výchozí surovině a doprovázející albumin až do finálního stadia farmaceutického zpracování. Tyto sloučeniny tvoří až 4% nečistot konečného preparátu a jsou ·. řítomny ve volné formě nebo vázané na molekulu albuminu. Jejich přítomnost snižuje osmotickou i transportní kapacitu preparátu. K odstranění nízkomolekulárních podílů z roztoků albuminu se používá metod založených na principu gelové chromátografie na zesilovaných dextranových gelech (Friedli H., Fournier E., Volk T., Kistler P,: Vox Sang. 33,93-96,1977)· Štěpánek I. a Uhrík J. používají pro odstranění nízkomolekutárních podílů protiproude dialýzy.. Preparaát bývá označován salt poor albumin nebo albumin s nízkým obsahem nízkomolekulárních látek.

Uvedené nedostatky odstraňuje navrhovaný způsob odstranění etanolu a solí, využívající membránové systémy s definovanou hranicí dělení molekul ve formě plochých membrán nebo dutých vláken, používané ke koncentrování biopolymerů. Podstata odstraňování nízkomolekulárních podílů, pocházejících z výchozích materiálů, a frakcionačních technik, použitých k isolaci albuminu, spočívá podle předloženého vynálezu v tom, že roztok purifikovaného albuminu v redestilované vodě se po filtraci ředí vodou pro injekci ve skocích nebo plynule za konstantního objemu a diafiltruje na ultrafiltrační jednotce, osazené membránou ve formě ploché membrány (Fiat membranes) nebo soustavou du tých vláken (Hollow fibres) a definovanou hranicí dělení mole236 096

- 4 kul menších než 10^D. Proces probíhá za aseptických podmínek při teplotách v rozmezích 0 - 45°C, čímž lze ovlivňovat jeho rychlost vzhledem ke změnám Theologických vlastností roztoku albuminu, v rozmezí koncentrací 2 - 20% hmot., s výhodou v rozmezí 8-2% hmot. Při použití výchozího roztoku, který obsahuje 5 - 10% hmot. albuminu a 5 - 10% obj.etanolu, poklesne koncentrace etanolu pod hranici 0,5% obj.etanolu a obsah sodíku pod 174 mmol/1 při spotřebě vody pro injekci odpovídající pětinásobku výchozího objemu.

Z uvedeného vyplývá Časová i nákladová efektivnost proti shora uvedeným způsobům, které vyžadují nákladné materiály pro gelovou chromatografií, resp. 200 násobné množství redestilované vody k dialýze. Získaný diafiltrát lze zahustit na koncentraci obvyklými postupy, t.j. lyofilizací nebo odpařením nebo lze s výhodou použít téhož zařízení pro ultrafiltraci, na kterém se obsah albuminu zvýší na koncentraci vyšší než 20%, a po sterilní filtraci a doplnění stabilizátorů je obvyklým způsobem převeden do aplikační formy, t.j. do roztoku obsahujícího 5 nebo 20% hmot. albuminu.

PŘÍKLADY PROVEDENÍ

Příklad č.1.

Sediment frakce V výrobní šarže o celkové hmotnosti 23 kg byl suspendován v redestilované vodě o teplotě +4°C v poměru 2 1 vody na 1 kg sedimentu. Rozotk po přidání aktivního uhlí v množství 50 g na 1 kg sedimentu frakce V a promíchání byl zfiltrován přes asbestocelulózové filtrační vrstvy Seitz K5 a

- 5 nou typu dutých vláken HP 26.5-43-PM1O firmy ploše 2,5 m², dělící molekuly do 10^D, objem po dávkách 8 1 apyrogenní vody pro injekci,

236 09S

EKS2. 68 1 filtrátu o pH 6,40 obsahovalo 8,3% obj.etanolu a 8% hmot.bílkovin, z toho 93% albuminu. Roztok byl diafiltrovgn na aparatuře Alfa Laval UPP osazené ultrafiltrační patroRomicon o Celkové byl doplňován vždy celková spotřeba 138 1 vody. Po diafiltraci byl roztok zahuštěn ultrafiltrací na objem 24,5 1 o koncentraci 17,5% albuminu. Přidáním 500 g lyofilizovaného albuminu byla koncentrace upravena na 20% a roztok byl po přidání stabilizátoru (0,02M kaprylan sodný a 0,02M N-acetyld,l-tryptofan) běžným způsobem pasteurizován, sterilně zfiltrován, rozplhěn a podroben předepsaným chemickým, biologickým a klinickým zkouškám, na základě kterých byl propuštěn a expedován.

98,7 % hmot.

19.1 % hmot.

7,03

11, 13, 19 nef.jednotek 11, 14, 21 nef.jednotek 0,045 mg/1g albuminu

52.2 mmol/1

0,6 0,8 1,0°C bez reakcí při klinické zkoušce čistota elfo bílkoviny pH vzhled tep.stabilita obsah hernu obsah Na sterilní neškodný apyrogenní

- 6 Příklad č.2. 23β ose

Roztok albuminu, připravený analogickým způsobem jako v příkladě č.1, obsahoval 7,6% hmot .bílkovin, z toho 91,8% hmot «albuminu, a 8,1% obj · Atanolu v 70 1. K diafiltraci bylo použito zařízení Pellicon fy Millipore osazené 10 kasetami o

plochých membrán typu PTGC o celkové ploše 46 m , dělící molekuly do 10^D, objem byl doplňován vodou pro injekci v pěti dávkách po 35 1· Po diafiltraci byl roztok zahuštěn na 22,15 1 o koncentraci 23,4% hmot·albuminu na stejném zařízení. Po úpravě koncentrace na 20% hmot. a přidání stabilizátoru byl roztok běžným způsobem pasteurizován, sterilně zfiltrován, rozplněn a podroben předepsaným chemickým, biologickým a klinickým zkouškám, na základě kterých byl propuštěn a expedován, čistota elfo bílkoviny PH vzhled tep. stabilita obsah hernu obsah balení obsah Na sterilní neškodný apyrogenní

97»9% hmot.

19,7% hmot.

6,68

12, 14, 17 nef.jednotek 11, 12, 13 nef. jednotek 0,047 mg/1g albuminu 100 ml

56,55 mmal/1

0,4 0,2 0,6°C bez reakcí při klinické zkoušce

-7 Příklad č.3. _23β08β

Roztok albuminu připravený analogickým způsobem jako v příkladě č.1 obsahoval 7,8% obj.etanolu a 8,3% hmot. bílkovin, z toho 92,3% albuminu, v 87 1. K diafiltraci bylo použito zařízení Pellicon fy Millipore osazené 10 kasetami plochých membrám typu PTGC o celkové ploše 46 m , dělící molekuly do 10D, objem byl doplňován vodou pro injekci v pěti dávkách po 43 1. Po diafiltraci byl roztok lyofilizován. 6640 g lyofilizáta bylo rozpuštěno na 33 1 20%ního roztoku a po přidání stabilizátoru byl roztok běžným způsobem pasteurizován, sterilně zfiltrován, rozplněn a podroben předepsaným chemickým, biologickým a klinickým- zkouškám, na základě kterých byl propuštěn a expedován.

97,7% hmot.

9,7% hmot.

6,71

10, 12, 15 nef. jednotek 18, 22, 24 nef. jednotek 0,055 mmol/1

102 ml

56,55 mmol/1

0,4 0,3 0,1°C bez reakcí při klinické zkoušce čistota elfo bílkoviny pH vzhled tep.stabilita obsah hernu obsah balení obsah Na sterilní neškodný apyrogenní

Claims (1)

1. Způsob přípravy roztoku sérového albuminu s nízkým obsahem nízkomolekulámích sloučenin vyjádřeným obsahem sodíku, který je menší než 174 mmol/1 pro 20% hmot. roztok albuminu, vyznačující se tím, že vodný roztok purifikováného albuminu se po filtraci zředí roztokem s obsahem sodíku nižším než 174 mmol/1 a podrobí se diafiltraci na plochých membránách nebo ultrafiltračních patronách s hranicí dělení 10^ me 10^D proti danému roztoku nejméně čtyřnásobným vyředěním a takto získaný roztok se zahustí na požadovanou koncentraci 5 «t 20% hmot. albuminu.