CS250018B1 - Sposob přípravy biologicky aktívneho krytu na raný - Google Patents

Description

3 250018

Vynález sa týká spósobu iprípravy blokugicky aktívneho krytu na raný vo formě zá-sypu.

Pre účely ošetrenia povrchoyých rán sa-v medicinálně] praxi bežne používajú zásy-py připravené zo škrobu, mastenca aléboiných galeniékých základov a účinné] zlož-ky s haktericidným účinkom, ako napříkladantibiotiká, suilfoamidy a pod. Pri ošetřeníhnisavých a nekrotických rán sa v posledně]době zdůrazňuje sorpčný účinek niektorýchpolyunérov, ktoré sú schopné vdaka svojmuhydrofilnému charakteru odotoerať tekutinyz povrchu raný nasáváním exudálu, baktériía ich metabolitov do kapilár vnútornejštruktúry gélu.

Tieto vlastnosti majú přípravky zhotove-né na báze sletovaného a-l,6-gilu,kánu, dext-ránu [B. S. Jacobson: Scand. J. Plast. Re-consťr. Surg. 10, 65 až 72 (1976)], alebo ce-lulózy derivatizovane] v substitučně] reak-cii na éter [DTA 1 932 753], V posledně] době sa účinnost takto při-pravených zásypov dalej zvyšuje naviaza-ním enzýmov zo skupiny hydroláz s proteo-lytickou účinnosťou na- ?poyrch·, modifikova-ného biopolyméru kovalentnou vazbou.[Immobilizovanyje proteolytičeskije fermen-ty v liečenii gnojmo-nekrofičeských proce-sov, sborník rabót, AN ZSSR, Sibirsikoje ot-delenije, Institut eitologii i genetik!, Novo-sibirsk (1981).] Přítomnost mobilizovaných proteáz v tak-to upravených preparátech sposobuje roz-klad nekrotického tkaniva v blízkosti ranýa hnisu na je] povrchu, ipričom takto vy-tvořené rozkladné produkty hydrofilný gélnasáva do svoje] vnútornej štruktúry, čímsa súčasne odstraňuje prostredie pre roz-množovanie baktérií a znemožní sa prieniktoxínov do organizmu. Příprava a vlastnosti proteolytického kry-tu na raný, je popísaná na báze peirlovejcelulózy modifikované] v oxidačnom stupnina polyaldehyd a následnom naviazaní pro-teolyfického enzýmu primárnou amínosiku-pinou na aildehydidkú funkciu celulózy akonečne stabilizáciou Schiffove] vazby me-dzi enzýmom a hydrofilným nosičem reduk-ciou AO č. 249 311.

Uvedený postup iprípravy proteolytickéhokrytu na runy je technicky náročný, predo-všetkým s ohladom na použité chemikálie,nízké výtažky pri imobilizácii enzýmovýchpreparátov a ipotrebu stabilizácie vznikajú-ciclh schiffových vázieb.

Nevýhodou je nutnost použitia náročnýchmetod sušenia připraveného preparátu lyo-filizáciou, ako a] skutočnosť, že pri použitíuvedeného preparátu dochádza k odstráne-niu v rané přítomných baktérií len fyzikál-nou cestou — ich sorpciou do vnútornejštruktúry gélu.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že práš-kový polysacharid, ako škrob, celulóza,agar, lichenan s vefkosťou častíc 0,006 až0,3 mm zosietený s 2-chlórmetyloxiránom na " hydrofilný géí' o' stupni napúčania 4 až15 ml. g-1 sa aktivuje pri teplote 10 až 25stupňov C po dobu 2 až 4 h, v přítomnostihydroxidu sodného 2-chlórmetyloxiránom,načo sa aktivovaný gél obsahujúci 0,05 až0,3 mimól. g_1 oxiranových funkčných sku-pin premyje do neutrálnej reakcie a nechása reagovat s roztokom proteolytických en-zýmov aiko chymotrypsín, trypsin, substili-zín a lysozým v pomere aktivit proteolytic-kýich enzýmov k lyozýmu 2 až 4 ku 1, priteplote 20 až 40 °C po dobu 3 až 6 h, načosa polysacharidový gél s naviazanými en-zýmaimi zbaví volných enzýmov premýva-ním, nato sa gél odvodní premývaním orga-nickým rozpúšťadlom, s výhodou etanoloma/ailebo acetónom a suchý gél sa nakoniecsterilizuje rádioaktívným χ-žiarením.

Biologicky aktívny kryt na raný připra-vený na báze sletovaných polysacharidovmožno sušit odpařením nadbytečného obsa-hu vody vo válkuovej odparike alebo odsá-tím nadlbytočnej vody na frite a suspendo-váním čiastočieik gélu polysacharidu v eta-nole, alebo v acetone a po odstranění nad-bytočného množstva organického rozpúš-ťadla dalším vysušením gélu na vákuovejodiparke pri teplote 40 až 60 °C na zvyškovúvlhkost 30 až 50 mg vody na 1 g gélu.

Takto, připravený a vysušený biologickyaktívny kryt na raný zaručuje snadnú ma-nipulovateínosť vo výrobě a pri použití, rov-noměrný tok pudru pri aplikácii na ránu,zamedzenie vstupu gélu a enzýmových pro-teínov do krvného oběhu a nepřítomnost'malých čiastočiek, tzv. fines frakcie gélubiopolyméru. Částice o velkosti 0,06 až 0,3 mm sa ne-zachytávajú v povrchovej štruktúre raný.Lýzu mikroflóry Gram pozitívnych baktériízodpovědných za hnisavý charakter rán za-bezpečuje imobilizovaný lysozým. Sorpčnáschopnost nosného gélu je až 15 ml. g-1,čo je podstatné viac ako sorpčná schopnost'natívnych biopolymérov alebo perlovej ce-lulózy.

Pri aplikácii biologicky aktívneho krytuna raný, připraveného na báze mobilizova-ného chyímotrypsínu alebo trypsinu a lyso-zýmu na géli zo sietovanej celulózy, hydro-xyetylcelulózy, škrobu alebo agaru sa pozo-roval výrazný proteolytioký účinok na ne-krotické tkanivo charakterizovaný 300 až600 mg hydrolyzovaného proteinu (albuminhovadzieho alebo 1'udského séra, denaturo-vaný kolagén) 1 g suchéj hmotnosti géluza 1 hodinu.

Použité gély preukázali vysokú sorpčnúschopnost pri nasávaní exudátov z raný (až15 g exudátu na 1 g suchej hmotnosti gélu)a imobilizovaný lysozým spósobil poklessledovaných stafylokokov a streptoikokov o95 % (charakterizované 150 mg lyžovanýchbunisk Micrococcus luteuis a až 100 mgStaphyloicoccus aureus v suchej hmotnostiza 1 hodinu 1 g suchej hmotnosti gélu). 2300X8 Příklad 1 100 g mikroikryštalickej celulózy zosiete-nej is 10 % hmot. 2-chilórmetyloxiránom snapúčacím objemom 5 ml. g_1 a velikasťoučastíc 0,05 až 0,3 mm sa alkalizuje 1 h priteplote 20 °C so· 100 ml vodného roztekuhydroxidu sodného o koncentrácii 20 %hmotnostnýcih. Potom sa přidá k reakčnejzmesi 25 ml 2-ohlór,metyloxi'?ánu a nechá sareagovat 6 h pri teplote 15 C za stálého•miešania. Ďalej sa rekčná zmes neutralizuje vodnýmroztokom kyseliny octovej na indikátor fe-nolftalein, vzniklé soli sa vymyjú destilo-vanou vodou. Po vymytí nezareagovanýchchemikálií sa přidá k vymytému gelu roztokchymotrypsínu a lysozýmu vo fosfátovomtlmivom roztoku (10 mmól.l-1, pH 7,6,300 ml) o aktivitě chymotrypsínu 1 300 mghydrolyzovaného albuminu hovadzieho séraza 1 Ih a aktivitě lysozýmu 650 mg lýzova-ných buniek Micrococcus luteus za 1 ,h. Tak-to připravená suspenzia sa nechá protrepá-vať na recítprokej trepačke (frekvencia 1 Hz,amplituda 20 cm) po dobu 6 h při teplote20 °C.

Nezreagovaný chymoteypsín a lysozým savymývali 2 000 ml fosfátového tlmivého roz-toku o pH 7,6 (10 mmól.l-1), potom 2 000miililitrov citrát fosfátového roztoku 50mmól.il-1; pH 5,5) a nakoniec destilovanouvodou (4 000 ml). Odvodnenie gelu sa za-bezpečilo postupným vymýváním gélu zme-sou etanol—voda (1 000 ml:, najprv 30 ob-jemových dielov etanolu a 70 objemovýchdielov vody; ďalej 70 objemových 'dielovetanolu a 30 objemových dielov vody a na-koniec 96 objemovými dielmi etanolu a 4objemovými dielami vody).

Odvodněný gel sa vysušil najprv na vzdu-chu a potom v rotačnej vákuovej odparkepri teplote 50 "C. Sterilizácia hotového· ipro-teolytickéhc· krytu na raný sa zabezpečilagama-žiarením, dávkou 25 kGy v polyety-lénových zatavených vreckách. Takto při-pravený .piroteolytický kryt neobsahoval vol-né oxiránové skupiny ani netán i zo váné for-my chlóru. Nezreagovaný 2-chlórmetyl obí-rán sa rozložil jednak na glycerol a ten savymyl pri spracovaní gélu. Nezreagovanýmetyloxiránový substituent ha povrchu géluzhydrolyzoval na 1,2-dihydroxypropy.lovýsubstituent. Příklad 2 že aiko polysacharid sa ipoužije práškováhydroxyetylcelulóza zosietená s 2-c,hlórme-tyioxiránom na napúčací Objem 15 ml. g“1a aktivácia s 2-chlórmetyloxiránom sa pre- vádza pri teplote 25 C,C po dobu 3 h. Příklad 3

Postup pódia příkladu 1 s tým rozdielom,že ako enzýmový nosič sa použije sieťovanýagar s ,2-chlórmetyloxiránoim o stupni sie-ťovania 0,03 priečnych vazieb na jednu an-hydroglukozytovú jednotku a napúčacomobjeme 15 ml. g-1. K imobilizácii sa použilazmes subtilizínu a lysozýmu v pomerochlak, ako je uvedené v pcíklade 1. Vysušenýpreparát línal aktivitu 300 mg hydrolyzova-ného· albuminu hovadzieho séra za 1 h na1 g suchej hmotnosti a 150 mg suchých bu-niek Micrococcus luteus lyžovaných za 1 h1 g imobilizovaného preparátu pri 37 C. Příklad 4

Postupuje sa pódia .příkladu 1 s tým roz-dielom, že k imobilizácii sa použije papína ako enzýmový .nosič sa použil zemiakovýškrob sieťovaný 2-chtármetyloxi,ránom nanapúčací objem 5 ml. g-1. Naviazanie en-zymu .prebehlo pri teplote 40 C po dobu3 b. Odvodnenie sa zabezpečilo·, ako je uve-dené v příklade 1 s tým rozdielom, že sapoužili vodné roztoky acetánu. Výsledný en-zýmový preparát mal aktivitu imobilizova-ného papaínu 50 mg hydrolyzovaného albu-minu hovadzieho séra za 1 h na 1 g a 12,5miligramov lýzovaných buniek Micrococcusluteus za 1 h na 1 g suchého preparátu priteplote 37 ’C. P r í k 1 a d 5

Postupuje sa ako v příklade 1 s tým roz-dielom, že ako nosič sa použije sieťovanýa-l,4,6-glukan-pululán o stupni sieťovania0,03 a napúčacom objeme 15 ml. g_1. Vý-sledná aktivita imdbilizovaných enzýmovýchpreparátov bola 290 mg hydrolyzovanéhoalbuminu hovadzieho séra za 1 h na 1 g su-chej hmotnosti a 143 mg lýzovaných buniekMicrococcus luteus za 1 b na 1 g suchéhoimobilizovaného preparátu. 'Vynález má případné využifie na chirur-gických oddeleniach, na klinikách speciali-zovaných na civilně a profesionálně úrazy,ale aj vo veterinárnom lekárstve.

Postup podfa příkladu 1 s tým rozdielom,

Claims (1)

1. 250018 P R E D Μ Ε Τ Spósob přípravy biologicky aktív,něho kry-tu na raný vyznačený tým, že práškový po-lysaoharid, alko škrob, celulóza, agar, liche-nan s velkosťou častíc 0,06 až 0,3 mm zo-sietený :s 2-chlórmetyloxiránom na hydrofil-ný gól o stupni napúčania 4 až 15 ml. g"1sa aktivuje při teplote 10 až 25 °C po· dobu2 až 4 h v přítomnosti hydroxidu sodnéhos 2-chlórmety,loxiránom, načo sa aktivovanýgél obsahujúci 0,05 až 0,3 mmól. g_1 oxirá-nových funkČných skupin premyje do ne-utrálnej reakcie a nechá sa reagovat s roz- VYNALEZU tokom proteolytických enzýmov, ako chymo-trypsín, trypsin, subtilizín a lysozým v po-měre aktivit proteolytických enzýmov k ly-sozýmu 2 až 4 ku 1, pri teplote ,20 až 40 °Cpo dobu 3 až 6 h, nač osa polysacharldovýgél s naviazanými enzýmami zbaví volnýchenzýmov pre,mýváním, na to sa gél odvodnípremývaním organických rozpúšťadlom, svýhodou etanolom a/alebo acetónom a su-chý gél sa nakoniec sterilizuje rádioaktív-nym y-žiarením. Severografla, n. p., závod 7, Most Cena 2,40 Kčs