CS250018B1 - Sposob přípravy biologicky aktívneho krytu na raný - Google Patents

Abstract

Účelom riešenia je spůsob přípravy biologicky aktívneho krytu na raný. Uvedeného účelu sa dosiahne tak, že práškový polysacharid ako škrob, celulóza, agar, lichenan s velkosťou častíc 0,06 až 0,3 mm zosietený s 2-chlórmetyloxiránom na hydírofilný gél o stuipni napúčania 4 až 15 ml. g"1 sa aktivuje 2-chlórmetyloxiránam a po aktivácii sa na vzniklé oxiránové skupiny chemicky naviažu proteolytické enzymy, ako chymotrypsín, trypsin, subtiilizín a lysozým, potom sa z gelu odstránia neviazané enzýmy premývaním a premytý gél sa odvodní organickým rozpúšťadlom a po jeho odpaření sa práškový produkt sterilizuje rádioaktívnym χ-žiarením. Prípravqk může nájsť využitie na chirurgických oddeleniach, na klinikách Specializovaných na civilně a profesionálně úrazy a vo veterinárnom lekárstve

Description

Vynález sa týká spósobu přípravy bfokk gicky aktívneho krytu na raný vo formě zásypu.

Pre účely oše trenia povrchoyých rán sav medicinálnej praxi bežne používajú zásypy připravené zo škrabu, mastenoa alebo iných galeniďkých základov a účinnej zložky s haktericidným účinkom, ako například antibiotiká, suilfoamidy a pod. Pri ošetření hnisavých a nekrotických rán sa v poslednej době zdórazňuje sorpčný účinek niektorých polymérov, ktoré sú schopné vďaka svojmu hydrofilnému charakteru odotoerať tekutiny z povrchu raný nasáváním exudátu, baktérií a ich metabolitov do kapilár vnútornej štruktúry gélu.

Tieto vlastnosti majú přípravky zhotovené na báze sieťovaného a-l,6-gilu,kánu, dextránu [B. S. Jacobson: Scand. J. Plast. Reconsťr. Surg. 10, 65 až 72 (1976)], alebo celulózy derivatizovanej v substitučně] reakcii na éter [DTA 1 932 753],

V poslednej době sa účinnost takto připravených zásypov ďalej zvyšuje naviazaním enzýmov zo skupiny hydroláz s proieolytickou účinnosťou na-?poycch· modifikovaného biopolyméru kovalentnou vazbou. [Immobilizovanyje proteolytičeskije fermenty v liečenii gnojmo-nekrotičeských procesov, sborník rabót, AN ZSSR, Sibirsikoje otdelenije, Institut citologii i genetik!, Novosibirsk (1981).)

Přítomnost imobilizovaných proteáz v takto upravených preparátech sposobuje rozklad nekrotického tkaniva v blízkosti raný a hnisu na jej povrchu, pričom takto vytvořené rozkladné produkty hydrofílný gél nasáva do svojej vnútornej štruktúry, čím sa súčasne odstraňuje prostredie pre rozmnožovanie baktérií a znemožní sa prienik toxínov do organizmu.

Příprava a vlastnosti proteolytického krytu na raný, je popísaná na báze peirlovej celulózy modif ikovanej v oxidačnom stupni na polyaldehyd a následnom naviazaní proteolytického enzýmu primárnou amínoskupinou na aildehydidkú funkciu celulózy a konečne stabilizáclou Schiffovej vazby medzi enzýmom a hydrofilným nosičom redukciou AO č. 249 311.

Uvedený postup přípravy proteolytického krytu na raný je technicky náročný, predovšetkým s ohladom na použité chemikálie, nízké výťažky pri imobilizácii enzýmových preparátov a potřebu stabilizácie 'vznikajúcich schiffových vázieb.

Nevýhodou je nutnost použitia náročných metod sušenia připraveného preparátu lyofilizáciou, ako aj skutočnosť, že pri použití uvedeného preparátu dochádza k odstráneniu v rané přítomných baktérií len fyzikálnou cestou — ich sorpciou do vnútornej štruktúry gélu.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že práškový polysacharid, ako škrob, celulóza, agar, lichenan s velkosťou častíc 0,006 až 0,3 mm zosietený s 2-chlórmetyloxiránom na liydrófilný géí' o' stupni napúčania 4 až 15 ml. g^-1 sa aktivuje pri teplote 10 až 25 stupňov C po dobu 2 až 4 h, v přítomnosti hydroxidu sodného 2-chlórmetyloxiránom, načo sa aktivovaný gél obsahujúci 0,05 až 0,3 mmól. g^_1 oxiranových funkčných skupin premyje do neutrálnej reakcie a nechá sa reagovat s roztokom proteolytických enzýmov ako chymotrypsín, trypsin, substilizín a lysozým v pomere aktivit proteolytických enzýmov k lyozýmu 2 až 4 ku 1, pri teplote 20 až 40 °C po dobu 3 až 6 h, načo sa polysacharidový gél s naviazanými enzýmaiml zbaví volných enzýmov premývaním, nato sa gél odvodní premývaním organickým rozpúštadlom, s výhodou etanolom a/alebo acetónom a suchý gél sa nakoniec sterilizuje rádioaktívnym χ-žiarením.

Biologicky aktívny kryt na raný připravený na báze sieťovaných polysacharidov možno sušit odpařením nadbytočného obsahu vody vo vákuovej odparike alebo odsátím nadlbytočnej vody na frite a suspendováním čiastočiek gélu polysacharidu v etanole, alebo v acetone a po odstránení nadbytočného množstva organického rozpúšťadla dalším vysušením gélu na vákuovej odiparke pri teplote 40 až 60 °C na zvyškovú vlhkost 30 až 50 mg vody na 1 g gélu.

Takto· připravený a vysušený biologicky aktívny kryt na raný zaručuje snaďnú manipulovatefnosť vo výrobě a pri použití, rovnoměrný tok pudru pri aplikácii na ránu, zamedzenie vstupu gélu a enzýmových proteínov do krvného oběhu a nepřítomnost malých čiastočiek, tzv. fines frakcie gélu biopolyméru.

Častíce o velkosti 0,06 až 0,3 mm sa nezachytávajú v povrchovej štruktúre raný. Lýzu mikroflóry Gram pozitívnych baktérií zodpovědných za hnisavý charakter rán zabezpečuje imobilizovaný lysozým. Sorpčná schopnost nosného gélu je až 15 ml. g^-1, čo je podstatné viac ako sorpčná schopnost' natívnych biopolymérov alebo perlovej celulózy.

Pri aplikácii biologicky aktívneho krytu na raný, připraveného na báze mobilizovaného chymotrypsínu alebo trypsinu a lysozýmu na géli zo siefovanej celulózy, hydroxyetylcelulózy, škrobu alebo agaru sa pozoroval výrazný proteolytický účinok na nekrotické tkanivo charakterizovaný 300 až 600 mg hydrolyzovaného proteinu (albumin hovadzielho alebo 1'udského séra, denaturovaný kolagén) 1 g suchej hmotnosti gélu za 1 hodinu.

Použité gély preukázali vysokú sorpčnú •schopnost pri nasávaní exudátov z raný (až 15 g exudátu na 1 g suchej hmotnosti gélu.) a imobilizovaný lysozým spósobil pokles sledovaných stafylokokov a streptoikokov o 95 % (charakterizované 150 mg lyžovaných bunisk Micrococcus luteuis a až 100 mg Staphyloicoccus aureus v suchej hmotnosti za 1 hodinu 1 g suchej hmotnosti gélu).

S Β O 1 8

Příklad 1

100 g mikroikryštalickej celulózy zosietenej is 10 % hmot. 2-chilórmetyloxiránom s napúčacím objemem 5 ml. g^-1 a velikostem častíc 0,05 až 0,3 mm sa alkalizuje 1 h pri teplote 20 °C so· 100 ml vodného· rozteku hydroxidu sodného o koncentrácii 20 % hmotnostných. Potom sa .přidá k reakčnej zmesi 25 ml 2-iohlór,metyloxi'ránu a nechá sa reagovat 6 h pri teplote 15 C za stálého •miešania.

Ďalej sa rekčná zmes neutralizuje vodným roztokom kyseliny octovej na indikátor fenolftalein, vzniklé soli sa vymyjú destilovanou vodou. Po vymyti nezreagovaných chemikálií sa přidá k vymytému gelu roztok chymotrypsínu a lysozýmu vo fosfátovom tlmivom roztoku (10 mmól.il^-1, pH 7,6, 300 ml) o aktivitě chymotrypsínu 1 300 mg hydrolyzovaného albuminu hovadzieho séra za 1 Ih a aktivitě lysozýmu 650 mg lýzovaných buniek Micrococcus luteus za 1 ,h. Takto připravená suspenzia sa nechá .pretrepávať na recítprokej trepačke (frekvencia 1 Hz, amplituda 20 cm) po dobu 6 h při teplote 20 °C.

Nezreagovaný chymotoypsín a lysozým sa vymývali 2 000 ml fosfátového tlmivého roztoku o pH 7,6 (10 mmól.l^-1), potom 2 000 mililitrov citrát fosfátového roztoku 50 mmól.l^-1; pH 5,5j a nakoniec destilovanou vodou (4 000 ml). Odvodnenie gelu sa zabezpečilo postupným vymýváním gélu zmesou etanol—voda (1 000 ml:, najprv 30 objemových dielov etanolu a 70 objemových dielov vody; ďalej 70 objemových .dielov etanolu a 30 objemových dielov vody a nakoniec 96 obje,mo<vými dielmi etanolu a 4 objemovými dielami vody).

Odvodněný gel sa vysušil najprv na vzduchu a potom v rotačnej vákuovej odparke pri teplote 50 C. Sterilizácia hotového iproteolytického krytu na raný sa zabezpečila gama-žiarením, dávkou 25 kGy v .polyetylénových zatavených vreckách. Takto připravený .proteolytický kryt neobsahoval volné oxiránové skupiny ani netán i zo váné formy chlóru. Nezreagovaný 2-chlórmetytá'Xirán sa rozložil jednak na glycerol a ten sa vymyl pri spracovaní gélu. Nezreagovaný metyloxiránový substituent .na povrchu gélu zhydrolyzoval na l,2-dihydroxyp,ropylový substituent.

Příklad 2 že ako polysacharid sa (použije prášková hydroxyefylcelulóza zosietená s 2-c.hlórmetyioxiránom na napúčací objem 15 ml. g^-1 a aktivácia s 2-chiórmetyloxiránom sa prevádza .pri teplote 25 ^C,C po dobu 3 h.

Příklad 3

Postup podfa příkladu 1 s tým rozdielom, že ako enzýmový nosič sa použije siefovaný agar s ,2-chlórmetyloxiránoini o stupni sletová,nia 0,03 priečnych vazieb na jednu anhydroglukozytovú jednotku a napúčacom objeme 15 ml. g^-1. K imobilizácii sa použila zmes subtilizínu a lysozýmu v pomertích tak, ako je uvedené v pofklade 1. Vysušený preparát .mal aktivitu 300 mg hydrolyzovanáho albuminu hovadzieho séra za 1 h na 1 g suchej hmotnosti a 150 mg suchých bunielk Micrococcus luteus lyžovaných za 1 h 1 g imobilizovaného preparátu pri 37 C.

Příklad 4

Postupuje sa podfa .příkladu 1 s tým rozdielom, že k imobilizácii sa použije papín a ako enzýmový .nosič sa použil zemiakový škrob sletovaný 2-chlórmety.loxiránom na napúčací objem 5 ml. g^-1. Naviazanie enzymu prebehlo pri teplote 40 C po dobu 3 h. Odvodnenie sa zabezpečilo., ako je uvedené v příklade 1 s tým rozdielom, že sa použili vodné roztoky acetonu. Výsledný enzýmový preparát mal aktivitu imobilizovaného .papaínu 50 mg hydrolyzovaného· albuminu hovadzieho séra za 1 h na 1 g a 12,5 miligramov lýzovauých buniek Micrococcus luteus za 1 h na 1 g suchého preparátu pri teplote 37 ’C.

P r í k 1 a d 5

Postupuje sa ako v příklade 1 s tým rozdielom, že ako nosič sa použije siefovaný a-l,4,6-glukan-pululán o stupni sieťovania 0,03 a napúčacom objeme 15 ml. g^-1. Výsledná aktivita imobilizovaných enzýmových preparátov bola 290 mg hydrolyzovaného albuminu hovadzieho séra za 1 h na 1 g suchej hmotnosti a 143 mg lýzovauých buniek Micrococcus luteus za 1 h na 1 g suchého imobilizovaného preparátu.

'Vynález má případné využitie na chirurgických oddeleniach, na klinikách specializovaných na civilně a profesionálně úrazy, ale aj vo veterinárnom lekárstve.

Postup podfa příkladu 1 s tým rozdielom,

Claims (1)

1. Sposob přípravy biologicky aktívneho· krytu na raný vyznačený tým, že práškový polysaoharid, ako škrob, celulóza, agar, lichenan s vetkosťou častíc 0,06 až 0,3 mm zosietený :s 2-chlórmetyloxiiránom na hydrofilný gél o stupni napúčania 4 až 15 ml. g^-1 sa aktivuje při teplote 10 až 25 °C po· dobu 2 až 4 h v přítomnosti hydroxidu sodného s 2-chlórmety,loxlránom, načo sa aktivovaný gél obsahujúci 0,05 až 0,3 mmól. g^-1 oxiránových funkčných skupin pre,myje do neulrálnej reakcie a nechá sa reagovat s rozVYNALEZU tokom proteolytických enzýmov, ako chymotrypsín, trypsin, subtilizín a lysozým v pomere aktivit proteolytických enzýmov k lysozýmu 2 až 4 ku 1, pri teplote 20 až 40 °C po dobu 3 až 6 h, nač osa polysacharldový gél s naviazanými enzýmaml zbaví volných enzýmov pre,mýváním, na to sa gél odvodní premývaním organických rozpúšťadlom, s výhodou etamolom a/alebo acetónom a suchý gél sa nakoniec sterilizuje rádioaktívnym y-žiarením.