CS250277B1 - Způsob výroby kyseliny glukonové a jejích solí - Google Patents

Abstract

Řeší se způsob výroby kyseliny glukonové a jejích solí v submersní kultuře plísně Aspergillus foetidus var. pailidus konverzí glukózového1 substrátu. Výhodou tohoto způsobu je, že za pomoci vysokoprodukčního kmene Aspergillus foetidus var. pailidus AN 166 se dosahuje vyšších výtěžností a lze zpracovávat i vysoce koncentrované cukernaté substráty (až 40 % hmot.).

Description

Vynález se týká způsobu přípravy kyseliny glukonové a jejích solí v submersní kultuře plísně Asperglllu foetidus var. pallidus konverzí cukernatého substrátu.

Kyselina glukonová a její soli nacházejí stále častěji využití, např. jako antikorozní prostředky při povrchové úpravě kovů, dále v čisticích, leštících a galvanizačních lázních pro kovové předměty, k odstraňování usazenin v nádobách a potrubích, jako aditiva v barvářském přůmyslu, přísady do betonu, ve farmacii a v řadě dalších aplikací.

Biologická oxidace glukózy a některých dalších sacharidů, obsahujících vázanou glukózu, je známa již dlouhou dobu. K tomuto účelu byly použity bakterie rodů Pseudomonas a Acetobacter [Humphrey A. E., Reilly P. J., Biotechnol. Bioeng. 7 : 229 (1965),; Nyeste etal., Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 10:87 (1980),; Currie J. N., U. S. Patent č. 1896 811], avšak daleko více jsou používány plísně, především rodů Aspergillus a Penicillium [Currie J. N. etal., U. S. Patent č. 1 893 819 (1930); Zlffer J. etal., DE 18 17 907 (1968); Porges N. etal., Ind. Eng. Chem. 33: 1065 (1941)], neboť u nich nedochází k další oxidaci kyseliny glukonpvé a tím ke snižování její Výtěžnosti.

Je známo, že na rychlost tvorby kyseliny glukonové a její výtěžnost má vliv koncentrace rozpuštěného kyslíku, případně rychlost jeho přestupu do fermentačního média, koncentrace vodíkových lontů v médiu a kvalita dusíkatého zdroje, kromě dalších méně výrazných faktorů.

Ovlivnění rychlosti přestupu kyslíku do fermentačního média naráží na určité problémy. Zvyšování frekvence míchadla je limitováno mechanickou pevností použitého mikroorganismu, zvyšování aerační rychlossti je limitováno pěnivostí kultivačního média. Zvýšení rozpustnosti kyslíku zvýšením tlaku v systému [Herrick Η. T. etal., Ind. Eng. Chem. 27: 681 (1935)] vede k technickým a konstrukčním potížím.

Vliv koncentrace vodíkových iontů je znám a existuje úzké optimum, kdy je syntéza kyseliny glukonové nejrychlejší.

Kyselina glukonová je v kulturách plísní tvořena účinkem enzymu glukózaoxidázy (/3-D-glukóza : Oz cxidioireduktáza, E. C. 1. 1. 3. 4.) na glukózu v přítomnosti kyslíku. Pro optimální průběh procesu je tedy zapotřebí, aby použitý mikroorganismus vytvářel co nejvyšší poměrné množství glukózaoxidázy.

Podstatou způsobu přípravy kyseliny glukonové a jejích solí podle vynálezu je, že se kultivuje mutanta plísně Aspergillus foetidus var. pallidus AN 166, jejíž sporové inokulum se buď přímo zaočkuje do produkčního fermentoru, nebo předtím do inokulačního tančíku tak, aby výsledná koncentrace sporové suspenze odpovídala extinkční konstantě E420 = 0,005 až 0,02, načež se mutanta kultivuje při teplotě 25 až 35 °C při koncentraci vodíkových iontů, udržované přídavky alkalicky reagujících roztoků, zejména NaOH, KOH, NHáOH, Na2CO3, na hodnotě pH 5,0 — 7,0 v roztoku 5 až 40 % hmot. glukózového substrátu.

Mutanta tohoto mikroorganismu je uložena ve Sbírce mikroorganismů CCF pod číslem 1889 a je předmětem přihlášky vynálezu. Tato mutanta vytváří za vhodných kultivačních podmínek velké množství enzymu glukózaoxidázy.

Po provedené fermentaci se buněčná hmota mikroorganismu odseparuje od kapalného podílu kultivačního média a opakovaně použije pro konverzi glukózového substrátu.

Nejpodstatnější vliv na rychlost produkce kyseliny glukonové a její výtěžnost má zdroj dusíku.

Změnou kvalitativního složení a celkovým množstvím dusíkatého zdroje byl řízen proces tak, aby byl optimální pro dva základní typy přípravy kyseliny glukonové:

a) pro jednorázovou fermentaci glukózových roztoků, kdy je zapotřebí co· nejmenší množství buněčné hmoty s nejvyšší možnou specifickou aktivitou glukózaoxidázy z důvodu maximální výtěžnosti kyseliny glukonové;

b) pro fermentaci s opakovaným použitím odseparované buněčné hmoty, kdy pro racionální postup je zapotřebí pracovat s vyšší koncentrací buněčné hmoty; ztráty uhlíkatého zdroje dané tvorbou buněčné hmoty jsou relativně nižší.

Pro zaočkování fermentačních nádob se používá sporového, případně vegetativního inokula. Jeho množství nezávisí na hmotnostním množství glukózového zdroje, ale pouze na objemu fermentačního média.

V případě sporového inokula se použije takového množství spor používaného mikroorganismu spláchnutých 0,1% roztokem Tweenu 80, aby jejich koncentrace v médiu na počátku fermentace měřená jako extinkce při vlnové délce 420 nm dosahovala hodnoty E420 = 0,005 až 0,02.

Vegetativní inokulum připravené naklíčením spor v koncentraci odpovídající E420 — — 0,05 až 0,2 se dávkuje do fermentačního média v množství 3 až 10 % celkového objemu, což odpovídá výchozí sušině při fermentaci 0,05 až 0,1 mg/ml.

Příprava kyseliny glukonové podle způsobu dle vynálezu je dále uvedena v následujících příkladech.

Příklad 1

Příprava inokula:

Použije se spor plísně Aspergillus foetidus var. pallidus AN 166, rostoucí 7 dní na sladinovém agaru na Petriho miskách o průměru 15 cm, odkud se spláchnou 50 ml 0,1% hmot. povrchové aktivní látky na bázi este250277 rů mastných kyselin (Tweenu 80). Těmito slitými suspenzemi spor se zaočkuje 150 1 média ve fermeritačním tanku. Počet misek se volí tak, aby objem sporového inokula představoval 2 až 4 % objemu fermentačního média. Po dvanácti hodinách slabého vzdušnění, (0,1 objemu vzduchu na 1 objem média za 1 minutu), kdy spory nakličují při teplotě 30 °C, se upraví fyzikální podmínky pro vlastní fermentaci, tj. zvýší se aerace a spustí míchadlo.

Příprava fermentačního média:

Připraví se sterilní fermentační médium o složení (v % hmot.):

% glukózy,

0,025 % KC1,

0,025 % KH2PO4,

0,025 % MgSCU . 7 H2O,

0,1 % Ca(NO3)2.4 H2O,

0,056 % (NH4)2SO2.

Oprava pH během fermentace se provádí přídavky 20% roztoku NaOH nebo Na2CO3.

Vlastní fermentace se provádí v nerezovém tanku s centrálně umístěným mechanickým míchadlem turbinového typu. Objem fermentačního média 150 1, míchání 400 ot/ /'min, aerace 75 1/min, teplota 30 °C, pH se kontinuálně upravuje na hodnotu 6,0. Doba fermentace včetně nakličovací fáze je 40 až 45 hodin. Fermentace, jejímž výsledkem je sodná sůl kyseliny glukonové, umožňuje dosažení výtěžnosti 90 až 95 % hmot. kyseliny glukonové na vnesený cukr. Jiné organické kyseliny se netvoří.

Příklad 2

Příprava inokula:

Sporami ze sladinového agaru se zaočkují propagační tanky (objem média 2,5 1) obsahující médium o složení uvedeném v příkladu 1, u něhož je pouze sníženo procento glukózy na 5 % hmot. Kultivuje se při pH 6,0, teplotě 30 °C, 1000 ot/min a aeraci 1 1/ /min na 1 1 média. Takto vypěstovaným vegetativním inokulem se očkuje vlastní fermentační tank. Množství inokula se používá 5 až 10 % obj. Všechny fermentační parametry, složení média i výtěžnost jsou stejné jako u příkladu 1. Doba fermentace je 28 až 30 hodin.

Příklad 3

Příprava inokula:

Je možno postupovat oběma způsoby popsanými v příkladech 1 a 2.

Příprava fermentačního média:

Sterilní půda obsahuje:

0,2 % hmot. Ca(NO3)2.4 H2O,

0,11 % (NH4)2SO4, ostatní chemikálie se dávkují stejně jako u příkladu 1. Množství inokula je 10 % obj.

Po skončení fermentace se odseparuje mycelium, které se opakovaně použije ke konverzi glukózy na kyselinu glukonovou v minerálním médiu o složení (% hmot.):

% glukózy,

0,025 % KH2PO4 a

0,1 % CaCl2 za stejných fyzikálních podmínek.

Ve všech uvedených případech je možno glukózu jako zdroj uhlíku nahradit některým jiným cukerným substrátem (například sacharózou, maltózou a podobně).

Claims (2)

1. Způsob výroby kyseliny glukonové a jejich solí v submerzní kultuře plísně Aspergillus foetidus var. pallidus konverzí glukosového substrátu vyznačený tím, že se kultivuje mutanta tohoto mikroorganismu AN 166, jejíž sporové inokulum v množství odpovídajícím objemu fermentačního média se buď přímo· zaočkuje do produkčního fermentoru, nebo předtím do Inokulačního tančíku tak, aby výsledná koncentrace sporové suspenze odpovídala extinkční konstantě E420

VYNÁLEZU se rovná 0,005 až 0,02, načež se mutanta kultivuje při teplotě 25 až 35 °C a hodnotě pH 5,0 až 7,0 v rozsahu 5 až 40 % hmot. glukózového substrátu.

2. Způsob výroby podle bodu 1, vyznačený tím, že po provedené fermentaci se buněčná hmota mikroorganismu odseparuje od kapalného podílu kultivačního média a opakovaně použije pro konverzi glukózového substrátu.