CS259439B1 - Způsob výroby směsi fruktózy a kyseliny glukónové a jiejieb solí v submerzní kultuře phsně Aspergillus foetidus var. pallidus konverzí sacharózového substrátu - Google Patents

Abstract

Způsob výroby směsi fruktózy a kyseliny glukónové a jejích solí v suhmerzní kultuře plísně Aspergillus foetidus var. pallidus konverzí sacharózového substrátu. Sporové inokulum mutanty CCF 1889 tohoto» kmene se buď přímo zaočkuje do produkčního fermentoru, nebo předtím do inokulačníha tančíku, v němž se připraví vegetativní inokulum, jímž se zaočkuje produkční fermentor, načež se mutanta kultivuje při teplotě 25 až 30 °C na hodnotě pH 5,0 — až 7,0 v roztoku obsahujícím 5 až 50 % hmot. sacharózy nebo produktů, meziproduktů a odpadů z výroby sacharózy, zejména afinády, rafinády, lehké a těžké šťávy, kléru a melasy. Výhodou tohoto způsobu je, že za pomoci vysokoprodukčního kmene Aspergillus foetidus var. pallidus CCF 1889 se dosahuje vyšších výtěžností, lze zpracovávat nejen sacharózu, ale i vysoce koncentrované sacharózové substráty, meziprodukty i odpadní látky z výroby sacharózy až do 50 % hmot. Oba produkty kultivace tvoří směs, jejíž složky jdou od sebe snadno oddělit, přičemž vzniklý fruktózový sirup neobsahuje téměř žádné balastní příměsi glukózy a sacharózy.

Description

Vynález se týká způsobu výroby směsi fruktózy a kyseliny glukónové a jejích solí v submerzní kultuře plísně Aspergilus foetidus var. pallidus konverzí sacharózového substrátu.

Oba uvedené produkty, fruktóza i kyselina glukónová ev. její soli jsou žádanými produkty v řadě průmyslových odvětví. Fruktóza se v nejnovější době využívá především pro svoje významné organoteptické a dietetické vlastnosti * v potravinářství, kyselina glukónová ev. její soli se používá ve stavebnictví, barvářském průmyslu, ve farmacii a v četných aplikacích, využívajících jejího protikorózního komplexotvorného a rozpouštěcího působení.

Jsou známy způsoby přípravy fruktózových sirupů (tj. směsi fruktózy s glukózou) případně i čisté fruktózy konverzí glukózy působením enzymu glukózaisomerázy, případně mikroorganismů majících zvýšený obsah tohoto enzymu (kvasinky, mléčné bakterie, streptomycetyj, obvykle v imobilizované formě. (Barrett S.P. etal., US pat. 4 2888 548, 1981; Heady R. E. US pat. 4 276 379, 1982; US pat. 4 317 880, 1982; Demnerová K. etal., Chem. listy 78, 199—210/1984). Obchodní preparáty fruktózo-glukózových sirupů (,,Isomerose“, „Isosyrup“ „Cornsweet“, „Isoswet“), získávané tímto· způsobem obvykle z hydrolyzátů škrobnatých surovin, obsahující 42—55 % fruktózy. Podobně lze získat směs fruktózy a glukózy ze sacharózy pomocí enzymu invertázy nebo mikroorganismů se zvýšeným obsahem tohoto enzymu (kvasinky), opět v imobilizované formě. [Ajimifo Co., Jap. pat. 82 163484; Jugnickel F., Ger. pat. NDR 15 8040, 1982; Švec F. etal. čs. AO 189 302, 1982; Hradil J. etal. čs. AO 204 643, 1982; Bareš M. etal. čs. AO 187 815, 1981; Imail K. etal. Biotechnol. Bioeng. 25, 613-7, (1983); Hradil J., Švec F. Enzyme Microb. Technol. 3, 336 až 40, (1981), ibid. 3, 331 až 5/1981]. V těchto případech se obsah fruktózy v konečném produktu pohybuje kolem 50 °/o.

Z hlediska použití těchto fruktózo-glukózových sirupů představuje obsah glukózy v podstatě balastní složku a je snaha jej snížit na co nejmenší míru. Vzhledem k velmi podobnému chemickému složení obou sacharidů i k podobným fyzikálněchemickým vlastnostem je jejich dělení ovšem obtížné. Naproti tomu směs fruktózy a kyseliny glukónové ev. jejích solí, získaná podle vynálezu, se dělí podstatně snáze krystalizací. Postupem podle vynálezu lze získat obě složky prakticky čisté. Ve srovnání s řadou postupů, využívajících imobilizovaných enzymů, je postup podle vynálezu ekonomicky výhodnější, neboť odpadá izolace a čištění příslušného enzymu a jeho imobilizace. Spotřeba sacharidu na nárůst buněčné hmoty ve vsádce je velmi nepatrná ve srovnání s vý. těžkém konverze sacharidu (90 až 95%). Úspornost postupu podle vynálezu se dále zvyšuje opakovaným použitím odseparovaného mycelia mikroorganismu. Vlivy fyzikálněchemických parametrů kultivace a chemického složení kultivačního prostředí jsou probrány v AO číslo 250 277, týkající se využití stejného· mikroorganismu pro získání kyseliny glukónové a jejich solí konverzí glukózy.

Podstatou způsobu výroby fruktózy vedle kyseliny glukónové a jejích solí v submerzní kultuře plísně Aspergillus foetidus var. pallidus konverzí sacharózového substrátu podle vynálezu je, že se sporové inokulum mutanty tohoto kmene AN 166 bud přímo zaočkuje do produkčního fermentoru nebo předtím do· inokulačního tančíku, v němž se připraví vegetativní inokulum, jimž se zaočkuje produkční fermentor, načež se mutanta kultivuje při teplotě 25 až 30 °C a hodnotě pH 5,0 až 7,0 v roztoku obsahujícím 5 až 50 % hmot. sacharózy nebo produktů, meziproduktů a odpadů z výroby sacharózy, zejména afinády, rafinády, lehké a těžké šťávy, kléru a melasy. Kultura uvedeného kmene je uložena ve Sbírce kultur hub Katedry botaniky Univerzity Karlovy, Praha 2, Benátská 2 pod č. CCF 1889.

Po provedení fermentace buněčná hmota mikroorganismu se může odseparovat od kapalného podílu kultivačního média a opakovaně použít pro konverzi sacharózy nebo produktů, meziproduktů a odpadů z výroby sacharózy, zejména afinády, rafinády, lehké a těžké šťávy, kléru a melasy.

Pro zaočkování fermentačních nádob se používá sponového, případně vegetativního inokula. Jeho množství nezávisí na váhovém množství sacharózového· zdroje, ale pouze na objemu fermentačního média.

V případě sporového inokula se použije takové množství spor, používaného mikroorganismu spláchnutých 0,1% roztokem Tweenu 80, aby jejich koncentrace v médiu na počátku fermentace měřená při vlné délce 420 nm dosahovala hodnoty E420=O,OO5 až 0,02.

Vegetativní inokulum připravené naklíčením spor v koncentraci odpovídající E420 — = 0,05 až 0,2 se dávkuje do fermentačního média v množství 3 až 10 % celkového objemu, což odpovídá výchozí sušině při fermentaci 0,05 až 0,1 mg/ml.

Příprava fruktózy a solí kyseliny glukónové podle způsobu podle vynálezu je uvedena v následujících příkladech:

Příklad 1

Příprava inokula: Použije se spor plísně Aspergillus foetidus var. pallidus AN 166 rostoucích 7 dní na sladinovém agaru na Petriho miskách o průměru 15 cm, odkud se spláchnou 50 ml 0,1 % hmot. roztoku povrchově aktivní látky (Tween 80). Sponovou suspenzí získanou z misek se zaočkuje 150 1 mědila ve fermeintačním tanku. Objem sporové suspenze se volí tak, aby počáteční kon2 5 9 5 centrace spor v médiu odpovídal Εί20==0,01. Po 12 hodinách slabého vzdušnění (0,1 objemu vzduchu na 1 objem média za minutu] bez míchání, kdy spory nakličují při teplotě 30 ^C'C. se zvýší aerace a zapne míchání.

Příprava fermentačního média. Připraví se sterilní fermentační médium o složení (% hmotnostních):

sacharózy,

0.025 KC1,

0.025 KH2PO4,

025 MgSOl . 7 H2O,

0,lCa(ŇO3)2.4H2O,

0,056 (NHjjzSOá.

Oprava pH během fermentace se provádí automaticky přídavky 20 % hmot. roztoku NaOH, KOH, NHiOH nebo NaaCOo v závislosti na tom, kterou sůl chceme získat.

Fermentace: Vlastní fermentace se provádí v nerezovém tanku s centrálně umístěným turbinovým míchadlem. Objem fermentačního média 150 1, míchání 400 ot/min. aerace během fermentace 0,5 objemu vzduchu na 1 objem fermentačního média za minutu, teplota 30 °C, pH se udržuje na hodnotě 6,0. Doba fermentace včetně nakličovací fáze je 40 až 45 hodin. Koncentrace příslušné soli kyseliny glukónové je průměrně 19 až 20 % hmot., fruktózy 18 až 20 % hmot. Během uvedené doby fermentace nedochází k dalšímu odbourávání ani kyseliny glukónové (její soli), ani fruktózy.

Příklad 2

Příprava inokula: sporami ze sladinového agaru se zaočkují propagační tančíky o objemu média 2,5< 1 (množství spor se volí stejným způsobem jako· u příkladu 1) o stejném složení, jako je uvedeno v příkladu 1, pouze se sníženou koncentrací sacharózy na 5 % hmot. Zaočkovaný mikroorganismus se kultivuje při teplotě 30 °C, aeraci 0,1 obje39 mu vzduchu na 1 objem média a otáčkách míchadla 100 ot/min. po dobu 8 až 10 hodin.

Fermentace: získaným vegetativním myceliem se očkuje vlastní fermentační tank v množství 3 až 10 % objemových. Fermentační parametry a složení média jsou stejné jako u příkladu 1. Stejná je i výtěžnost fruktózy a kyseliny glukónové (glukonátu). Doba fermentace je 28 až 30 hodin.

Příklad 3

Příprava inokula: je možno postupovat oběma způsoby, tj. jako v příkladu 1 i 2.

Fermentace: parametry fermentace i složení média jsou stejné jako u příkladu 1 a 2.

Po skončení fermentace se odseparuje mycelium, které se bez proplachování opět vnedo média, obsahujícího (% hmot.): 40 až 50 sacharózy, 0,025 KH2PO4, 0,1 CaCl2. Konverze probíhá za stejných podmínek jako vlastní fermentace. Doba konverze je 18 až 23 hodin, výtěžnost fruktózy 45 až 49 %, kyseliny glukónové (jako glukonát sodný) 49 až 50 procent na vnesenou, sacharózu.

Odseparovaný mycel lze použít několikrát (průměrně 10X). Vratné používání mycelia se přeruší, pokud poklesne rychlost konverze pod žádoucí mez, nebo pokud dojde k silné kontaminaci.

Příklad 4

Stejným způsobem jako v příkladu 1 bylo postupováno při použití melasy jako zdroje sacharózy.

Příklad 5

Stejným způsobem jako v příkladu 2 bylo postupováno i při použití meziproduktů z výroby sacharózy jako uhlíkatého zdroje, zejména afinády, rafinády, lehké a těžké šťávy a/nebo kléru.

Claims (2)

1. Způsob výroby směsi fruktózy a kyseliny glukónové a jejích solí v submerzní kultuře písně Aspergillus foetidus var. pallidus konverzí sacharózového substrátu vyznačený tím, že se sponové inokulum mutiainty CCF 1889 tohoto kmene buď přímo zaočkuje do produkčního fermentoru. nebo předtím do inokulačního tančíku, v němž se připraví vegetativní inokulum, jímž se zaočkuje produkční fermentor, načež se mutanta kultivuje při teplotě 25 až 30 °C a hodnotě pH 5,0 laž 7,0 v roztoku obsahujícím 5 až 50 % hmotnostních sacharózy nebo produktů, meziproduktů a odpadů, z výroby sacharózy, zejména afinády, rafinády, lehké a těžké šťávy, kléru a melasy.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se po provedené fermentaci buněčná hmota mikroorganismu odseparuje od kapalného podílu kultivačního média a opakovaně použije pro konverzi sacharózy nebo produktů, meziproduktů a odpadů z výroby sacharózy, zejména afinády, rafinády, lehké a těžké šťávy, kléru a melasy.