CS256960B1

CS256960B1 - Peptides with properties of antigenic determinants and method of their production

Info

Publication number: CS256960B1
Application number: CS858286A
Authority: CS
Inventors: Viktor Krchnak; Milan Krojidlo; Otakar Mach
Original assignee: Viktor Krchnak; Milan Krojidlo; Otakar Mach
Priority date: 1985-11-16
Filing date: 1985-11-16
Publication date: 1988-04-15
Also published as: JPS62120399A; EP0225066A3; EP0225066A2; US4833072A; CS828685A1

Description

Vynález se týká peptidů s vlastnostmi antigenních determinant obecného vzorce I

H-Val-x-Y (I).

kde X značí

Tyr-Tyr-Arg-Asp-Ser-Arg-Asn-Pro-Leu nebo Phe-Ile-His-Asn-Phe-Lys-Arg-Lys-Gly nebo Val-Pro-Arg-Arg-Lys-Ala-Lys-Ile nebo Leu-His-Thr-Gly-Glu-Arg-Asp-Trp-His-Leu-Gly · nebo Ser-Gly-Lys-Ala-Arg-Gly-Trp-Phe nebo Ser-Ile-Glu-Trp-Arg-Lys-Lys-Arg-Tyr-Ser, a Y značí skupinu hydroxylovou nebo aminovou, a způsobu jejich výroby.

Látky podle vynálezu jsou nové a byly u nich prokázány vlastnosti antigenních determinant lidského T-buňky infikujícího lymfotropního viru typu III (HTLV-III). Mohou sloužit jako vhodná diagnostika к detekci protilátek proti viru způsobující syndrom získané imunodeficience (AIDS). Dále jsou potenciálně též použitelné pro produkci monodeterminantních protilátek a výhledově i jako bezpečná imunizace proti infekci virem, který způsobuje syndrom získané imunodeficience.

V současné době se AIDS diagnostikuje přítomností protilátek proti viru HTLV-III v krevním séru pacientů. Stanovení je prováděné za pomoci tzv. ELISA testu, který je založen na interakci protilátek v séru s antigenem, t. j. virem HTLV-III, inaktivovaným detergentem, jímž jsou ELISA destičky potaženy.

Virus je získáván poměrně složitým postupem, nejdříve je produkován v tkáňové kultuře infikovanými buňkami a potom je virus izolován z tkáňového média a dále několikastupňové purifikován, než je ho možné použít к potahování ELISA destiček. Jedná se o práci velice složitou a nákladnou, ale hlavně vysoce nebezpečnou, neboř se pracuje po celou dobu s vysoce infekčním materiálem.

Destičky ELISA, i když jsou potaženy inaktivovaným virovým preparátem, je nutno považovat za potenciálně infekční materiál a podle toho je nutno s nimi zacházet. Na výše zmíněném postupu jsou založeny prakticky všechny laboratorní soupravy к vyšetření onemocnění AIDS, vyráběné předními světovými výrobci, jako jsou např. Abbot, Sorino, Lab Systém, Inst. Pasteur, Electronucleonic, Wellcome, Sel avo, Organon, DuPont a další. Přitom test není zcela specifický, dává určité malé procento falešně pozitivních výsledků, způsobených i přes intenzívní purifikaci některými kontaminujícími složkami z tkáňové kultury. Proto je nutno u pozitivních případů provádět konfirmační testy, založené na jiném principu, a to bud imunofluorescenci nebo tzv. metoda Western blot. V roce 1986 se očekává uvedení na trh prvních bezpečných diagnostických souprav, které místo celého viru HTLV-III budou obsahovat jako antigen jen některé strukturální bílkoviny, získané metodou genové manipulace v produkčním bakteriálním nebo eukaryontním systému (fy Abbot, Genentech a další).

Tím by měla odpadnout nutnost konfirmačních testů, neboř by se používal jeden definovaný antigen a ne jejich směs, jak to je při použití celého viru. Tyto soupravy budou zřejmě vysoce specifické a umožní, vzhledem ke genetické variabilitě viru, vedle lepší diagnostiky, zřejmě i stanovení prognózy onemocnění. Podobných výsledků by mělo být dosaženo i s použitím některých epitopů proteinů viru HTLV-III, kde se zatím podobná souprava nevyrábí, ale je již na trhu souprava monoklonálních protilátek proti oligopeptidům z vnitřní virové bílkoviny p₂₄ (fy Biochrom), a jsou očekávány v nejbližší době práce o imunogenních peptidech syntetizovaných na základě analýzy primární sekvence obalových proteinů viru HLTV-III.

Látky podle vynálezu byly syntetizovány způsobem podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se na polymerní nosič polystyrénového typu s chlormetylovými nebo benz3 hydrylaminovými skupinami zakotví karboxyterminální aminokyselina a postupnou kondenzací se vystaví peptidický řetězec. Poté se získaný peptid acidolyticky odštěpí z polymerního nosiče a přečistí se.

Peptidy obecného vzorce I byly připraveny Merrifieldovou metodou syntézy peptidů v pevné fázi. Jako polymerní nosič byl použit polystyren šíbovaný divinylbenzenem, s výhodou jedním procentem, s funkčními skupinami chlormetylovými nebo benzhydrylaminovými. aminoskupiny byly chráněny acidolabilní chrániči skupinou, s výhodou Boc skupinou, její odštěpování v jednotlivých fázích syntézy bylo prováděno acidolyticky, s výhodou směsí TFA a DCM. Postranní funkční skupiny vícefuknčních aminokyselin byly chráněny skupinami benzylového typu. Kondenzace chráněných aminokyselin byly prováděny vhodně aktivovanými deriváty, s výhodou symetrickými anhydridy nebo HOBt estery.

Po ukončené syntéze byly peptidy z pryskyřice odštěpeny a současně byly odstraněny chránící skupiny vícefunkčních aminokyselin acidolyticky, s výhodou působením kapalného HF nebo TFMSA ve směsi s TFA a thioanisolem. Surové produkty byly čištěny bud pomocí sloupcové chromatografie na nosičích používaných v chemii peptidů, s výhodou silikagelu, potaženém hydrofobními uhlíkatými řetezci nebo nosičů fungujících jako molekulární síta. Peptidy byly charakterizovány aminokyselinovou analýzou a jejich čistota byla ověřena chromatografickými a elektroforetickými metodami.

Minokyselinové sekvence peptidů obecného vzorce I byly odvozeny z aminokyselinové sekvence proteinu lidského T-buňky infikujícího viru typu III tak, aby zahrnovaly antigenní determinanty zmíněných proteinu. Peptidy mohou sloužit pro diagnostické účely, což bylo prokázáno autory vynálezu, pro produkci monodeterminantních protilátek a výhledově i jako bezpečná aktivní imunizace proti infekci tímto virem nebo viru, jež patří do této skupiny.

Podstatou diagnostické reakce je interakce syntetických peptidů podle vynálezu s protilátkami vytvořenými v organismu, který byl infikován virem. Syntetické peptidy obecného vzorce I jsou určeny pro detekci protilátek produkovaných infikovanými jedinci proti virálním proteinům lidského T-buňky infikujícího lymfotropního viru typu III. Při praktickém použití lze s výhodou použít např. enzymoimunologický test (ELISA), který byl autory vynálezu proveden tak, že jamky polystyrénových mikrotitračních destiček byly plněny roztokem peptidů obecného vzorce I, případně jeho konjugátem s vhodným nosičem, s výhodou kozí nebo hovězí sérový albumin, želatina, případně jiný polymerní nosič, umožňující adhezi na materiál ELISA destičky a neinterferující ve vlastním testu, který byl rozpuštěn ve fosfátovém pufru při pH 7 nebo uhličitanovém pufru při pH 9,5.

Po inkubaci 4 h při 20 °C a pak 44 h při 4 °C byl roztok obsahující nenavázaný peptid slit a použit pro další potahování. Jamky pak byly propláchnuty fosfátovým pufrem а к zablokování volných vazebných míst na polystyrénovém povrchu byl přidán 3% roztok kravského serumalbuminu ve fosfátovém pufru. Po inkubaci 1 h při 37 °C byly jamky promyty fosfátovým pufrem a pak byla přidána testovaná lidská séra, ředěná 1:100. Po inkubaci 2 h při 37 °C byly jamky promyty fosfátovým pufrem a vodou a byl přidán konjugát imunoglobulinu proti lidským imunoglobulinům s křenovou peroxidázou. Po inkubaci 2 h při 37 °C byly jamky důkladně promyty a byla vyvolána barevná reakce. Vyvolání barevné rekace bylo provedeno běžnou technikou, doba vyvolání barvy může trvat až 30 minut.

Barevná reakce byla odečtena na spektrofotometru. Reakce s peptidem vykazovala v v průměru 41,6% absorbance oproti kontrolní hodnotě 100 %, jež vykazoval antigen připravený z viru HLTV-III. Reakce s kontrolním negativním sérem se pohybovala na úrovni pozadí.

Peptidy podle vynálezu je možno dále použít pro produkci monodeterminantních protilátek proti proteinům HLTV-III směrovaných proti antigenní determinantě, kterou zahrnuje peptid, kterým byla imunizace prováděna.

Autoři vynálezu prováděli imunizaci pokusných zvířat, s výhodou králíků, peptidy obecného vzorce I s výhodou polymerizovaných glutaraldehydem nebo metodou aktivních esterů nebo po navázání na vhodnou bílkovinu, s výhodou kravský sérumalbumin, thyreoglobulin . nebo hemocyanin z keyhole limpetu, za použití kondenzačního činidla, s výhodou glutaraldehydu, karbodiimidu, bifunkčních činidel nebo pomocí aktivních esterů. Jako imunoadjuvans použili Freundovo kompletní adjuvans nebo MDP.

. Peptidy podle vynálezu je možno dále potenciálně použít jako možného přístupu к řešení problému aktivní imunizace proti lidskému T-buňky infikujícímu lymfotropnímu viru typu III, který způsobuje syndrom získané imunodeficience (AIDS). S výhodou lze imunizaci provádět volnými peptidy podle vynálezu, jejich směsí, peptidy navázanými na vhodný nosič, nebo polymerovanými pyptidy za použití glutaraldehydu nebo metodou aktivních esterů.

Na připojené tabulce 1 jsou zachyceny výsledky ELISA testu se séry negativními (NS - průměrná hodnota z více měření), se séry pacientů s positivní přítomností protilátek (SPI - SP3) proti HIV (ověřeno metodou Western blot). Séra byla ředěna 1:100 a reakce byla odečítána na fotometru Flow při 2 vlnových délkách. Jako kontrolní séra byla použita komerční positivní séra výrobců Abbott, Wellcome, Sorino, Pasteur.

Tabulka	1
sérum	NS	SPI	SP2	SP3	SPA	SPW	SPS	SPP
absorbance O.D.	0,005	1,19	1,43	1,43	1,8	1,02	1,08	1,04

Mimo tato séra bylo analyzováno ještě dalších 11 positivních sér, ověřených metodou Western blot na přítomnost protilátek, u kterých byly při ředění 1:100 naměřeny hodnoty absorbancí od 0,6 do 1,7. Souběžně měřená kontrolní negativní séra poskytla hodnoty pod 0,1. Na zachycení nespecifických positivních reakcí bylo analysováno 50 sér pacientů s lymfomy resp. s jinými nádorovými onemocněními. Tato séra byla ředěna 1:10 a 1:50, vždy v tripletech. Naměřené hodnoty nepřevyšovaly 0,1 O.D., pouze u 2 sér při ředění 1:10 byla zjištěna nespecifická positivní reakce o hodnotě absorbance okolo 0,2.

(O.D. optická densita)

V následující tabulce 2 jsou uvedeny průměrné hodnoty absorbancí v ELISA testu pozitivními a kotrolními negativními séry pro jednotlivé peptidy obecného vzorce I.

Tabulka 2

Průměrné hodnoty absorbancí pozitivních a negativních sér.

Peptid obecného vzorce I	Průměrná	absorbance sér
X	Y	požit.	negat.
Tyr-Tyr-Arg-Asp-Ser-Arg-Asn-Pro-Leu	OH	1,73	0,08
Phe-Ile-His-Asn-Phe-Lys-Arg-Lys-Gly	nh₂	0,35	0,06
Leu-His-Thr-Gly-Glu-Arg-Asp-Trp-His-Leu-Gly	^NH2	0,47	0,03
Ser-Gly-Lys-Ala-Arg-Gly-Trp-Phe	^NH2	0,11	0,02

Získané výsledky ukazují, že peptidy podle vynálezu je možno použít jako diagnostika, pro produkci monodeterminantních protilátek a potenciálně к aktivní imunizaci jako vakcíny proti AIDS.

Následující příklady provedení látky a způsob podle vynálezu pouze dokládají, ale nikterak neomezují.

Příklad 1

Do reakční nádoby syntetizátoru peptidů bylo umístěno 2,5 g chlormetylované polystyrénové pryskyřice sířované 1% divinylbenzenu a esterifikované Вос-Leu (obsah Leu 0,6 mmol/g pryskyřice). Syntéza zahrnovala 9 cyklů, sestávajících z následujících kroků: (1) štěpení chránících skupin, TFA:DCM (1:1), 1x5 min, 1 x 30 min; (2) promývání, DCM, 2x1 min;

(3) promývání, 2-propanol, 2x1 min; (4) promývání, DCM, 2x1 min; (5) neutralizace, TEA:DCM (1:9), lxl min, 1x3 min; (6) promývání DCM, 6x1 min; (7) kondenzace pomocí předem připravených symetrických anhydridu (3násobný přebytek), do negativní reakce na aminoskupiny; (8) promývání, DCM, 3x1 min.

V jednotlivých cyklech byly kondenzovány následující chráněné aminokyseliny: Boc-Pro, Boc-Asn, kondenzace 3násobkem HOBt esteru, Boc-Arg(Tos), kondenzace smícháním Boc-Arg(Tos) a DCC v reakční nádobce, Boc-Ser(Bzl), Boc-Asp(OBzl), Boc-Arg(Tos), kondenzace jako u předchozího Arg, Boc-Tyr(Z), Boc-Tyr(Z), a Вос-Val. Po ukončené syntéze bylo získáno 4,1 g peptidyl-pryskyřice. Peptidyl-pryskyřice (0,5 g) byla suspendována ve směsi TFMSA (0,75 ml), TFA (2,5 ml) a thioanisolu (1 ml).

Po 1 h míchání za laboratorní teploty byl produkt sražen 100 ml absolutního éteru, produkt a pryskyřice odfiltrovány, promyty absolutním éterem a produkt extrahován do 1 M kyseliny octové, lyofilizován a čištěn na koloně (1 x 100 cm) obsahující jako stacionární fázi polyakrylamidový gel, mobilní fáze 1 M kyselina octová, průtok 7 ml/h. Frakce obsahující homogenní produkt byly spojeny a lyofilizovány. Výsledný produkt měl aminokyselinovou anylýzu shodnou s teoretickými hodnotami, čistota produktu byla potvrzena při analytickém HPLC, Rt 7,9 (40% MeOH, 60% vodné 0,1% TFA), chromatografií na tenké vrstvě a elektroforéze na papíře při pH 2,5, Rf = 0,45.

Výtěžek: 113 mg H-Val-Tyr-Tyr-Arg-Asp-Ser-Arg-Asn-Pro-Leu-OH.

Příklad 2

Do reakční nádobky syntetizátoru peptidů bylo umístěno 1,5 g benzhydrylaminové pryskyřice (obsah aminokyselin 0,7 mmol/g pryskyřice). Syntéza zahrnovala 12 cyklů, které sestávaly ze stejných kroků jako v příkladě 1 s tím rozdílem, že první cyklus začínal krokem č. (4) a kondenzace byly prováděny 3 molárním přebytkem předem připravených HOBt esterů. V jednotlivých cyklech byly kondenzovány následující aminokyseliny: Вос-Leu, Boc-Hijs (Boc), Boc-Trp(For), Boc-Asp(OBzl), Boc-Arg(Tos), kondenzace jako u Arg v příkladě 1, Boc-Glu(OBzl), Boc-Gly, Boc-Thr(Bzl), Boc-His(Boc), Вос-Leu a Boc-Val.

Po ukončené syntéze bylo získáno 3,1 g peptidyl-pryskyřice. Peptid byl z peptidyl-pryskyřice (0,5 g) odštěpen a současně byly odštěpeny chránící skupiny v 10 ml kapalného HF obsahujícího 10 % p-thiokresolu, 1 h při 0 °C. Surový produkt byl čištěn preparativní HPLC na koloně (2 x 50 cm) obsahující jako stacionární fázi silikagel potažený hydrofobními uhlíkatými řetězci, jako mobilní fáze byla použita voda, obsahující 25 % metanolu a 0,1 %. TFA. Frakce obsahující homogenní látku byly spojeny a lyofilizovány, Výsledný produkt měl aminokyselinovou analýzu shodnou s teoretickými hodnotami, jeho čistota byla potvrzena při nanalytické HLPC, Rt 8,2 (40% MeOH, 60% vodné 0,1% TFA), chromatografií na tenké vrstvě a papírové elektroforéze při pH 2,5, Rf = 0,40.

Výtěžek: 72 mg H“Val-Leu-His-Thr-Gly-Glu-Arg-Asp-Trp-His-Leu-Gly-NH2»

Příklad 3

Postupem podle příkladu 1 byly připraveny následující čisté produkty:

Výtěžek:	57 mg H-Val-Phe-Ile-His-Asn-Phe-Lys-Arg-Lys-Gly-OH, Rt 6,8 (45% MeOH, 55% vodné 0,1% TFA), Rf = 0,15.
Výtěžek:	79 mg H-Val-Val-Pro-Arg-Arg-Lys-Ala-Lys-Ile-OH, Rt 6,1 (35% MeOH, 65% vodné 0,1% TFA), Rf = 0,22.

Příklad 4

Postupem podle příkladu 2 byly připraveny následující čisté produkty:

Výtěžek:	72 mg H-Val-Ser-Gly-Lys-Ala-Arg-Gly-Trp-Phe-Nř^, Rt 7,1 (40% MeOH, 60% vodné 0,1% TFA), Rf = 0,50.
Výtěžek:	46 mg H-Val-Ser”Ile-Glu-Trp-Arg-’Lys-Lys-Arg-Tyr-Ser”NH₂, Rt 5,7 (35% MeOH, 65% vodné 0,1% TFA), Rf = 0,47.

Vysvětlivky ke zkratkám použitým v textu:

HTLV	lidský T-buňky infikující lymfotropní virus
ARC	komplex chorob příbuzných AIDS
AIDS	syndrom získané imunodeficience
ELISA	enzymoimunologický test
HPLC	vysokoúčinná kapalinová chromatografie
TFA	kyselina trifluoroctová
DCM	dichlormetan
TFMSA	kyselina trifluormetansulfonová
HOBt	N-hydroxybenztriazol
TEA	trietylamin
Boc	t-butyloxykarbonyl
Tos	p-toluensulfonyl
Bzl	benzyl
Z	benzyloxykarbonyl
BrZ	o-brombenzyloxykarbonyl
DCC	N,N'-dicyklohexylkarbodiimid
HF	fluorovodík
For	formyl
Rt	retenční čas v minutách
Rf	hodnota Rf v soustavě butanol : octová kyseliqa : voda, 4:1:1
Ala	alanin
Arg Asp Asn	arginin kyselina asparagová asparagin
Glu	kyselina glutamová -
Gin	glutamin
Gly His	glycin histidin
Ile	isoleucin
Leu	leucin
Lys Phe	lysin phenylalanin
Pro	prolin
Ser	serin
Thr	threonin
Trp Tyr Val	tryptofan tyrosin valin

Claims

PŘEDMĚT vynálezu

1. Peptidy s vlastnostmi antigenních determinant obecného vzorce I,

H-Val-X-Y

kde X značí Tyr-Tyr-Arg-Asp-Ser-Arg-Asn-Pro-Leu nebo Phe-Ile-His-Asn-Phe-Lys-Arg-Lys-Gly nebo Val-Pro-Arg-Arg-Lys-Ala-Lys-Ile nebo Leu-His-Thr-Gly-Glu-Arg-Asp-Trp-His-Leu-Gly nebo Ser-Gly-Lys-Ala-Arg-Gly-Trp-Phe nebo a Y značí Ser-Ile-Glu-Trp-Arg-Lys-Lys-Arg-Tyr-Ser, skupinu hydroxylovou nebo aminovou.
2. Způsob výroby peptidů obecného vzorce I podle bodu 1, vyznačující se tím, že se na polymerní nosič polystyrénového typu s chlormetylovými nebo benzhydrylaminovými skupinami zakotví karboxylterminální aminokyselina a postupnou kondenzací se vystaví peptidický řetězec, načež se zíkaný peptid acidolyticky odštěpí z polymerního nosiče a přečistí.