CS258259B1 - Způsob výroby kyseliny L-asparágov6 pomoci heterogenních biokatalyzátorů - Google Patents

Abstract

Řešení se týká způsobu výroby kyseliny L-asparagové pomocí heterogenních biokatalyzátorů založených na bázi mikrobiálních buněk s aspartasovou aktivitou. Způsob spočívá v tom, že se vodný roztok fumaranu amonného uvádí ve styk s biokatalyzátory, které se předem připraví působením oktylfenolpolyetylenglykoletheru nebo nonylfenolpolyetylenoxidu nebo přímo roztokem amonné soli kyseliny fumarové nebo asparagtvé s přídavkem amoniaku na mikrobiální buňky, obsahující enzym L-aspartattamoniak lyazu, zabudované do gelu genu-carrageenanu, potom po ukončení konverze se izoluje z odděleného kapalného podílu kyselina L-asparagová. Tato aminokyselina lze používat při výrobě léčiv a při výrobě umělého sladila.

Description

Vynález se týká způsobu výroby kyseliny L-asparagové z fumaranu amonného pomocí mikrobiálních buněk s aspartasovou aktivitou do genu-carrageenanu.

Kyselina L-asparagová se ve stále větší míře používá ve farmaceutickém a potravinářském průmyslu a je důležitou složkou sladkého dipeptidu Aspartamu i významnou složkou některých léků. Z těchto důvodů se neustále zvyšuje zájem o ekonomickou velkovýrobu této důležité aminokyseliny. Vzhledem k tomu, že pro řadu aplikací je použitelný pouze L-stereoisomer této kyselny, je z ekonomických důvodů vhodné a to i v případech, kdy mohou být aplikovány současně oba antipody při pochopitelném využití pouze L-formy, vyrábět biologicky aktivní L-stereoisomer kyseliny asparagové především biologickou cestou umožňující selektivní produkci požadovaného enantiomeru.

Transformaci kyseliny fumarové na kyselinu L-asparagovou je možno realizovat pomocí buněk mikroorganismů různých kmenů z rodů Alcaligenes, Corynebacterium a Escheriohia, jež se vyznačují aspartasovou aktivitou. Jednorázovou submerzní kultivací vypěstované buňky se buá s kultivačním médiem nebo po oddělení od kultivačního média suspendují v roztoku substrátu, tj. fumaranu amonného, který je při vhodném pH a teplotě za míchání konvertován na amonnou sůl kyseliny L-asparagové. Po oddělení buněk a následném okyselení se izoluje kyselina L-asparagová.

Při tomto způsobu je nutno pro každou výrobní šarži vypěstovat vždy nové buňky ve velkokapacitních fermentačnich tancích, což je s ohledem na surovinové a energetické náklady včetně potřeby velkého investičně náročného zařízení ekonomicky značně nevýhodné.

Z uvedeného důvodu byla vypracována řada postupů /švec F. a spol.: Chem. Listy 74, /1980//, které umožňují vícenásobné nebo kontinuální využití enzymu aspartasy /L-aspartat: :amoniaklyasy E.Cj 4.3.1.1 /buá vázané na vhodný nosič po izolaci z příslušného mikroorganismu, nebo přímo ve formě imobilizovaných buněk s aspartasovou aktivitou. Využití mikrobiálních buněk v imobilizované formě má oproti imobilizovaným enzymům řadu výhod především ekonomického charakteru, poněvadž odpadá mnohdy nákladná izolace enzymu, v důsledku čehož je cena připraveného biokatalyzátoru nižší. Biokatalyzátory připravené imobilizací buněk mají většinou i vyšší operační stabilitu /Marek M. a Káš J.: Chem. průmysl 34, 546 /1984//.

Pro imobilizací buněk s aspartasovou aktivitou byly rozpracovány dva principiálně odlišné postupy - metoda zabudování buněk do různých druhů polymerníoh matric a metoda kovalentního zesítění vnitrobuněčného obsahu jednotlivých mikrobiálních buněk nebo navzájem chemicky vázaných buněk pomocí bifunkčnich sítovacích činidel, především pomocí glutaraldehydu /čs. autorského osvědčení č. 209 265/.

Základem průmyslové kontinuální výroby kyseliny L-asparagové se stal v první polovině 7). let vypracovaný postup imobilizace buněk do polyakrylamidu /Chibata I. a spol.: Appl. Microbiol. 27, 878 /1974//. Radikálovou polymeraci akrylamidu s Ν,Ν'-metylen-bis-akrylamidem /USA pat. spis č. 3 791 926/ se připraví zesitěný syntetický gel se zabudovanými buňkami, jehož operační poločas činí až 120 dní. Uvedený postup však má i řadu nevýhod.

Dosud není znám způsob provedení polymerace, podle kterého by bylo možné připravit částice gelu sférického tvaru a alespoň přibližně shodné, velikosti, které by zaručovaly optimální hydrodynamické vlastnosti biokatalyzátoru. Největším nedostatkem uvedeného postupu je však skutečnost, že byt i krátkodobým stykem buněčného materiálu s momonery akrylamidem s Ν,Ν'-metylen-bis-akrylamidem dochází ke snížení aktivity aspartasy. Při polymeraci se navíc uvolňuje teplo, které rovněž snižuje enzymovou aktivitou imobilizovaných buněk.

K nevýhodám uvedeného postupu patří i nebezpečí, že látky vyrobené použitím takto připraveného biokatalyzátoru mohou obsahovat toxické zbytky nezpolymerovaných monomerů, což je z hygienic kého a zdravotnického hlediska nepřípustné.

Z uvedených důvodů byl koncem sedmdesátých let vypracován a technologicky realizován nový způsob výroby kyselin L-asparagové pomocí biokatalyzátoru připraveného zabudováním buněk s aspartasovu aktivitou do kappa-carrageenanu (Sáto T. a spol.: Biochim. Biophys. Acta 570, 179 /1979//. Kappa-carrageenan je polysacharid, který se získává extrakcí mořských řas Chondrus crispus horkou vodou a následnou separací od lamba-carrageenanu pomoci frakční precipitace draselnými ionty /Rees D. A.: J. Chem. Soc. 1963, 1821/.

Pomocí draselných, amonných, vápenatých a jiných iontů /Tosa T. a spol.: Biotechnol. Bioeng. 21, 1697 /1979// je možno z kappa-carrageenanu vytvořit gelovité částice různých fyzikálních vlastností a tvarů, které mají vedle dostatečné pevnosti i výborné hydrodynamické vlastnosti. Zabudováním buněk s aspartasovou aktivitou do gelu kappa-carrageenanu je pak připraven biokatalyzátor, který má vedle vysokého podílu zachované enzymové aktivity i značně vysokou stabilitu. V literatuře /Nishida Y. a spol.: Enzyme Microb. Technol. 6, 85 /1984// je uváděn operační poločas až 680 dni.

Pro přípravu biokatalyzátoru analogických vlastností je možno použit též genu-carrageenanu to je surového carrageenanového preparátu izolovaného z řas rodů Gigartinaceae a Solieriaceae /Genu-carrageenan: A/S Kobenhavns Pektinfabrik, Dánsko/. Na rozdíl od izolovaného čistého kappa-carrageenanu se jedná o technický směsný carrageenanový preparát běžně používaný v potravinářském průmyslu, který je přibližně 40krát levnější kappa-carrageenan. Zabudováním buněk s aspartasovou aktivitou do gelu genu-carrageenanu je připraven vysoce stabilní biokataly zátor s definovanou velikostí částic vhodných fyzikálních i hydrodynamických vlastností.

Na základě uvedených poznatků týkajících se vlastností genu-carrageenanu byl vypracován způsob výroby kyseliny L-asparagové pomocí heterogenních biokatalyzátorů podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se vodný roztok fumaranu amonného o koncentraci 0,75 až 22,5 % hmot. s hodnotou pH 6,5 až 9,5, s přísadou hořečnatých iontů s výhodou v koncentraci 0,002 5 % hmot. uvádi ve styk při teplotě 10 až 50 °C s heterogenním biokatalyzátorem, který se připrav! působením octylphenolpolyetylenglykoletheru nebo nonylphenolpolyetylenoxidu nebo přímo roztokem amonné soli kyseliny fumarové či asparagové s přídavkem amoniaku, na mikrobiální buňky, obsahující enzym L-aspartát:amoniak lyazu, zabudované do gelu genu-carrageenanu, načež se po ukončené konverzi izoluje z odděleného kapalného podílu kyselina L-asparagová.

Pro způsob výroby kyseliny L-asparagové podle vynálezu je možno použít různých mikrobiálních druhů a kmenů, popřípadě vysokoprodukčních mutant různých mikroorganismů syntetizujících enzym aspartasu, například různých kmenů z rodů Escherichia, Alcaligenes a Corynebacterium, s výhodou mikrobiálního kmene Escherichia alcalescens CCEB Asp 24 kultivovaného podle čs. autorského osvědčení 220 460.

Hlavní výhody způsobu výroby kyseliny L-asparagové dle vynálezu jsou spojeny s jednoduchostí přípravy biokatalyzátoru, v cenové atraktivnosti k imobilizaci buněk používaného genu-carrageenanu, ve vysokém stupni zachování aspartasové aktivity buněk během přípravy biokatalizátoru a v neposlední řadě ve vysoké stabilitě aplikovaného biokatalyzátoru. Vysoké operační stability biokatalyzátoru je dosaženo zvláště při imobilizaci buněk do genu-carrageenanu za přítomnosti sloučenin obsahujících vysoký podíl hydroxylových skupin například taninu, případně též po následném zpevnění částic gelu pomocí 1,6-diaminohexanu a glutaraldehydu. Operační poločas u takto připravených biokatalyzátorů činí minimálně 180 dní.

Způsob výroby kyseliny L-asparagové dle vynálezu je výhodný zvláště pro konitnuální uspořádání, nebot používaný biokatalyzátor má výborné sedimentační a hydrodynamické vlastnosti pro použití v kolonách ve formě pevného nebo fluidnlho lože. Z filtrátu, respektive kapalného podílu reakční směsi odděleného od biokatalyzátoru se kyselina L-asparagová získá úpravou pH pomocí minerální kyseliny na hodnotu 2,8 a následnou krystalizací při teplotě 10 až 20 °C.

Vykrystalovaná kyselina L-asparagová se odfiltruje, promyje studenou vodou a usuší, případně dále dle potřeby.

Postupem podle vynálezu připravená kyselina L-asparagová je velmi čistá, použitelná zejména pro přípravu různých solí používaných jako léčiva, například kardiotonikum Cardilan /Spofa/, to je hořečnato-draselná sůl kyseliny L-asparagové.

Při výrobě kyseliny L-asparagové podle vynálezu je účinnost konverze 100% při zajištěni optimálních podmínek, to je množství biokatalyzátoru, počáteční koncentrace substrátu a průtokové rychlosti. Výtěžek izolované čisté kyseliny L-asparagové se pohybuje kolem 94 až 96 % hmot. teoretického zisku.

V dalším je vynález blíže objasněn v příkladech provedení, aniž by se jimi omezoval.

Přiklad 1

Produkční kmen Escherichia alcalescens Asp 24 byl ze šikmého agaru zaočkován kličkou do 250 ml Erlenmayerovy baňky obsahující 70 ml živného sterilního média tohoto složení:

% hmot. kvasničný autolyzát, 0,5 % hmot. pepton, 0,9 % hmot. kyselina fumarová a 0,75 % objem, hovězího vývar 5 x koncentrovaný, pH 7,0. Kultivace vegetativního inokula probíhala na rotační třepačce 16 hodin při teplotě 37 °C. Získané inokulum bylo použito k zaočkování vlastních produkčních baněk.

Získaným inokulem bylo zaočkováno 10 varných kulatých baněk o objemu 750 ml, jež obsahovaly po 100 ml živného média výše uvedeného složení. Bylo použito 1 ml inokula na 100 ml živného média. Kultivace probíhala na rotační třepačce po dobu 16 hodin při teplotě 37 °C.

Po ukončení kultivace byly suspenze buněk slity, stanovena enzymová aktivita, která byla 31^kat/g vlhkých buněk, buňky byly odstředěny a získaný sediment byl použit pro přípravu heterogenního biokatalyzátoru.

Vlhká buněčná pasta byla rozmíchána ve fyziologickém roztoku tak, aby vznikla suspenze o obsahu 20 % hmot. vlhkých buněk. Suspenze byla zahřáta na teplotu 50 °C a poté bylo přidáno stejné množství 5 % hmotnostního roztoku genu-carrageenanu 55 °C teplého. Směs byla důkladně promíchána, ochlazena na teplotu 10 °C a převrstvena 2,24 % hmot. roztokem chloridu draselného o teplotě 10 °C. Po 24 hodinách byl vzniklý heterogenní biokatalyzátor rozmixován v mixeru, suspenze biokatalyzátoru byla odstředěna a sediment byl použit pro diskontinuální přípravu kyseliny L-asparagové.

Heterogenní biokatalyzátor o aktivitě 1,7 ^wkat/g vlhkého gelu v množství 50 g vlhké hmotnosti byl rozsuspendován v 1 litru 14,9 % hmot. roztoku fumaranu amonného, pH 8,5, jež obsahoval 0,08 % objem, nonylphenolpolyetylenoxidu. Suspenze byla míchána při 37 °C.

Ke 100% konverzi na asparát amonný došlo za 4 hodniny. Po této době byla reakční směs odstředěna, sediment biokatalyzátoru znovu resuspendován v 1 1 14,9 % hmot. roztoku fumaranu amonného a celý postup byl opakován.

Konverze bylý opakovány celkem 9krát bez znatelné ztráty enzymové aktivity heterogenního biokatalyzátoru. Ze supernatantů byla izolována kyselina L-asparagová úpravou pH na 2,8 pomocí kyseliny sírové o koncentraci 70 % hmot. a ochlazením na teplotu 10 °C. Celkový výtěžek byl 1 120 g kyseliny L-asparagové, to je 94,2 % hmot. teoreticky ziskatelného množství

Přiklad 2

Buňky kmene Escherichia alcalescens Asp 24 byly připraveny shodným postupem jako v příkladu 1. Získaná buněčná pasta byla rozmíchána ve fyziologickém roztoku tak, aby vznikla 40 % hmot. suspenze vlhkých buněk. Suspenze byla zahřáta na teplotu 45 °C a poté k ní bylo přidáno třínásobné množství 4 % hmotnostního roztoku genu-carrageenanu o teplotě 50 °C.

Směs byla důkladně promíchána a za tepla kapána do chladného roztoku chloridu draselného o koncentraci 2,24 % hmot. převrstveného vrstvou parafinového oleje. Vytvořené kuličky heterogenního biokatalyzátoru byly ponechány 24 hodin v roztoku chloridu draselného o koncentraci 2,24 % hmot. a teplotě 10 °C. Jejich povrch byl zpevněn následujícím postupem.

Kuličky heterogenního biokatalyzátoru o celkové hmotnosti 100 g a průměru okolo 3,5 mm byly vychlazeny na 5 °C a převrstveny 113 ml roztoku, který obsahoval 0,5 M fosfátový pufr pH 7,0, chlorid draselný o koncentraci 2,24 % hmot. a 1,6-diaminohexan o koncentraci 0,99 4 hmotnostních.

Roztok měl teplotu 5 °C. Směs byla mírně míchána po dobu 5 minut a poté bylo přidáno 48,6 ml o složení: 0,5 M fosforečnanový pufr, pH 7,0 chlorid draselný o koncentraci 2,24 4 hmot. a glutaraldehyd o koncentraci 0,95 % hmot. Vše bylo opět mícháno při 5 °C po dobu 30 minut. Červeně zbarvené kuličky biokatalyzátoru byly několikrát promyty dostatečným množstvím roztoku chloridu draselného o teplotě 10 °C a koncentraci 2,24 4 hmot. Část kuliček byla použita ke stanovení enzymové aktivity a 90 g biokatalyzátoru bylo použito k semikontinuální konverzi fumaranu amonného na L-aspartan amonný.

Kuličky heterogenního biokatalyzátoru o aktivitě 0,85 ^kat/g vlhkého biokatalyzátoru byly převrstveny 1 1 fumaranu amonného o koncentraci 14,9 4 hmot., pH 8,5, jež obsahoval octylphenolpolyetylenglykolether o koncentraci 0,2 4 objem. Směs byla jemně míchána při 37 °C. Ke 1004 konverzi na L-aspartan amonný došlo za 9,5 hod. Rozrok aspartanu amonného byl opatrně odsát a konverze byla opakována výše popsaným způsobem celkem 15krát. Ztráta aktivity biokatalyzátoru po ukončení všech konverzí nepřevíšila 2,5 4 původní aktivity.

Ze spojených odsátých roztoků aspartanu amonného bylo postupem uvedeným v přikladu 1 izolováno 1 880 g kyseliny L-asparagové, což představuje 95 % teoretického zisku.

Příklad 3

Buňky kmene Escherichia alcalescens Asp 24 byly získány postupem shodným jako v příkladu 1. Buněčný sediment byl rozmíchán ve fyziologickém roztoku tak, aby vznikla suspenze o koncentraci 42,5 4 hmot. vlhkých buněk. Směs byla zahřáta na teplotu 45 °C a poté k ní bylo přidáno třínásobné množství 50 °C teplého roztoku genu-carrageenanu o koncentraci 4 4 hmot.

Po důkladném promíchání byl ke směsi přidán roztok taninu ve fyziologickém roztoku o koncentraci 1 4 hmot. tak, aby výsledná koncentrace taninu v gelu byla 0,1 4 hmot. Vše bylo opět důkladně promícháno a za tepla vylito na misku tak, aby vrstva gelu byla vysoká maximálně 5 až 6 mm.

Ztuhlý gel byl převrstven roztokem chloridu draselného o koncentraci 2,24 4 hmot. a ponechán 24 hodin při 10 °C. Vytvrzený gel byl rozřezán na částice 5 x 5 x 5 mm a poté použit,na kontinuální kolonovou přípravu kyseliny L-asparagové.

Kostičky heterogenního biokatalyzátoru o celkové hmotnosti 95 g a aktivitě 0,75_<ukat/g vlhkého biokatalyzátoru byly naplněny do termostatované kolony o rozměrech 2,6 x 25 cm a teplotě 37 °C a gel byl ponechán aktivovat po dobu 48 hodin průtokem 140 ml/hod roztokem fumaranu amonného o koncentraci 14,9 4 hmot. a při pH 8,5. Po skončení aktivace byl průtok fumaranu amonného snížen na 70 ml/hod. Konverze fumaranu amonného na L-aspartan amonný probíhala při 37 °C po dobu 40 dnů bez zjistitelné změny enzymové aktivity použitého biokatalyzátoru. Celkem bylo za uvedené období zkonvertováno 67,2 1 roztoku fumaranu amonného. Izolací podle příkladu 1 bylo získáno 8,35 kg kyseliny L-asparagově, což je 94,1 4 teoretického množství.

Příklad 4

Buňky kmene Escherichia alcalescens Asp 24 byly získány postupem shodným jako v příkladu 1. Buněčný sediment byl rozmíchán ve fyziologickém roztoku tak, aby vznikla suspenze o koncentraci 42,5 4 hmot. vlhkých buněk. Směs byla zahřáta na teplotu 45 °C a poté k ní bylo přidáno třínásobné množství 50 °C teplého roztoku genu-carrageenanu o koncentraci 4 % hmot. Po důkladném promíchání byl ke směsi přidán roztok taninu ve fyziologickém roztoku o koncentraci 1 % hmot. tak, aby výsledná koncentrace taninu v gelu byla 0,1 % hmot. Směs byla důkladně promíchána a za tepla kapána do chladného roztoku chloridu draselného o koncentraci 2,24 4 hmot. a teplotě 10 °C.

Kuličky heterogenního biokatalyzátoru o aktivitě 1,35 ukat na 1 g vlhkého biokatalyzátoru byly naplněny do kolony a při 45 °C aktivovány po dobu 48 h roztokem fumaranu amonného o koncentraci 22 % hmot. a pH 9,5. Po skončení aktivace byla prováděna konverze fumaranu amonného na L-aspartan amonný za shodných podmínek při průtoku 100 ml/h. Po 60 dnech nebyla zaznamenána změna enzymové aktivity použitého biokatalyzátoru. Po izolaci bylo celkem získáno 17,1 kg kyseliny L-asparagové, což je 95 % teoretického výtěžku.

Příklad 5

Ke kuličkám heterogenního biokatalyzátoru připraveného podle příkladu 4 byl přidán roztok fumaranu amonného o koncentraci 1 % hmot., pH 6,5, obsahující oktylfenolpolyetylenglykolether o koncentraci 0,2 % objem. Směs byla jemně míchána při 15 °C. Ke 100% konverzi na L-aspartan amonný došlo za 2 h. Roztok aspartanu amonného byl opatrně odsát a konverze byla opakována uvedeným způsobem celkem 20krát. U biokatalyzátoru nebyla zaznamenána ztráta původní enzymové aktivity.

Claims (1)

1. Způsob výroby kyseliny L-asparagové pomocí heterogenních biokatalyzátorů pomocí mikrobiálních buněk s aspartasovou aktivitou vyznačující se tím, že se vodný roztok fumaranu amonného o koncentraci 0,75 až 22,5 % hmot., s hodnotou pH 6,5 až 9,5 a přísadou hořečnatých iontů uvádí při teplotě 10 až 50 °C ve styku s heterogenním biokatalyzátorem, který se předem připraví působením oktylfenolpolyetylenglykoletheru nebo nonylfenolpolyetylenoxidu nebo přímo roztokem amonné soli kyseliny fumarové nebo asparagové s přídavkem amoniaku na mikrobiální buňky, obsahující enzym L-asparáti amoniak lyázu, zabudované do gelu genu-carrageenanu, načež se po ukončení konverze izoluje z odděleného kapalného podílu kyselina L-asparagová.