CS259361B1

CS259361B1 - Kit and determination of protein by silver detection technique

Info

Publication number: CS259361B1
Application number: CS857391A
Authority: CS
Inventors: Kamil Marcinka
Original assignee: Kamil Marcinka
Priority date: 1985-10-17
Filing date: 1985-10-17
Publication date: 1988-10-14
Also published as: CS739185A1

Abstract

Riešenie sa týká sópravy na stanovenie bielkovín detekčnou technikou striebrom. Podstata tejto súpravy na stanovenie bielkovín spočívá v tom, že obsahuje oddelene šest zložiek vo formě roztokov, pričom prvá zložka obsahuje vodný roztok glutaraldehydu, druhá zložka roztok zmesi hydroxidu amónneho a hydroxidu sodného, tretia zlož ka roztok dusičnanu strieborného, štvrtá zložka roztok hydroxidu sodného, piata zlož ka roztok kyseliny citrónovej a siesta zlož ka vodný roztok formaldehydu. Riešenie má využitie pri stanovení bielkovín v platňových polyakrylamidových géloch a to najma v biochemických pracoviskách, v pivovarníctve, farmaceutickom priemysle a pod.The solution concerns a kit for protein determination by silver detection technique. The essence of this kit for protein determination is that it contains six separate components in the form of solutions, the first component containing an aqueous solution of glutaraldehyde, the second component a solution of a mixture of ammonium hydroxide and sodium hydroxide, the third component a solution of silver nitrate, the fourth component a solution of sodium hydroxide, the fifth component a solution of citric acid and the third component an aqueous solution of formaldehyde. The solution is used in the determination of proteins in plate polyacrylamide gels, especially in biochemical laboratories, in brewing, the pharmaceutical industry, etc.

Description

Vynález sa týká súpravy na sťavenie bielkovín detekčnou technikou striebrom.The present invention relates to a kit for the reduction of proteins by a silver detection technique.

Súprava na farbenie striebrom, ktorú vyrába firma Bio-Rad (USA) pracuje na základe metodiky, ktorú opísal Merril a spol. (Meril C. R., Goldman D., Sedman S. A. a Ebert Μ. H.: Science 211, 1 437, 1931). Inú súpravu pod obchodným názvom GELCODE vyrábajú dve firmy v USA s určitými obměnami, avšak u oboch je postup odvodený z metodiky podl'a Sammonsa (Ochs D. C., McGonkey E. H. a Sammons D. W.: Electrophoresis 2, 304, 1981). Ani jedna z raenove.ných súprav nepoužívá strieborné ióny vo formě amoniakálneho komplexu.The silver dyeing kit manufactured by Bio-Rad (USA) is based on the methodology described by Merril et al. (Meril, C. R., Goldman, D., Sedman, S.A., and Ebert, H., Science, 211, 1437, 1931). Another kit under the trade name GELCODE is manufactured by two US companies with some variations, but both are derived from the Sammons methodology (Ochs, D. C., McGonkey, E. H., and Sammons, D. W., Electrophoresis 2, 304, 1981). None of the kits used silver ions in the form of an ammonia complex.

Nevýhody doteraz vyrábaných súprav spočívajú hlavně v tom, že gél po spracovaní má poměrně intenzívně pozadie. Podlá firemných návodov pracovný postup trvá velmi dlho alebo na dosiahnutie optimálneho zafarbenia autor jednej metodiky (Meril C. R., Goldman D. a Van Keuren M. L.: Electrophoresis 3, 17, 1982) doporučuje po prvom farbení ešte dvakrát odfarbiť a farbenie znova zopakovat.The disadvantages of the kits produced so far are mainly that the gel has a relatively intense background after processing. According to the company's instructions, the workflow takes a very long time or to achieve optimum coloring, the author of one methodology (Meril C.R., Goldman D and Van Keuren M.L .: Electrophoresis 3, 17, 1982) recommends bleaching twice and repeating the staining after the first staining.

Uvedené nevýhody odstraňuje súprava na stanovenie bielkovín detekčnou technikou striebrom pódia vynálezu. Podstata vynálezu spočívá v tom, že súprava obsahuje oddelene zložky vo formě roztokov pre přípravu pracovných roztokov. Obsahuje metanol, kyselinu octovú, glutaraldehyd a vodu pre přípravu fixačno-vymývacieho roztoku, s výhodou v objemových pomeroch 50 : : 12 : 38 : 0,25. Pre přípravu amoniakálneho strieborného komplexu ako farbiaceho roztoku súprava obsahuje vodný roztok hydroxidu sodného a hydroxidu draselného alebo ich zmes a roztok dusičnanu strieborného. Pře přípravu vymývacieho roztoku obsahuje roztok hydroxidu sodného s výhodou o koncentrácii 0,001 M před použitím. Pre přípravu vývojky súprava obsahuje roztok kyseliny citrónovej, vodný roztok formaldehydu a vodu. Pre přípravu zastavovacieho kúpela súprava obsahuje roztok metanolu a roztok kyseliny citrónovej.These disadvantages are overcome by the silver detection kit of the present invention. It is an object of the invention that the kit comprises separately components in the form of solutions for the preparation of working solutions. It contains methanol, acetic acid, glutaraldehyde and water for the preparation of a fixative wash solution, preferably in a volume ratio of 50: 12: 38: 0.25. For the preparation of the ammoniacal silver complex as a coloring solution, the kit comprises an aqueous solution of sodium hydroxide and potassium hydroxide or a mixture thereof and a silver nitrate solution. For the preparation of the wash solution, it comprises a sodium hydroxide solution preferably at a concentration of 0.001 M before use. For preparing the developer, the kit comprises a citric acid solution, an aqueous formaldehyde solution, and water. To prepare a stopping bath, the kit comprises a methanol solution and a citric acid solution.

Výhody súpravy na stanovenie bielkovín podl'a vynálezu spočívajú v tom, že aplikováním jednotlivých roztokov připravených podlá příkladu 1 a postupom podlá příkladu 2 sa obdrží gél s bielkovinami zafarbenými striebrom so zanedbatelným pozadím a celý pracovný postup trvá 160 minút.The advantages of the protein assay kit of the present invention are that the application of the individual solutions prepared according to Example 1 and the procedure of Example 2 yields a silver-stained protein gel with a negligible background and the entire procedure takes 160 minutes.

PřikladlEXAMPLE

Z koncentrovaných roztokov súpravy na stanovenie bielkovín detekčnou technikou striebrom sa pripravia pracovně roztoky, aj Fixačno-vymývací roztok sa připraví tak, že do 100 objemových dielov zmesi metanol, kyselina octová a voda v objemových pomeroch 50 : 12 : 38 sa přidá 1 objemový diel 25 % vodného roztoku glutaraldehydu. b ] Roztok amoniakálneho strieborného komplexu sa připraví pomalým zmiešavaním 5 objemových dielov roztoku zmesi 8,1 objemových dielov 17,3 % hydroxidu amonného a 81,4 objemových dielov 0,14 M hydroxidu sodného s 1 objemovým dielom 20 % roztoku dusičnanu strieborného a zriedením tejto zmesi 60,7 objemovými dielmi deionizovanej vody a nasledujúcim filtrováním, cj Vymývací roztok hydroxidu sodného sa připraví 200-násobným zriedením roztoku 0,2 M hydroxidu sodného, dj Vývojka sa připraví zmiešaním 0,1 objemového dielu 20 % roztoku kyseliny citrónovej, 400 objemových dielov vody a 0,4 objemových dielov 37 % vodného roztoku formaldehydu. ej Stop-kúpel sa připravil zmiešaním 400 objemových dielov 20 %-ného metanolu s 1 objemovým dielom 20 % roztoku kyseliny citrónovej. Příklad 2Working solutions are prepared from the concentrated solutions of the silver detection kit for protein determination, and the fixative-wash solution is also prepared by adding 1 volume 25 to 100 parts by volume of methanol, acetic acid and water in 50: 12: 38 by volume ratio. % aqueous glutaraldehyde solution. (b) An ammoniacal silver complex solution is prepared by slowly mixing 5 volumes of a solution of a mixture of 8.1 volumes of 17,3% ammonium hydroxide and 81,4 volumes of 0,14 M sodium hydroxide with 1 volume of 20% silver nitrate solution and diluting this solution. of the mixture with 60.7 parts by volume of deionized water followed by filtration cj Sodium hydroxide wash solution is prepared by 200-fold dilution of 0.2 M sodium hydroxide solution, dj The developer is prepared by mixing 0.1 parts by volume of 20% citric acid solution, 400 parts by volume water and 0.4 parts by volume of a 37% aqueous formaldehyde solution. A stop bath was prepared by mixing 400 parts by volume of 20% methanol with 1 part by volume of a 20% citric acid solution. Example 2

Po skončení elektroforézy bielkovín v platňovom polyakrylamidovom géle, prl použití roztokov uvedených v příklade 1 sa gél vymývá 2 X 30 minút vo fixačno-vymývacom roztoku a preperie 3 krát 15 minút vodou. Na gél sa potom pósobí 15 minút roztokom amoniakálneho strieborného komplexu. Gél sa ďalej vymývá vymývacím roztokom hydroxidu sodného 3 krát 10 minút a sa vyvolává dovtedy, kým sa objavujú nové zóny bielkovín (cca 3 minúty). Vyvoláváme sa zastaví 10 minútovým praním v stop-kúpeli a nakoniec sa gél preperie 1 hodinu vodou. Takto připravený gél sa použije na vyhodnotenie.After the protein electrophoresis in the plate polyacrylamide gel is completed, using the solutions of Example 1, the gel is eluted for 2 x 30 minutes in the fixative wash solution and washed 3 times with 15 minutes with water. The gel is then treated with an ammoniacal silver complex solution for 15 minutes. The gel is further eluted with sodium hydroxide eluting solution 3 x 10 minutes and developed until new protein zones appear (about 3 minutes). The development is stopped by a 10 minute wash in a stop bath and finally the gel is washed with water for 1 hour. The gel thus prepared is used for evaluation.

Vynález má využitie pri stanovení bielkovín v platňových polyakrylamidových géloch přítomných vo velmi nízkej koncentrácii. Uplatní sa najma v biochemických laboratóriách najróznejšej špecializácie, klinických laboratóriách i v niektorých priemyslových odvetviach napr. v pivovarníctve, farmaceutickom priemysle a pod.The invention has utility in determining proteins in plate polyacrylamide gels present at a very low concentration. It can be used especially in biochemical laboratories of the most diverse specialization, clinical laboratories and in some industrial sectors eg. in brewing, pharmaceutical industry, etc.

Claims

SUBJECT

1. A silver detection protein determination kit comprising separately components in the form of solutions for the preparation of working solutions, characterized in that it contains methanol, acetic acid, glutaraldehyde and water for the preparation of a fixative wash solution, aqueous sodium hydroxide and ammonium hydroxide solution or mixtures thereof; silver nitrate solution for the preparation of an ammoniacal silver complex as a coloring solution, sodium hydroxide solution for the wash solution, citric acid solution, aqueous formaldehyde solution and developer water, methanol solution and citric acid solution for the preparation of a stopping bath.

2. The protein determination kit of claim 1, wherein the fixative wash solution comprises methanol, acetic acid, water and glutaraldehyde in a volume ratio of 50: 12: 38: 0.25.

3. A protein determination kit according to claim 1, wherein the coloring solution prior to use comprises an ammoniacal silver complex prepared by mixing 0.1 M sodium hydroxide solution, 26% ammonium hydroxide solution, 20% silver nitrate solution and water. in a volume ratio of 10: 0.42: 1.65: 88.

4. Protein determination kit as claimed in claim 1, characterized in that the washing solution has a concentration of 0.001 M before use.

5. A protein determination kit according to claim 1, wherein the developer contains 0.1 parts by volume of a 20% citric acid solution, 0.4 parts by volume of a 37% aqueous formaldehyde solution and 400 parts by volume of water.

6. The protein determination kit of claim 1, wherein the stopping bath comprises 400 parts by volume of 20% methanol and 1 part by volume of a 20% citric acid solution.