CS261080B1

CS261080B1 - O- (4- (N-Ethyl-N-phenylamino) -6- (4-methyl-2-sulfobenzene-1-azo-2- (1-hydroxy-3,6-bisulfonate-1-yl) trisodium salt) ) amino] -l, 3,5-triazin-2-yl} starch

Info

Publication number: CS261080B1
Application number: CS869952A
Authority: CS
Inventors: Danica Mislovicova; Peter Biely; Oskar Markovic; Vladimir Kalac
Original assignee: Danica Mislovicova; Peter Biely; Oskar Markovic; Vladimir Kalac
Priority date: 1986-12-27
Filing date: 1986-12-27
Publication date: 1989-01-12
Also published as: CS995286A1

Abstract

Riešenie sa týká novej zlúčeniny trojsodnej soli 0-(4-(N-etyl-N-fenylamíno)-6-[4-metyl-2-sulfobenzén-l-azo-2-(l-hydroxy-3,6- -bissulfonaft-l-yl) amíno]-l,3,5-triazín-2-yl}- škrobu vhodnej na detekciu a selekciu mikrobiálnych producentov α-amyláz a na stanovenie aktivity α-amyláz. Riešenie má využitie v biochémii i biotechnológiiThe solution concerns a new compound of the trisodium salt of 0-(4-(N-ethyl-N-phenylamino)-6-[4-methyl-2-sulfobenzene-1-azo-2-(1-hydroxy-3,6- -bissulfonaphth-1-yl) amino]-1,3,5-triazin-2-yl}-starch suitable for the detection and selection of microbial producers of α-amylases and for the determination of α-amylase activity. The solution has applications in biochemistry and biotechnology

Description

Vynález sa týká trojsodnej soli 0-{4-(N-etyl-N-fenylamíno)-6-[4-metyl-2-sulfobenzén-l-azo-2-(l-hydroxy-3,6-bissulfonaft-l-yl)-ammo]-l,3,5-triazín-2-yljškrobu vhodnej na detekciu a selekciu mikrobiálnycb producenta v «-amyláz a na stanovenie aktivity of-amyláz.The present invention relates to the trisodium salt of O- {4- (N-ethyl-N-phenylamino) -6- [4-methyl-2-sulfobenzene-1-azo-2- (1-hydroxy-3,6-bissulfonaphth-1-one)]. yl) -amino] -1,3,5-triazin-2-yl starch suitable for detecting and selecting a microbial producer in n-amylases and for determining the activity of γ-amylases.

Doteraz bolo připravených niekolko typov chromogénnych substrátov pre ια’-amylázy. V prvom radě sú to vodonerozpustné farebné substráty ako Phadebas (Pharmacia South Seas Co.) Amylochrome (Roche Diagnostics) farebná amylóza (Calbiochem. Co.) a amylopektín (Sigma Chemical Co.). U nás bola příprava takýchto substrátov patentovaná v CS AO č. 192 202. Druhý typ farebných substrátov sú vodorozpustné, které sú výhodnejšie z dovodu rcvnomernejšieho vytvárania enzým-substrátovéhO' komplexu v celom objeme zmesi. Z nich holi připravené farebné deriváty amylopěktínu (Dyamyl I General Diagnostics, Lyosine Red-Reliable Reagents Co.), amylózy alebo škrobu modifikovaných karboxymetyláciou, hydroxypropyláciou, hydroxyetylácíou, sulfoetyláciou a pod. (US pat. č. 4 321 364, CS AO č. 237 101). Nevýhodou prvého typu vodoro-zpustných substrátov je obtiažna příprava spojená s izoláciou farebného amylopěktínu od neviazaného farbiva gelovou filtráciou na drahých dovozových molekulových sitách (Sephadex G—25).To date, several types of chromogenic substrates for γ-amylases have been prepared. Firstly, they are water-insoluble color substrates such as Phadebas (Pharmacia South Seas Co.) Amylochrome (Roche Diagnostics) color amylose (Calbiochem. Co.) and amylopectin (Sigma Chemical Co.). In our country, the preparation of such substrates was patented in CS AO no. The second type of colored substrates are water-soluble, which are preferably due to the more uniform formation of the enzyme-substrate complex throughout the volume of the composition. Of these, color derivatives of amylopectin (Dyamyl I General Diagnostics, Lyosine Red-Reliable Reagents Co.), amylose or starch modified with carboxymethylation, hydroxypropylation, hydroxyethylation, sulfoethylation and the like were prepared. (US Pat. No. 4,321,364, CS AO No. 237,101). A disadvantage of the first type of water-permeable substrates is the difficult preparation associated with the isolation of colored amylopectin from unbound dye by gel filtration on expensive imported molecular sieves (Sephadex G-25).

V druhom případe je nevýhodou nutnost chemickej modifikácie škrobu, ktorá je technicky náročná a sposobuje změny vlastností substrátu pre enzýmovú hydrolýzu a má za následok zníženie citlivosti pri detekcii i stanovení aktivity a-amyláz. Pri detekcii «-amyláz v géloch (CS AO č. 241341) sa použil kovalentne farbený derivát hydroxyetylškrobu. Hydroxyetylškrob však nie je v súčasnej době dostupný na trhu a jeho příprava je náročná a vyžaduje speciálně bezpečnostně opatrenia a taktiež použité farbivo' je dovázané z devízovej oblasti.In the latter case, the disadvantage is the need for chemical modification of the starch, which is technically demanding and causes changes in the properties of the substrate for enzymatic hydrolysis, resulting in a decrease in sensitivity in the detection and determination of the activity of α-amylases. For the detection of N-amylases in gels (CS AO No. 241341), a covalently stained hydroxyethyl starch derivative was used. However, hydroxyethyl starch is not currently available on the market and its preparation is demanding and requires special precautions and the dye used is also imported from the foreign exchange area.

Uvedené nevýhody v podstatnej miere odstraňuje tento vynález.These disadvantages are substantially eliminated by the present invention.

Podstatou vynálezu je trojsodná sol O-{4- (N-etyl-N-f enylamíno) -6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-l-azo-2- (l-hydroxy-3,6-bissulfonaft-l-yl)-amíno]-l,3,5-triazín-2-ylfškrobu.The present invention provides the trisodium salt of O- {4- (N-ethyl-N-phenylamino) -6- [4-methyl-2-sulfobenzene-1-azo-2- (1-hydroxy-3,6-bissulfonaphth-1-one)]. yl) amino] -l, 3,5-triazin-2-ylfškrobu.

Táto zlúčenina sa připraví z čiastočne hydrolyzovaného škrobu reakciou vo vodnom prostředí s obsahom 1 až 2 % hmot.hydroxidu sodného alebo draselného za přítomnosti soli ako octan, síran alebO' chlorid sodný alebo draselný pri teplote 40 až 60 °C počas 1 až 2 hodin s trojsodnou sofou 2-chlór-4- (N-etyl-N-f enylamíno) -6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-l-azo-2- (l-hydroxy-3,6-bissulfonaft-l-yl)amíno]-l,3,5-triazínu pri hmotnostných pomeroch hydrolyzovaný škrob :This compound is prepared from partially hydrolyzed starch by reaction in an aqueous medium containing 1 to 2% by weight of sodium or potassium hydroxide in the presence of a salt such as acetate, sulfate or sodium or potassium chloride at 40 to 60 ° C for 1 to 2 hours. trisodium salt of 2-chloro-4- (N-ethyl-N-phenylamino) -6- [4-methyl-2-sulfobenzene-1-azo-2- (1-hydroxy-3,6-bissulfonaphth-1-yl)] amino] -1,3,5-triazine at weight ratios hydrolyzed starch:

: trojsodná sol' 2-chlór-4-(N-etyl-N-fenylamí4 no) -6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-l-azo-2- (1-hydro<xy-3,6-bissulf onft-l-yl) amíno ] -1,3/5-triazínu : hydroxid sodný alebo draselný = = 1 : 0,3 až 0,6 : 0,3 až 0,6. Načo sa zafarbený škrob vyzráža 2 až 4 objemami 96 % obj. etylalkoholu a neviazané farbivo a farebné nižšie molekulárně frakcie škrobu sa odstráni vymýváním s roztokom obsahujúcim 1 objem 0,6 až 1 % hmot. vodného roztoku octanu sodného a 2 až 4 objemy 96 % obj. etylalkoholu.2-Chloro-4- (N-ethyl-N-phenylamino) -6- [4-methyl-2-sulfobenzen-1-azo-2- (1-hydroxy-3,6- bissulfon-1-yl) amino] -1,3 / 5-triazine: sodium or potassium hydroxide = = 1: 0.3 to 0.6: 0.3 to 0.6. Why stained starch is precipitated with 2 to 4 volumes of 96 vol. ethyl alcohol and unbound dye and colored lower molecular starch fractions are removed by elution with a solution containing 1 volume of 0.6 to 1 wt. aqueous sodium acetate solution and 2-4 volumes of 96 vol. ethanol.

Trojsodná sol O-{4-( N-etyl-N-f enylamíno )-6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-l-azo-2- (1-hydroixy-3,6-bissulfonaft-l-yl)amíno-l,3,5-triazín-2-yljškrobu je substrátom α-amyldáz a jej výhody spočívajú v tom, že má výrazné červené sfarbenie a že je rozpustná vo vodě a v pufroch, ale přitom sa dá z týchto roztokov kvantitativné vyzráža! etylalkoholom. Z tohto dovodu je vhodná na stanovenie aktivity α-amyláz, na detekciu a na selekciu producentov α-amyláz v géloch. V porovnaní s predchádzajúcim vodorozpustným substrátem připraveným na báze hydroxyetylškrobu, nový substrát vykazuje lepšie substrátové vlastnosti, ktoré sa prejavujú vo vyššej citlivosti detekcie a stanovenia aktivity of-amyláz. Ďalšia výhoda je, že čiastočne hydrolyzovaný škrob je komerčně dostupný.O- {4- (N-Ethyl-N-phenylamino) -6- [4-methyl-2-sulfobenzen-1-azo-2- (1-hydroxy-3,6-bissulfonaphth-1-yl) amino] trisodium salt The 1,3-triazin-2-yl-starch is a substrate for α-amyldases and has the advantage of having a strong red color and being soluble in water and buffers, but can be quantitatively precipitated from these solutions! ethanol. For this reason, it is suitable for the determination of α-amylase activity, for the detection and selection of α-amylase producers in gels. Compared to the previous water-soluble substrate prepared on the basis of hydroxyethyl starch, the new substrate exhibits better substrate properties, which translates into a higher sensitivity of detection and determination of the activity of? -Amylases. Another advantage is that the partially hydrolysed starch is commercially available.

Příklad g čiastočne hydrolyzovaného škrobu sa suspenduje v 100 ml vody pri 50 °C. Potom sa přidá 1,6 g farbiva Ostazín Brilliant Červeň Η—3B rozpustenej v 25 ml vody. Potom sa postupné přidává 1 g octanu sodného a po dokladnom premiešaní 1,5 g hydroxidu sodného rozpuštěného v 25 ml vody a mieša sa 2 bod. pri teplote 50 °Ό. Potom sa reakčná zmes zneutralizuje s kyselinou octovou na pH 7 a zráža etylalkoholom v pomere 3 : 1. Vyzrážaný produkt sa přefiltruje a premýva roztokom obsahujúcim 1 diel 0,6 % obj. vodného roztoku octanu sodného a 3 diely 96 % obj. etylalkoholu do bezfarebného filtrátu. Potom sa zrazenina rozpustí v 500 ml 0,6 % hmot. vodného roztoku octanu sodného a vyzráža sa s 1 500 ml etylalkoholu a znovu sa vymývá roztokom obsahujúcim 1 diel 0,6 % hmot. vodného roztoku octanu sodného a 3 diely 96 % obj. etylalkoholu až do bezfarebného filtrátu. Zrazenina se vymyje roztokom obsahujúcim 4 diely 96 % obj. etylalkoholu a 1 diel vody, potom etylalkoholom, acetónom a vysuší sa. Výťažok je 4,5 g, pričom obsah farbiva je 10,4 % hmot.Example g of partially hydrolyzed starch is suspended in 100 ml of water at 50 ° C. 1.6 g of Ostazine Brilliant Red Η-3B dissolved in 25 ml of water are then added. Subsequently, 1 g of sodium acetate is added successively and after thorough mixing of 1.5 g of sodium hydroxide dissolved in 25 ml of water and stirred for 2 points. at 50 ° Ό. The reaction mixture was then neutralized with acetic acid to pH 7 and precipitated with 3: 1 ethyl alcohol. aqueous sodium acetate solution and 3 parts of 96 vol. of ethyl alcohol into a colorless filtrate. The precipitate is then dissolved in 500 ml of 0.6 wt. of aqueous sodium acetate solution and precipitated with 1500 ml of ethyl alcohol and washed again with a solution containing 1 part of 0.6 wt. aqueous sodium acetate solution and 3 parts of 96 vol. ethyl alcohol up to a colorless filtrate. The precipitate is washed with a solution containing 4 parts of 96 vol. ethyl alcohol and 1 part water, then ethyl alcohol, acetone and dried. The yield is 4.5 g, the dye content being 10.4% by weight.

Vynález má využitie v hiochémii a biotechnologii pre detekciu a selekciu mikrobiálnych producentov α'-amyláz a pre rýchle stanovenia aktivity os-amyláz.The invention has utility in hiochemistry and biotechnology for the detection and selection of microbial α'-amylase producers and for the rapid determination of os-amylase activity.

Claims

5 261IÍ80 SUBSTITUTE O- {4- (N-Ethyl-N-phenylamino-6- [4-methyl-2-sulfobenzen-1-azo-2- (1-hydroxy-3,6- bissulfonaphth-1-yl) amino] -1,3,5-triazine-2-yl starch QPRAVA to PVAO No. 261080 (51) Int Cl.4 C 08 B 31/12 The correct name of the invention is: ' trisodium salt 0-4- (N-ethyl-N-phenylamino) -6-4-methyl-2-sulfobenzene-1-azo-2- (1-hydroxy-3,6-bissulfonaphth-1-yl) j • -amino-1,3,5-triazin-2-yl starch OFFICE AND INVENTION