CS261080B1 - Trojsodná sol' 0-(4-(N-etyl-N-fenylamíno)-6-(4-metyl-2-sulfobenzén- -l-azo-2-(l-hydroxy-3,6-bissulfonát-l-yl)amíno]-l,3,5-triazín-2-yl}škrobu - Google Patents

Abstract

Riešenie sa týká novej zlúčeniny trojsodnej soli 0-(4-(N-etyl-N-fenylamíno)-6-[4-metyl-2-sulfobenzén-l-azo-2-(l-hydroxy-3,6- -bissulfonaft-l-yl) amíno]-l,3,5-triazín-2-yl}- škrobu vhodnej na detekciu a selekciu mikrobiálnych producentov α-amyláz a na stanovenie aktivity α-amyláz. Riešenie má využitie v biochémii i biotechnológii

Description

Vynález sa týká trojsodnej soli 0-{4-(N-etyl-N-fenylamíno)-6-[4-metyl-2-sulfobenzén-l-azo-2-(l-hydroxy-3,6-bissulfonaft-l-yl)-ammo]-l,3,5-triazín-2-yljškrobu vhodnej na detekciu a selekciu mikrobiálnycb producenta v «-amyláz a na stanovenie aktivity of-amyláz.

Doteraz bolo připravených niekolko typov chromogénnych substrátov pre ια’-amylázy. V prvom radě sú to vodonerozpustné farebné substráty ako Phadebas (Pharmacia South Seas Co.) Amylochrome (Roche Diagnostics) farebná amylóza (Calbiochem. Co.) a amylopektín (Sigma Chemical Co.). U nás bola příprava takýchto substrátov patentovaná v CS AO č. 192 202. Druhý typ farebných substrátov sú vodorozpustné, které sú výhodnejšie z dovodu rcvnomernejšieho vytvárania enzým-substrátovéhO' komplexu v celom objeme zmesi. Z nich holi připravené farebné deriváty amylopěktínu (Dyamyl I General Diagnostics, Lyosine Red-Reliable Reagents Co.), amylózy alebo škrobu modifikovaných karboxymetyláciou, hydroxypropyláciou, hydroxyetylácíou, sulfoetyláciou a pod. (US pat. č. 4 321 364, CS AO č. 237 101). Nevýhodou prvého typu vodoro-zpustných substrátov je obtiažna příprava spojená s izoláciou farebného amylopěktínu od neviazaného farbiva gelovou filtráciou na drahých dovozových molekulových sitách (Sephadex G—25).

V druhom případe je nevýhodou nutnost chemickej modifikácie škrobu, ktorá je technicky náročná a sposobuje změny vlastností substrátu pre enzýmovú hydrolýzu a má za následok zníženie citlivosti pri detekcii i stanovení aktivity a-amyláz. Pri detekcii «-amyláz v géloch (CS AO č. 241341) sa použil kovalentne farbený derivát hydroxyetylškrobu. Hydroxyetylškrob však nie je v súčasnej době dostupný na trhu a jeho příprava je náročná a vyžaduje speciálně bezpečnostně opatrenia a taktiež použité farbivo' je dovázané z devízovej oblasti.

Uvedené nevýhody v podstatnej miere odstraňuje tento vynález.

Podstatou vynálezu je trojsodná sol O-{4- (N-etyl-N-f enylamíno) -6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-l-azo-2- (l-hydroxy-3,6-bissulfonaft-l-yl)-amíno]-l,3,5-triazín-2-ylfškrobu.

Táto zlúčenina sa připraví z čiastočne hydrolyzovaného škrobu reakciou vo vodnom prostředí s obsahom 1 až 2 % hmot.hydroxidu sodného alebo draselného za přítomnosti soli ako octan, síran alebO' chlorid sodný alebo draselný pri teplote 40 až 60 °C počas 1 až 2 hodin s trojsodnou sofou 2-chlór-4- (N-etyl-N-f enylamíno) -6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-l-azo-2- (l-hydroxy-3,6-bissulfonaft-l-yl)amíno]-l,3,5-triazínu pri hmotnostných pomeroch hydrolyzovaný škrob :

: trojsodná sol' 2-chlór-4-(N-etyl-N-fenylamí4 no) -6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-l-azo-2- (1-hydro<xy-3,6-bissulf onft-l-yl) amíno ] -1,3/5-triazínu : hydroxid sodný alebo draselný = = 1 : 0,3 až 0,6 : 0,3 až 0,6. Načo sa zafarbený škrob vyzráža 2 až 4 objemami 96 % obj. etylalkoholu a neviazané farbivo a farebné nižšie molekulárně frakcie škrobu sa odstráni vymýváním s roztokom obsahujúcim 1 objem 0,6 až 1 % hmot. vodného roztoku octanu sodného a 2 až 4 objemy 96 % obj. etylalkoholu.

Trojsodná sol O-{4-( N-etyl-N-f enylamíno )-6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-l-azo-2- (1-hydroixy-3,6-bissulfonaft-l-yl)amíno-l,3,5-triazín-2-yljškrobu je substrátom α-amyldáz a jej výhody spočívajú v tom, že má výrazné červené sfarbenie a že je rozpustná vo vodě a v pufroch, ale přitom sa dá z týchto roztokov kvantitativné vyzráža! etylalkoholom. Z tohto dovodu je vhodná na stanovenie aktivity α-amyláz, na detekciu a na selekciu producentov α-amyláz v géloch. V porovnaní s predchádzajúcim vodorozpustným substrátem připraveným na báze hydroxyetylškrobu, nový substrát vykazuje lepšie substrátové vlastnosti, ktoré sa prejavujú vo vyššej citlivosti detekcie a stanovenia aktivity of-amyláz. Ďalšia výhoda je, že čiastočne hydrolyzovaný škrob je komerčně dostupný.

Příklad g čiastočne hydrolyzovaného škrobu sa suspenduje v 100 ml vody pri 50 °C. Potom sa přidá 1,6 g farbiva Ostazín Brilliant Červeň Η—3B rozpustenej v 25 ml vody. Potom sa postupné přidává 1 g octanu sodného a po dokladnom premiešaní 1,5 g hydroxidu sodného rozpuštěného v 25 ml vody a mieša sa 2 bod. pri teplote 50 °Ό. Potom sa reakčná zmes zneutralizuje s kyselinou octovou na pH 7 a zráža etylalkoholom v pomere 3 : 1. Vyzrážaný produkt sa přefiltruje a premýva roztokom obsahujúcim 1 diel 0,6 % obj. vodného roztoku octanu sodného a 3 diely 96 % obj. etylalkoholu do bezfarebného filtrátu. Potom sa zrazenina rozpustí v 500 ml 0,6 % hmot. vodného roztoku octanu sodného a vyzráža sa s 1 500 ml etylalkoholu a znovu sa vymývá roztokom obsahujúcim 1 diel 0,6 % hmot. vodného roztoku octanu sodného a 3 diely 96 % obj. etylalkoholu až do bezfarebného filtrátu. Zrazenina se vymyje roztokom obsahujúcim 4 diely 96 % obj. etylalkoholu a 1 diel vody, potom etylalkoholom, acetónom a vysuší sa. Výťažok je 4,5 g, pričom obsah farbiva je 10,4 % hmot.

Vynález má využitie v hiochémii a biotechnologii pre detekciu a selekciu mikrobiálnych producentov α'-amyláz a pre rýchle stanovenia aktivity os-amyláz.

Claims (2)

1. PREDMET

   VYNALEZU

   Trojsodná sol' 0-{4-(N-etyl-N-fenylamínoj6-[4-metyl-2-sulf obenzén-l-azo-2-(1-hydroxy-3,6-bissulfonaft-l-yl)amíno]-l,3,5-triazín
2. -2-yljškrobu.

   OPRAVA k PVAO č. 261080 ( 51) Int. Cl.⁴ C 08 B 31/12

   Správný název vynálezu je: ' ' i v

   Trojsodná sol 0-4-(N-etyl-N-fenylamíno)-6-4-metyl-2-sultobenzén-l-azo-2- (l-hydroxy-3,6bissulfonaft-l-ýl) • -amíno-l,3,5-triazín-2-yl škrobu

   ÚŘAD PRO VYN&LEZY A OBJEVY