CS262561B1

CS262561B1 - Acidotolerant methylotrophic yeast strain of Candida boidinil CCY 29-37-9

Info

Publication number: CS262561B1
Application number: CS877618A
Authority: CS
Inventors: Olga Rndr Csc Volfova; Miroslava Ing Kmentova; Vladimir Krumphanzl
Original assignee: Volfova Olga; Miroslava Ing Kmentova; Vladimir Krumphanzl
Priority date: 1987-10-23
Filing date: 1987-10-23
Publication date: 1989-03-14
Also published as: CS761887A1

Abstract

Průmyslový kmen mikrooganismu Candida boidinii využívá k růstu metanol etanol, glycerol, sacharidy, směsi metanolu se sacharidy, sulfitovými výluhy a hydrolyzáty lignoceluózových odpadů, přičemž produkuje na těchto substrátech v kyselém prostředí pH 2,8 až 3,5 za nesterilních podmínek vysoké množství snadno separovatelné biomasy bohaté na bílkoviny enzym alkohol oxidázu při současné produkci vitamínu B2. Kmen je uložen ve sbírce kultur kvasinek Chemického centra SAV v Bratislavě /CC/ pod číslem CCY 29-37-9. Kmen je použitelný jako producent biomasy vhodné jako bílkovinné krmivo pro hospodářská zvířata a jako producent alkohol oxidázy, která se používá k■detekci etanolu a metanolu v biologických materiálech ve formě detekčních činidel, enzymových a kvasničných elektrod a jako bělicí složka do pracích prášků.Candida boidinii industrial micro-organism strain uses methanol ethanol, glycerol, carbohydrates, methanol-saccharide mixtures, sulphite leachates and lignocellulose waste hydrolysates for growth, producing high levels of easily separable on non-sterile conditions at pH 2.8 to 3.5. protein rich biomass enzyme alcohol oxidase while producing vitamin B2. The strain is deposited in a collection of yeast cultures of the Chemical Center SAS in Bratislava (CC) under the number CCY 29-37-9. The strain is useful as a biomass producer suitable as a protein feed for livestock and as a producer of alcohol oxidase, which is used to detect ethanol and methanol in biological materials in the form of detection reagents, enzyme and yeast electrodes, and as a bleach component for laundry powders.

Description

Vynález se týká acidotolerantního metylotrofního kvasničného kmene mikroorganismu Candida boidinii.The present invention relates to an acid-tolerant methylotrophic yeast strain of Candida boidinii.

Kmen kvasničného mikroorganismu označeného Candida boidinii 2 podle vynálezu, jehož biomasa je použitelná jako hodnotné bílkovinné krmivo pro hospodářská zvířata a jako zdroj enzymu alkohol oxidázy, využívá k růstu zejména metanol, etanol, sacharidy a směsi metanolu se sacharidy, sulfitovými výluhy a hydrolyzáty lignocelulózových odpadů. Na těchto substrátech produkuje v kyselém prostředí za nesterilních kultivačních podmének zvýšené množství biomasy, jež je bohatá na bílkoviny a esenciální aminokyseliny, dále na enzym alkohol oxidázu a vitamín B₂- Kmen je uložen ve sbírce kultur kvasinek Chemického centra SAV /CC/ pod číslem CCY 29-37-9.The strain of yeast microorganism designated Candida boidinii 2 according to the invention, whose biomass is useful as a valuable protein feed for livestock and as the source of the enzyme alcohol oxidase, uses mainly methanol, ethanol, carbohydrates and methanol-carbohydrate mixtures and lignocellulosic waste hydrolysates. On these substrates it produces an increased amount of biomass, which is rich in proteins and essential amino acids, as well as the enzyme alcohol oxidase and vitamin B ₂ under acidic conditions under non-sterile cultivation conditions. The strain is stored in the yeast culture collection Chemical Center SAV / CC / CCY 29-37-9.

Charakteristickým znakem tohoto nového průmyslového kvasničného kmene mikroorganismu je schopnost růstu s maximálními růstovými parametry i obsahem bílkovin v širokém rozmez! pH 2,8 až 4,5 média, s výhodou při pH 3,0 až 3,5, což umožňuje vést výrobní proces kvasničných bílkovin i alkohol oxidázy za nesterilních podmínek, dále se vyznačuje výrobnými separačními vlastnostmi a zvýšenou rezistencí růstu buněk vůči inhibičnímu vlivu kyseliny mravenčí.The characteristic feature of this new industrial yeast strain of microorganism is its ability to grow with maximum growth parameters and protein content in a wide range! pH 2.8 to 4.5 of the medium, preferably at pH 3.0 to 3.5, which allows the production process of yeast proteins and alcohol oxidase to be conducted under non-sterile conditions, furthermore it has production separating properties and increased resistance of cell growth to inhibitory influence formic acid.

Tento nový kmen využívá k tvorbě biomasy bohaté na bílkoviny vedle metanolu a etanolu i glycerol, sacharidy jako glukosu, xylosu, ribosu, mannosu a d-arabinosu, dále směsi metanolu se sacharidy, sulfitovými výluhy a hydrolyzáty lignocelulózových odpadů.In addition to methanol and ethanol, this new strain uses glycerol, carbohydrates such as glucose, xylose, ribose, mannose and d-arabinose, methanol-carbohydrate mixtures, sulphite leaches and lignocellulosic waste hydrolysates to produce protein-rich biomass.

Na metanolu nebo směsích s metanolem produkuje kmen kromě biomasy i zvýšená množství enzymu alkohol oxidázy a extracelulární vitamín B₂ což umožňuje současnou výrobu třech produktů .On methanol or mixtures with methanol, the strain produces, in addition to biomass, increased amounts of the enzyme alcohol oxidase and extracellular vitamin B ₂ , allowing the simultaneous production of three products.

Tato biomasa je též použitelná jako hodnotné bílkovinné krmivo pro hospodářská zvířata a jako producent enzymu alkohol oxidázy a ostatních C^ specifických produktů např. NAD, NADH, ATP aj. Alkohol oxidáza, která je používána k detekci etanolu a metanolu v biologických materiálech ve formě detekčních činidel, enzymových a kvasničných elektrod a dále jako bělící složka do ptácích prášků se dováží do ČSSR z kapitalistických států.This biomass is also useful as a valuable protein feed for livestock and as an enzyme producer of alcohol oxidase and other C ^ specific products such as NAD, NADH, ATP etc. Alcohol oxidase, which is used to detect ethanol and methanol in biological materials in the form of detection reagents, enzyme and yeast electrodes and also as a bleaching component in bird powders are imported to Czechoslovakia from the capitalist states.

Kmen Candida boidinii 2 byl získán v laboratoři dlouhodobým šlechtěním průmyslového kvasničného kmene Candida boidinii 11 Bh (AO 172 014) ve třech stupních.The Candida boidinii 2 strain was obtained in the laboratory by long-term breeding of the industrial yeast strain Candida boidinii 11 Bh (AO 172 014) in three stages.

Šlechtění v prvním stupni bylo provedeno dlouhodobou kultivací kmene č. 11 Bh v chemostatu při limitaci růstu buněk metanolem na syntetické půdě s přídavkem malého množství kvasničného výluhu (100 mg.L^-1) a nepatrného množství biotinu (10 jug v 1 litru), získaný kmen označený v tomto stupni šlechtění č. 1 se od původního kmene č. 11 Bh odlišuje hladkým povrchem kolonií na tuhých komplexních i minerálních půdách, homogenním růstem buněk ve fermentoru a vyšší růstovou rychlostí buněk. Protože kmen č. 1, tak jako výchozí kmen 11 Bh, hromadil při vyšších koncentracích metanolu a vyšších zředovacích rychlostech (nad D 0,1) v chemostátu kyselinu mravenčí v médiu, produkt, který je inhibitorem růstu buněk na metanolu ale i na jiných substrátech, byl kmen č. 1 šlechtěn v druhém stupni.Breeding in the first stage was carried out by long-term cultivation of strain No. 11 Bh in a chemostat, limiting the growth of cells with methanol on synthetic soil with the addition of a small amount of yeast extract (100 mg.L ^-1 ) and a small amount of biotin (10 µg per liter). the strain designated at this stage of breeding No. 1 differs from the original strain No. 11 Bh by the smooth surface of the colonies on solid complex and mineral soils, by homogeneous cell growth in the fermenter and a higher cell growth rate. Because strain # 1, like the starting strain 11 Bh, accumulated formic acid in the medium at higher methanol concentrations and higher dilution rates (above D 0.1) in the chemostate, a product that is an inhibitor of cell growth on methanol but also on other substrates , strain No. 1 was bred in the second stage.

Šlechtění v druhém stupni spočívalo ve vlivu selekčního tlaku kyseliny mravenčí v přítomnosti metanolu a vedlo k získání kmene se sníženou citlivostí vůči inhibičnímu vlivu kyseliny mravenčí na růst buněk. Dlouhodobým selekčním tlakem stále se zvyšující koncentrace kyseliny mravenčí v přítomnosti metanolu byly postupně získány kmeny se zvýšenou rezistentností růstu buněk na kyselinu mravenčí. Konečnou selekci byl získán kmen, který roste na médiu s metanolem až do výše 1 % (hmot) kyseliny mravenčí v médiu a nehromadi při vyšších zřeáovacích rychlostech v chemostatu a při vyšších aktuálních koncentracích metanolu v médiu kyselinu mravenčí. Kmen jehož získané vlastnosti jsou stálé byl označen Candida boidinii A7.Breeding in the second stage consisted of the influence of the formic acid selection pressure in the presence of methanol and resulted in a strain with reduced sensitivity to the inhibitory effect of formic acid on cell growth. Long-term selection pressure of ever-increasing concentration of formic acid in the presence of methanol gradually yielded strains with increased cell growth resistance to formic acid. Final selection resulted in a strain growing on medium with methanol up to 1% (w / w) formic acid in the medium and does not accumulate at higher aging rates in the chemostat and at higher actual concentrations of methanol in the medium formic acid. The strain whose acquired properties are stable was designated Candida boidinii A7.

v třetím selekčním stupni byl kmen A7 podroben selekčnímu tlaku nízkých pH média a při kontinuální kultivaci z chemostatu. Za postupného snižování pH média byl dlouhodobou kultivací při vyšších zřeáovacích rychlostech při limitaci růstu buněk metanolem získán acidotolerantní kmen Candida boidinii 2, který se vyznačuje zvýšenou rezistanoí růstu jak vůči kyselině mravenčí tak i vůči nízkým pH média 2,6 až 2,8.in the third selection stage, strain A7 was subjected to low pressure medium pH selection and continuous chemostat culture. By gradually reducing the pH of the medium, an acid-tolerant strain of Candida boidinii 2 was obtained by long-term cultivation at higher maturation rates while limiting the growth of the cells with methanol, characterized by an increased growth resistance to both formic acid and low pH of the medium of 2.6 to 2.8.

Dále je uvedena charakteristika vlastností nového acidotolerantního kmene Candida boidinii 2.The characteristics of the novel acid-tolerant strain Candida boidinii 2 are presented below.

Morfologická a fyziologická charakteristika:Morphological and physiological characteristics:

Na rozdíl od průmyslového kmene Candida boidinii 11 Bh je povrch kolonií nového acidotolerantního kmene na sladinkovém agaru i na agaru s minerální půdou obohacenou metanolem při 30 °C inkubaci hladký, lesklý, barvy světle krémové bílé. V submersních kultivacích roste kmen homogenně, bez růstu buněk na povrchu stěn kultivačních baněk a fermentorů.Unlike the Candida boidinii 11 Bh industrial strain, the surface of colonies of the new acid-tolerant strain on both malt agar and methanol-enriched mineral soil agar at 30 ° C is a smooth, glossy, light cream white color. In submersible cultures, the strain grows homogeneously, without cell growth on the surface of the flasks and fermenters.

Kmen Candida boidinii 2 roste na minerální půdě, která obsahuje 0,005 až 6 % metanolu nebo etanolu, ale i glycerolu, glukosy, xylosy, mannosy, ribosy, d-arabinosy, směsi metanolu se sacharidy, sulfitovými výluhy a hydrolyzáty lignocelulózových odpadů, dále chlorid amonný nebo síran amonný, amoniak, fosforečnan sodný nebo draselný ale i amonný, kyselinu fosforečnou, síran hořečnatý, chlorid draselný nebo sodný ve vodovodní vodě, dále malá množství kvasničného výluhu nebo melasových výpalků a nepatrná množství biotinu nebo desbiotinu.Candida boidinii 2 strain grows on mineral soil containing 0.005 to 6% methanol or ethanol, but also glycerol, glucose, xylose, mannose, ribose, d-arabinose, methanol-saccharide mixtures, sulphite leaches and lignocellulosic waste hydrolysates, ammonium chloride or ammonium sulphate, ammonia, sodium or potassium phosphate but also ammonium, phosphoric acid, magnesium sulphate, potassium or sodium chloride in tap water, small quantities of yeast extract or molasses stillage and small amounts of biotin or desbiotin.

Nejvyšších výtěžností biomasy i nejvyšších růstových rychlostí buněk dosahuje kmen na minerální půdě s 0,05 až 0,2 % metanolu nebo etanolu, glukosy, mannosy, xylosy při 30 °C a při obohacení minerální půdy o kvasničný výluh nebo melasové výpalky (100 až 200 mg.L ¹) a biotin (10 ^ug.L^-''') .The highest biomass yields and highest cell growth rates are achieved on mineral soil with 0.05 to 0.2% methanol or ethanol, glucose, mannose, xylose at 30 ° C and enriched mineral soil with yeast extract or molasses stillage (100 to 200 mg.L ¹ ) and biotin (10 µg.L ^- 1).

Na rozdíl od kmene č. 11 Bh se nový acidotolerantní kmen č. 2 vyznačuje 40% výtěžností na metanol, tj. o 7 % vyšší výtěžností než má rodičovský kmen, dále vyšší růstovou rychlostí na metanolu, která je u_max 0,16 až 0,2, vyšším obsahem dusíkatých buněčnatých látek, které dosahují u nového kmene 62 až 65 %, vyšším obsahem čistých bílkovin tj. 50 až 53 % bohatých na esenciální aminokyseliny zejména na lysin, valin, threonin a zvýšenou tvorbou vitamínu B^.Unlike strain 11 Bh, the new acidotolerant strain 2 is characterized by a 40% yield on methanol, ie 7% higher than the parent strain, as well as a higher growth rate on methanol, which is at _max 0.16 to 0 2, with a higher content of nitrogenous cellular substances, which reach 62 to 65% in the new strain, a higher content of pure proteins, ie 50 to 53% rich in essential amino acids, especially lysine, valine, threonine and increased production of vitamin B ^.

Kmen produkuje intracelulárně zvýšená množství enzymu alkohol oxidázy, zejmén při limitaci růstu metanolem nebo metanolových směsí v chemostatu při nízkých zřeSovacích rychlostech D 0,03 až 0,1. Obsah alkohol oxidázy v buňkách dosahuje 15 až 20 % obsahu extrahovatelných buněčných bílkovin.The strain produces intracellularly increased amounts of the enzyme alcohol oxidase, in particular by limiting the growth of methanol or methanol mixtures in the chemostat at low dilution rates D of 0.03 to 0.1. The alcohol oxidase content in the cells reaches 15 to 20% of the extractable cell protein content.

Dále na rozdíl od kmene Candida boidinii 11 Bh nový acidotolerantní kmen č. 2 roste na metanolu i v přítomnosti kyseliny mravenčí až do 0,8 až 1,0 % (hmot) přičemž do 0,4 % kyseliny mravenčí spolu s metanolem roste s maximálními růstovými parametry a nehromadí kyselinu mravenčí v médiu při vyšších zře3ovacích rychlostech v chemostatu na metanolu.Furthermore, unlike Candida boidinii 11 Bh, the new acidotolerant strain # 2 grows on methanol up to 0.8 to 1.0% (w / w) in the presence of formic acid, while up to 0.4% formic acid together with methanol increases with maximum growth parameters and does not accumulate formic acid in the medium at higher dilution rates in the chemostat on methanol.

Na rozdíl od kmene č. 11 Bh, který má optimum růstu při pH 4,2 až 4,5, roste nový acidotolerantní kmen č. 2 s maximálními růstovými parametry i obsahem bílkovin v buňkách nejen při nízkých pH média, ale i v širokém rozmezí pH 2,8 až 4,5.Unlike strain 11 Bh, which has a growth optimum at pH 4.2 to 4.5, the new acid-tolerant strain 2 grows with maximum growth parameters and protein content in cells not only at low pH media but also over a wide range pH 2.8 to 4.5.

Nový kmen umožňuje vést kultivace kvasinek, tj. výrobní proces, kontinuální i vsádkové, přípravy kvasničných mikrobních bílkovin a alkohol oxidázy za nesterilních podmínek bez nebezpečí infekce a znehodnocení produktu z metanolu, ale i z jiných výše uvedených surovin, při nízkých pH média 3,0 až 3,5 při zachování maximálních růstových parametrů i obsahu bílkovin a enzymu za současné výroby vitamínu B_2< The new strain allows yeast cultivation, ie production process, continuous and batch, preparation of yeast microbial proteins and alcohol oxidase under non-sterile conditions without risk of infection and degradation of the product from methanol, but also from other raw materials mentioned above, 3.5 while maintaining maximum growth parameters as well as protein and enzyme content while producing vitamin B _{2 <}

Claims

SUBJECT OF THE INVENTION

Acldotolerant methylotrophic yeast strain of Candida boidinii CCY 29-37-9 whose biomass is useful as a valuable protein feed for livestock and its source of the enzyme alcohol oxidase.