CS263066B1 - Stabilní bioaenzory a zpŮ30b jejich výroby - Google Patents

Abstract

Stabilní bioaenzory obsahující biologicky aktivní látky s SH enzymy a membránový materiál chránící před inaktivací těžkými kovy. Přednostními membránovými složkami schopnými vázat těžké kovy jsou komplexující ligandy, aromatické heterocyklické sloučeniny a endocyklickým terciárním dusíkovým atomem a funkční skupiny, která tvoří s těžkými kovy málo disociované sloučeniny. Pracovní a skladovací stabilita biosenzorů podle vynálezu se prodlouží ze dnů na týdny

Description

Vynález se týká stabilních biosenzorů, obsahujících biologicky aktivní vrstvy s SH enzymem a membránový materiál nerozpustný ve vodných roztocích a schopný vázat těžká kovy a způsobu jejich výroby· Dají se použit v medicíně, biotechnologii, zemědělství a potravinářství, při ochraně životního prostředí.

Pro vývoj biospecifických elektrod biosenzorů, která se získají z ampérometrických,potenciometrických a konduktometrických elektrod,případně z ionselektivnich tranzistorů řízených polem a enzymů imobilízováných v membráně tedy biologicky aktivních membrán, ee dá použít řada -SH enzymů, např. ureáza. asparaginasa/<glukosidasa, alkoholdehydrogenaea a dalěí. Sada z těchto biospecifických elektrod je při pravena k zavedeni do praxe / F. W. Scheller a spol.:Blosen sors 1 (1985, 135 - 160), ačkoliv jejich širšímu použiti stoji v cestě řada nevyřešených problémů. Jedním z nich je částečně snížená pracovní a skladovací stabilita takových biospecifických elektrod, v jejichž biokatalyticky aktivní membráně jsou lmobilizovány -SH enzymy. To znamená taková enzymy, která potřebuji pro vznik biokatalytické aktivity volná sulfhydrylové skupiny ( -dále označovaná -SH skupiny) Tyto -SH enzymy reaguji neobyčejně citlivě na nejmenší stopy těžkých kovů tim, že ee inaktivujií Při analytických pos tupech s použitím biospecifických elektrod je ale možné jen zřídka se vyhnout přítomnosti iontů těžkých kovů. Jednak se připravují měrné roztoky z chemikálii, které pravidelně, i ’· přes nejvyšěí stupeň čistoty, obsahuji ještě stopy těžkých

263 066 kovů, které jsou věak postačující k tonu, aby inaktivovaly při kontinuálním působeni -SH enzymy dlouhodobé používaných biospecifických elektrod· bále difunduji trvale ionty těžkých kovů z elektro^ např· referentnich elektrod, do němých roztoků, ktoré je obklopuji· Výsledkem ja, žo oo inaktivuji -SH enzymy nacházející oe v blokatalytlcky aktivních membránách.

Z těchto důvodů je dále zřejmá^ žo se těžkými kovy inaktivuji nejen ledovaná enzymy. 3e známá, žo -SH enzymy joou obopženy taká např. v integrovaných blokatalytlcky aktivních

TjákcTjeou mikroorganismy nebo buňky rostlinného nebo živočišného původu. Taková systémy byly na základě avé biologické aktivity použity pro výrobu mikrobiálních elektrod pro analytiku substrátů. I tady věak existuji problémy malé pracovní a skladovací stability způsobená inaktivad těžkými kovy.

Z uvedených problémů vyplývají omezené možnosti použiti biospecifických a mikrobiálních elektrod. Na ochranu -SH enzymů před deaktivaci ionty těžkých kovů bylo v minulosti popsáno několik způsobů. (DEOffenlegungsschrift 3 347 104 a ddr W. P. C 12 Q/2695760). Řešení, které je v těchto patentech a v nich uvedené dalěl literatuře popsáno) je založeno na ochraně SH enzymů před jedno a vlcemocnými ionty těžkých kovů měrných roztoků přidáním rozpustných sulfhydrylových sloučenin bu3 samotných nebo sulfhydrylových sloučenin s chelstotvornými stabilizátory nobo sulfhydrylových sloučenin v kombinaci s chelatotvornými, redukujícími a enzymovými stabilizátory. Tento postup má věak značná nedostatky, protože se kromě vysoce čistých a tim i drahých chemikálii při něm používají taká chemikálie nepříjemně páchnoucí. Všeobecné rutinní použiti těchto postupů se nedá doporučit.

Tyto závazné nevýhody řešistabilni biosenzory a způsob jejich výroby podle vynálezu.Předmět vynálezu umožňuje získat použitelná biosenzory stabilizaci blokatalytlcky aktivních vrstev.

263 066

- 3 Podle vynálezu Jsou vytvořeny blosenzory základní» elektrochemický» senzore» e biologicky aktivní vrstvou, která se skládá z biologicky aktivního materiálu a vo vodě nerozpustného membránového materiálu schopného vázat těžká kovy· Oako biologicky aktivní materiál se používá jeden nebo -SH enzymů, jako je např. ureasa, asparaglnaea, Z -glukoeidasa, alkoholdehydrogenasa nebo jeden čl vlče SH enzymů obsahujících výže Integrovaný biologicky aktivní systém, jako jeou např. mikroorganismy a buňky nebo organely rostlin nebo zvířat. Materiál membráni který váže těžká kovy, je obecně rozpustný v organických rozpouštědlech. V některých případech se ale může taká jednat o anorganické i organické materiály v suspendované formě. V každém případě materiály tvořící membránu a schopné vázat těžké kovy jsou nerozpustné vo vodných roztocích. Membránové materiály vážicl těžké kovy obsahuji chemicky vázané komplexotvorné ligandy nebo jiné funkční skupiny, které tvoři s těžkými kovy málo disociované sloučeniny. V úvahu přitom přicházejí takové materiály vážicl těžké kovy^ které máji pro vazbu jedno nebo vícemocných těžkých kovů strukturu s chemicky vázanými chelatotvornýml skupinami typu kyseliny iminodioctové a 8-hydroxychinolinu nebo aromatické heterocyklické sloučeniny e endocyklickým terciárním dusíkovým atomem, přednostně imldazol. Oako membránové materiály vážící těžké kovy na ochranu SH enzymů «(tlivých na těžké kovy v membránách biosenzorů se hodí také materiály obsahující SH skupiny, které tvoři obzvlášť ' málo disociované merkaptidy těžkých kovů. Pro rozpustnost v organických rozpouštědlech se s výhodou jako organické materiály tvořící membránu používají funkcionalizovaný acetát celulózy, polyvinylalkohol nebo podobné polymery s uvedenými skupinami. Na výrobu membrán se ale také mohou použit suspenze vyrobené z roztoků nesiTovaného a nemodifikovaného acetátu celulózy nebo polyvinylchloridu v organických rozpouštědlech nerozpustných a jemně práškovaných nosičů organického neboanorganického původu s kovalentně vázanými chslototvornými skupinami nebo funkčními'skupinami schopnými vázat těžká

263 066 kovy·

Biosenzory se vyrobí tak, že ae amperometrický, potenciometrický nebo konduktometrický základní senzor nebo lonaalektlv nl polem Slzený tranzietor; která mají na senzitivním povrchu zachycená SH-enzymy nebo emáei SH-enzyaů nebo výše Integrovaná systémy SH-enzymy obsahující· ponoří do roztoku membránového materiálu schopného vázat těžká kovy v organickém rozpouátědle nebo emáei rozpouštědel. Případně ee základní senzor ponoří do suspenze nerozpustného materiálu schopného vázat těžká kovy a SH-enzymů nebo směsi SH-enzyafl nebo výše integrovaného systému tyto enzymy obsahujícího v roztoku membránového materiálu v organickém rozpouštědle. Odpařením organického rozpouštědla při pokud možno nízké teplotě nebo ponořením základního senzoru do vodného roztoku se vytvoří membrána, která obsahuje SH enzymy nebo výše integrovaná biologické systémy obsahujíc! tyto enzymyichráněná před inaktivaci těžkými kovy a schopná je vázat. Na zlákáni membrán a membránovými materiály podle vynálezu na ochranu SH-enzymů bioeenzorů před inaktivaci těžkými kovy Jaou vhodná £ jiné technologie. Pro modifikaci popsaného způsobuje mflže např. biokatalyticky aktivní membrána na povrchu základního senzoru získat také tak; že se senzor s volným senzitivním povrchem ponoří nejprve do avspenze popsaného materiálu se schopnosti vázat těžká kovy a SH enzymu v těkavém organickém rozpouštědle; přičemž rozpouštědlo ee pak odpaří. Biosenzory a amperomatrickými potenciometrickými nebo konduktemetrickými bioapecifickými elektrodami) případně enzymovanými tranzistory řízenými polem s SH enzymy jako biokatalyzátory, získané popsaným způsobem, se vyznačuji pozoruhodně vysokou pracovní a skladovací stabilitou. Pracovní stabilita ae mflže ze 3 << 4 dnů rozšířit nejméně na 2«& 3 týdny; Použitelnost takového stabilizovaného bioeenzorů je samozřejmě závislá na obsahu těžkých kovů v mádlu, protože kapacita membrán pro těžká kovy není omezena. Za obvyklých podmínek kvantitativní analýzy substrátů pomoci bioeenzorů ss šle za všech okolnosti do— 5 —

26? 066 sáhuje u stabilizovaných biosenzorů podle vynálezu doba použiti dva týdny· To znananá podstatný pokrok proti předchozímu stavu techniky a dovoluje delši, Širší a tia efektivnější použiti biosenzorů; vyrobených a SH enzymy v biologicky aktivní vrstvě· Předmět vynálezu je dále objasněn na příkladech, ale jeho rozsah ee tím neomezuje· přiklad 1 mg acetátu celulózy modifikovaného SH-skupinami (obsah SH skupin 22 ^imo3^.materiálu) se rozpustí za mícháni při teplotě místnosti v 2,5 ml čerstvě destilovaného dimethylformamidu. Současně se naváže adsorpčně ureáea na senzitivní povrch kombinované pH elektrody, ktorý byl uvoden do aktivní formy obvyklým způsobem· Takto upravená pH elektroda ee ponoří na aei 5 sekund do roztoku výše uvedeného polymeru. Pro získáni biosenzoru se zpracovává dále dvěma způsoby. Při prvním ae ponoří elektroda do acetonu a rozpouštědlo se odpaří při teplotě místnosti. Při druhém se pH elektroda hned po namočeni do roztoku polymeru ponoří do vodného roztoku. V obou případech se vytvoří membrána, která obsahuje ureázu a je na pH senzitivním povrchu pH elektrody pevně vázána. Taková potenciometrická elektroda se může používat pro stanoveni močoviny ve fyziologických roztocích nejméně 3 týdny. Má ještě po 10 dnech více než 50 % počáteční aktivity; zatímco stejná·; ale z obvyklého nemodifikovaného acetátu celulózy vyrobená, enzymová elektroda již ρο3^4 dnech nemá žádnou aktivitu. Zmobilizovaná ureáza je tudíž zcela inaktlvova ná.

Přiklad 2

Ureása, polyvinylchlorid, práškovaný imidazolový polymer připravený podle DDR W,P. 124405 (obsah imidazolu 1,46 mmol/ g nosiče) ve stejných váhových poměrech (1:1:1) se rozpustí, respektive suspenduje^ v Čerstvě destilovaném tetrahydrofuranu

- 6 263 066 zbaveném peroxidů. Do «lehané suspenze ee ponoří připravené kombinované pH elektroda a organické rozpouštědlo ae pak nechá při teplotě místnosti odpařit. Vytvořená biologicky aktivní membrána má vysokou stabilitu ureázy, která ja při k>ždoden-_z nimtříhodinovém použiti po týdnu ještě nezměněná· Po dvoutýdenním použiti za stejných podmínek má tato enzymová elektroda jeětě 60 % původní aktivity· Stejná elektroda, ale bez pólyměrní komponenty, která váže těžké kovy, je již po 3 dnech áplně inaktlvni.

Claims (7)

1. pSedkít vykálezu

   1» Stabilní bioeenzory na bázi elektrochemických základních sen zorů a biokatalytlcky aktivní vrstvou, vyznačené tim* že biokatalytlcky aktivní vrstvu tvoři biologicky aktivní látky v kombinaci a membránovým materiálem nerozpustným vs vodných roztocích i o· ftčBopnýni vázal těžká kovy»
2. 2« Stabilní bioeenzory podle bodu 1, vyznačené tlm, že jako bio logicky aktivní látky ee používají jeden nebo více SH enzymů v Izolované formě nebo výše integrované, biologicky aktivní systámy obsahující takové SH enzymy.
3. 3. Stabilní biossnzory podle bodu 1, vyznačené tim, že jako membránový materiál se schopnosti vázat těžké kovy se použijí ve vodě nerozpustné organické nebo anorganické nosiče s kovalentně vázanými komplexotvornýoi skupinami nebo aromatickými heterocyklickýroi sloučeninami s endocyklickýra terclálnim dusíkovým atomem nebo s funkčními skupinami tvořícími 8 těžkými kovy málo disociované sloučeniny.
4. 4. Způsob výroby stabilních biosenzorů, vyznačený tlm, že se elektrochemický základní senzor β vrstvou biologicky aktivní látky uvede do styku s membránovým, ve vodě nerozpustným materiálem schopným vázat těžké kovy.
5. 5. Způsob podle bodu 4, vyznačený tim; že elektrochemický základní senzor s SH enzymem nebo směsí SH enzymů nebo s výše integrovaným systémem obsahujícím tyto SH enzymy, zachyceným na aktivním povrchy se ponoř! do roztoku membránového materiálu schopného vázat těžké kovy v organickém rozpouštědle nebo směsi rozpouštědel a rozpouštědlo se pak odpaří.

   - 8 —

   263 066
6. 6, Způsob V I podle bodu 4» vyznačený ti®; že ee elektrochemický základní senzor ponoří do suspenze tvořené roztoka· membránovéhovrozpustného v organic- kán rozpouštědle e nerozpustným materiálen schopný» vázat těžké kovy a SH enzymem nebo eměei SH enzymů nebo výěe integrovaným systémem,obsahujícím takové enzymy, a organické rozpouštědlo ee pak odpaří,
7. 7. Způsob podle bodu 5 vyznačený ti®, že se biokatalyticky aktivní vrstva vytvoří ponořením elektrochemického základního senzoru opatřeného nejprve SH enzymem nebo směsi SH enzymů nebo výěe integrovaným systémem obsahujícím SH enzymy a membránovým materiálem schopným vázat těžké kovy do vodného roztoku.