CS263066B1

CS263066B1 - Stable bioaensors and their production

Info

Publication number: CS263066B1
Application number: CS876301A
Authority: CS
Inventors: Manfred Ing Kuhn; Milan Ing Csc Benes
Original assignee: Manfred Ing Kuhn; Benes Milan
Priority date: 1987-08-28
Filing date: 1987-08-28
Publication date: 1989-04-14
Also published as: CS630187A1

Abstract

Stabilní bioaenzory obsahující biologicky aktivní látky s SH enzymy a membránový materiál chránící před inaktivací těžkými kovy. Přednostními membránovými složkami schopnými vázat těžké kovy jsou komplexující ligandy, aromatické heterocyklické sloučeniny a endocyklickým terciárním dusíkovým atomem a funkční skupiny, která tvoří s těžkými kovy málo disociované sloučeniny. Pracovní a skladovací stabilita biosenzorů podle vynálezu se prodlouží ze dnů na týdnyStable biosensors containing biologically active substances with SH enzymes and a membrane material protecting against inactivation by heavy metals. Preferred membrane components capable of binding heavy metals are complexing ligands, aromatic heterocyclic compounds with an endocyclic tertiary nitrogen atom and functional groups that form compounds with heavy metals that are poorly dissociated. The working and storage stability of the biosensors according to the invention is extended from days to weeks

Description

Vynález se týká stabilních biosenzorů, obsahujících biologicky aktivní vrstvy s SH enzymem a membránový materiál nerozpustný ve vodných roztocích a schopný vázat těžká kovy a způsobu jejich výroby· Dají se použit v medicíně, biotechnologii, zemědělství a potravinářství, při ochraně životního prostředí.The invention relates to stable biosensors comprising biologically active layers with SH enzyme and membrane material insoluble in aqueous solutions and capable of binding heavy metals and processes for their production.

Pro vývoj biospecifických elektrod biosenzorů, která se získají z ampérometrických,potenciometrických a konduktometrických elektrod,případně z ionselektivnich tranzistorů řízených polem a enzymů imobilízováných v membráně tedy biologicky aktivních membrán, ee dá použít řada -SH enzymů, např. ureáza. asparaginasa/<glukosidasa, alkoholdehydrogenaea a dalěí. Sada z těchto biospecifických elektrod je při pravena k zavedeni do praxe / F. W. Scheller a spol.:Blosen sors 1 (1985, 135 - 160), ačkoliv jejich širšímu použiti stoji v cestě řada nevyřešených problémů. Jedním z nich je částečně snížená pracovní a skladovací stabilita takových biospecifických elektrod, v jejichž biokatalyticky aktivní membráně jsou lmobilizovány -SH enzymy. To znamená taková enzymy, která potřebuji pro vznik biokatalytické aktivity volná sulfhydrylové skupiny ( -dále označovaná -SH skupiny) Tyto -SH enzymy reaguji neobyčejně citlivě na nejmenší stopy těžkých kovů tim, že ee inaktivujií Při analytických pos tupech s použitím biospecifických elektrod je ale možné jen zřídka se vyhnout přítomnosti iontů těžkých kovů. Jednak se připravují měrné roztoky z chemikálii, které pravidelně, i ’· přes nejvyšěí stupeň čistoty, obsahuji ještě stopy těžkýchFor the development of biospecific electrodes of biosensors, which are obtained from amperometric, potentiometric and conductometric electrodes, optionally from field-controlled ionselective transistors and membrane-immobilized enzymes, i.e. biologically active membranes, many -SH enzymes can be used, e.g. urease. asparaginase / glucosidase, alcohol dehydrogenaea and others. A set of these biospecific electrodes is prepared to be put into practice / F. W. Scheller et al. ,Losen sors 1 (1985, 135-160), although a number of unresolved problems hinder their wider application. One of these is the partially reduced working and storage stability of such biospecific electrodes in which the -SH enzymes are immobilized in the biocatalytically active membrane. That is, those enzymes that need free sulfhydryl groups (hereinafter referred to as -SH groups) to produce biocatalytic activity. These -SH enzymes react extremely sensitively to the smallest traces of heavy metals by inactivating in analytical procedures using biospecific electrodes. rarely avoid the presence of heavy metal ions. On the one hand, chemical solutions are prepared, which regularly, despite the highest degree of purity, still contain traces of heavy

263 066 kovů, které jsou věak postačující k tonu, aby inaktivovaly při kontinuálním působeni -SH enzymy dlouhodobé používaných biospecifických elektrod· bále difunduji trvale ionty těžkých kovů z elektro^ např· referentnich elektrod, do němých roztoků, ktoré je obklopuji· Výsledkem ja, žo oo inaktivuji -SH enzymy nacházející oe v blokatalytlcky aktivních membránách.263 066 metals, which are sufficient to a ton to inactivate under continuous action -SH enzymes of long-term used biospecific electrodes · permanently diffuse heavy metal ions from electrodes, eg reference electrodes, into silent solutions that surround them · They inactivate -SH enzymes found in block-catalytically active membranes.

Z těchto důvodů je dále zřejmá^ žo se těžkými kovy inaktivuji nejen ledovaná enzymy. 3e známá, žo -SH enzymy joou obopženy taká např. v integrovaných blokatalytlcky aktivníchFor these reasons, it is further evident that not only the ice enzymes are inactivated with heavy metals. It is known that -SH enzymes are also associated with, e.g., integrated, block-catalytically active enzymes.

TjákcTjeou mikroorganismy nebo buňky rostlinného nebo živočišného původu. Taková systémy byly na základě avé biologické aktivity použity pro výrobu mikrobiálních elektrod pro analytiku substrátů. I tady věak existuji problémy malé pracovní a skladovací stability způsobená inaktivad těžkými kovy.These are microorganisms or cells of plant or animal origin. Such systems have been used to produce microbial electrodes for substrate analysis based on their biological activity. Again, however, there are problems of poor working and storage stability due to heavy metal inactivation.

Z uvedených problémů vyplývají omezené možnosti použiti biospecifických a mikrobiálních elektrod. Na ochranu -SH enzymů před deaktivaci ionty těžkých kovů bylo v minulosti popsáno několik způsobů. (DEOffenlegungsschrift 3 347 104 a ddr W. P. C 12 Q/2695760). Řešení, které je v těchto patentech a v nich uvedené dalěl literatuře popsáno) je založeno na ochraně SH enzymů před jedno a vlcemocnými ionty těžkých kovů měrných roztoků přidáním rozpustných sulfhydrylových sloučenin bu3 samotných nebo sulfhydrylových sloučenin s chelstotvornými stabilizátory nobo sulfhydrylových sloučenin v kombinaci s chelatotvornými, redukujícími a enzymovými stabilizátory. Tento postup má věak značná nedostatky, protože se kromě vysoce čistých a tim i drahých chemikálii při něm používají taká chemikálie nepříjemně páchnoucí. Všeobecné rutinní použiti těchto postupů se nedá doporučit.These problems result in limited possibilities of using biospecific and microbial electrodes. Several methods have been described in the past to protect -SH enzymes from inactivation by heavy metal ions. (DEOffenlegungsschrift 3,347,104 and ddr W. P. C 12 Q / 2695760). The solution described in these patents and the following literature is based on the protection of SH enzymes from single and blood-borne ions of heavy metal solutions by adding soluble sulfhydryl compounds either alone or sulfhydryl compounds with noble sulfhydryl compound chelating agents in combination with chelating, reducing and enzyme stabilizers. However, this process has considerable drawbacks, since in addition to highly pure and thus expensive chemicals, it also uses such unpleasantly odorous chemicals. General routine use of these procedures is not recommended.

Tyto závazné nevýhody řešistabilni biosenzory a způsob jejich výroby podle vynálezu.Předmět vynálezu umožňuje získat použitelná biosenzory stabilizaci blokatalytlcky aktivních vrstev.The present invention makes it possible to obtain useful biosensors by stabilizing block-catalytically active layers.

263 066263 066

- 3 Podle vynálezu Jsou vytvořeny blosenzory základní» elektrochemický» senzore» e biologicky aktivní vrstvou, která se skládá z biologicky aktivního materiálu a vo vodě nerozpustného membránového materiálu schopného vázat těžká kovy· Oako biologicky aktivní materiál se používá jeden nebo -SH enzymů, jako je např. ureasa, asparaglnaea, Z -glukoeidasa, alkoholdehydrogenasa nebo jeden čl vlče SH enzymů obsahujících výže Integrovaný biologicky aktivní systém, jako jeou např. mikroorganismy a buňky nebo organely rostlin nebo zvířat. Materiál membráni který váže těžká kovy, je obecně rozpustný v organických rozpouštědlech. V některých případech se ale může taká jednat o anorganické i organické materiály v suspendované formě. V každém případě materiály tvořící membránu a schopné vázat těžké kovy jsou nerozpustné vo vodných roztocích. Membránové materiály vážicl těžké kovy obsahuji chemicky vázané komplexotvorné ligandy nebo jiné funkční skupiny, které tvoři s těžkými kovy málo disociované sloučeniny. V úvahu přitom přicházejí takové materiály vážicl těžké kovy^ které máji pro vazbu jedno nebo vícemocných těžkých kovů strukturu s chemicky vázanými chelatotvornýml skupinami typu kyseliny iminodioctové a 8-hydroxychinolinu nebo aromatické heterocyklické sloučeniny e endocyklickým terciárním dusíkovým atomem, přednostně imldazol. Oako membránové materiály vážící těžké kovy na ochranu SH enzymů «(tlivých na těžké kovy v membránách biosenzorů se hodí také materiály obsahující SH skupiny, které tvoři obzvlášť ' málo disociované merkaptidy těžkých kovů. Pro rozpustnost v organických rozpouštědlech se s výhodou jako organické materiály tvořící membránu používají funkcionalizovaný acetát celulózy, polyvinylalkohol nebo podobné polymery s uvedenými skupinami. Na výrobu membrán se ale také mohou použit suspenze vyrobené z roztoků nesiTovaného a nemodifikovaného acetátu celulózy nebo polyvinylchloridu v organických rozpouštědlech nerozpustných a jemně práškovaných nosičů organického neboanorganického původu s kovalentně vázanými chslototvornými skupinami nebo funkčními'skupinami schopnými vázat těžkáAccording to the invention blosensors are provided with a basic " electrochemical " sensor with a biologically active layer consisting of a biologically active material and a water-insoluble membrane material capable of binding heavy metals. Oako biologically active material utilizes one or -SH enzymes such as eg urease, asparagine, Z-glucoeidase, alcohol dehydrogenase, or one cell of SH enzymes containing the above Integrated biologically active system, such as microorganisms and cells or organelles of plants or animals. The material that binds the heavy metal membrane is generally soluble in organic solvents. However, in some cases, these may be inorganic or organic materials in suspended form. In any case, the membrane forming materials and capable of binding heavy metals are insoluble in aqueous solutions. Heavy metal weighing membrane materials contain chemically bonded complexing ligands or other functional groups that form poorly dissociated compounds with heavy metals. Suitable heavy metal weighing materials are those which have a structure with chemically bonded chelating groups such as iminodiacetic acid and 8-hydroxyquinoline or an aromatic heterocyclic compound with an endocyclic tertiary nitrogen atom for the binding of mono- or polyvalent heavy metals. Oako heavy metal binding materials for the protection of SH enzymes (materials sensitive to heavy metals in the biosensor membranes are also suitable materials containing SH groups, which form particularly low dissociated heavy metal mercaptides. For solubility in organic solvents, preferably as membrane forming organic materials However, suspensions made from solutions of unsaturated and unmodified cellulose acetate or polyvinyl chloride in organic solvents insoluble and finely powdered carriers of organic or inorganic origin with covalently bonded chlorine-forming groups or functional groups may also be used for the production of membranes. 'groups able to bind heavy

263 066 kovy·263 066 metals ·

Biosenzory se vyrobí tak, že ae amperometrický, potenciometrický nebo konduktometrický základní senzor nebo lonaalektlv nl polem Slzený tranzietor; která mají na senzitivním povrchu zachycená SH-enzymy nebo emáei SH-enzyaů nebo výše Integrovaná systémy SH-enzymy obsahující· ponoří do roztoku membránového materiálu schopného vázat těžká kovy v organickém rozpouátědle nebo emáei rozpouštědel. Případně ee základní senzor ponoří do suspenze nerozpustného materiálu schopného vázat těžká kovy a SH-enzymů nebo směsi SH-enzyafl nebo výše integrovaného systému tyto enzymy obsahujícího v roztoku membránového materiálu v organickém rozpouštědle. Odpařením organického rozpouštědla při pokud možno nízké teplotě nebo ponořením základního senzoru do vodného roztoku se vytvoří membrána, která obsahuje SH enzymy nebo výše integrovaná biologické systémy obsahujíc! tyto enzymyichráněná před inaktivaci těžkými kovy a schopná je vázat. Na zlákáni membrán a membránovými materiály podle vynálezu na ochranu SH-enzymů bioeenzorů před inaktivaci těžkými kovy Jaou vhodná £ jiné technologie. Pro modifikaci popsaného způsobuje mflže např. biokatalyticky aktivní membrána na povrchu základního senzoru získat také tak; že se senzor s volným senzitivním povrchem ponoří nejprve do avspenze popsaného materiálu se schopnosti vázat těžká kovy a SH enzymu v těkavém organickém rozpouštědle; přičemž rozpouštědlo ee pak odpaří. Biosenzory a amperomatrickými potenciometrickými nebo konduktemetrickými bioapecifickými elektrodami) případně enzymovanými tranzistory řízenými polem s SH enzymy jako biokatalyzátory, získané popsaným způsobem, se vyznačuji pozoruhodně vysokou pracovní a skladovací stabilitou. Pracovní stabilita ae mflže ze 3 << 4 dnů rozšířit nejméně na 2«& 3 týdny; Použitelnost takového stabilizovaného bioeenzorů je samozřejmě závislá na obsahu těžkých kovů v mádlu, protože kapacita membrán pro těžká kovy není omezena. Za obvyklých podmínek kvantitativní analýzy substrátů pomoci bioeenzorů ss šle za všech okolnosti do— 5 —The biosensors are produced by either an amperometric, potentiometric or conductometric base sensor or a lonaalectric field tear transistor; Integrated systems SH-enzymes comprising dipping into a solution of a membrane material capable of binding heavy metals in an organic solvent or solvent emesis. Optionally, the base sensor will immerse in a suspension of the insoluble material capable of binding heavy metals and SH-enzymes or a mixture of SH-enzymes or the above integrated system containing these enzymes comprising in solution a membrane material in an organic solvent. Evaporation of the organic solvent at as low a temperature as possible or by immersing the base sensor in an aqueous solution creates a membrane that contains SH enzymes or the above integrated biological systems containing the enzyme. these enzymes are protected from heavy metal inactivation and capable of binding. Other technologies are useful in attracting the membranes and membrane materials of the invention to protect the SH-enzymes of the bioeensors from heavy metal inactivation. For a modification of the method described, for example, a biocatalytically active membrane can also be obtained on the surface of the base sensor; that the sensor with a free sensitive surface is first immersed in and to the material described above having the ability to bind heavy metals and SH enzyme in a volatile organic solvent; wherein the solvent is then evaporated. Biosensors and amperomatic potentiometric or conductemetric (bioapecific electrodes), optionally field-controlled enzyme transistors with SH enzymes as biocatalysts, obtained by the process described above, are characterized by remarkably high working and storage stability. The working stability can be extended from 3 << 4 days to at least 2 «& 3 weeks; The applicability of such stabilized bioeensors is, of course, dependent on the heavy metal content of the handle, since the capacity of the heavy metal membranes is not limited. Under normal conditions of quantitative analysis of substrates with the help of bioeensors, the DC will in all circumstances go to— 5 -

26? 066 sáhuje u stabilizovaných biosenzorů podle vynálezu doba použiti dva týdny· To znananá podstatný pokrok proti předchozímu stavu techniky a dovoluje delši, Širší a tia efektivnější použiti biosenzorů; vyrobených a SH enzymy v biologicky aktivní vrstvě· Předmět vynálezu je dále objasněn na příkladech, ale jeho rozsah ee tím neomezuje· přiklad 1 mg acetátu celulózy modifikovaného SH-skupinami (obsah SH skupin 22 ^imo3^.materiálu) se rozpustí za mícháni při teplotě místnosti v 2,5 ml čerstvě destilovaného dimethylformamidu. Současně se naváže adsorpčně ureáea na senzitivní povrch kombinované pH elektrody, ktorý byl uvoden do aktivní formy obvyklým způsobem· Takto upravená pH elektroda ee ponoří na aei 5 sekund do roztoku výše uvedeného polymeru. Pro získáni biosenzoru se zpracovává dále dvěma způsoby. Při prvním ae ponoří elektroda do acetonu a rozpouštědlo se odpaří při teplotě místnosti. Při druhém se pH elektroda hned po namočeni do roztoku polymeru ponoří do vodného roztoku. V obou případech se vytvoří membrána, která obsahuje ureázu a je na pH senzitivním povrchu pH elektrody pevně vázána. Taková potenciometrická elektroda se může používat pro stanoveni močoviny ve fyziologických roztocích nejméně 3 týdny. Má ještě po 10 dnech více než 50 % počáteční aktivity; zatímco stejná·; ale z obvyklého nemodifikovaného acetátu celulózy vyrobená, enzymová elektroda již ρο3^4 dnech nemá žádnou aktivitu. Zmobilizovaná ureáza je tudíž zcela inaktlvova ná.26? 066 in the stabilized biosensors according to the invention has a use time of two weeks. This is a significant progress over the prior art and allows longer, wider and more efficient use of the biosensors; produced and SH enzymes in the biologically active layer. The subject matter of the invention is further elucidated by way of example, but its scope is not limited thereto. Example 1 mg of SH-modified cellulose acetate (SH content of 22. in 2.5 ml of freshly distilled dimethylformamide. At the same time, the urea is adsorbed to the sensitive surface of the combined pH electrode, which has been brought into the active form in the usual manner. To obtain the biosensor, it is further processed in two ways. In the first ae, the electrode is immersed in acetone and the solvent is evaporated at room temperature. In the second, the pH electrode is immersed in the aqueous solution immediately after soaking in the polymer solution. In both cases, a membrane is formed which contains urease and is firmly bound to the pH sensitive surface of the pH electrode. Such a potentiometric electrode may be used for the determination of urea in physiological solutions for at least 3 weeks. It still has more than 50% of initial activity after 10 days; while the same ·; but produced from the usual unmodified cellulose acetate, the enzyme electrode has no activity for ^ 3 days. Thus, the mobilized urease is completely inactivated.

Přiklad 2Example 2

Ureása, polyvinylchlorid, práškovaný imidazolový polymer připravený podle DDR W,P. 124405 (obsah imidazolu 1,46 mmol/ g nosiče) ve stejných váhových poměrech (1:1:1) se rozpustí, respektive suspenduje^ v Čerstvě destilovaném tetrahydrofuranuUrease, polyvinyl chloride, powdered imidazole polymer prepared according to DDR W, P. 124405 (imidazole content 1.46 mmol / g carrier) in the same weight ratios (1: 1: 1) is dissolved or suspended, respectively, in freshly distilled tetrahydrofuran

- 6 263 066 zbaveném peroxidů. Do «lehané suspenze ee ponoří připravené kombinované pH elektroda a organické rozpouštědlo ae pak nechá při teplotě místnosti odpařit. Vytvořená biologicky aktivní membrána má vysokou stabilitu ureázy, která ja při k>ždoden-_znimtříhodinovém použiti po týdnu ještě nezměněná· Po dvoutýdenním použiti za stejných podmínek má tato enzymová elektroda jeětě 60 % původní aktivity· Stejná elektroda, ale bez pólyměrní komponenty, která váže těžké kovy, je již po 3 dnech áplně inaktlvni.- 6 263 066 peroxide-free. The combined pH electrode and organic solvent are immersed in the suspended suspension and then allowed to evaporate at room temperature. Generate a biologically active membrane having high stability of urease which j and k> ždoden- nimtříhodinovém _of use after one week still unchanged · After two weeks using the same conditions, this enzyme electrodes Jeet 60% of its activity · The same electrode, but without a polymeric component that binds heavy metals is completely inactive after 3 days.

Claims

≥Event the invention

1 »Stable bioeensors based on electrochemical base sensors and biocatalytically active layer, characterized by the fact that the biocatalytically active layer consists of biologically active substances in combination and a membrane material insoluble in aqueous solutions and also binds heavy metals»

2. Stable bioeensors according to claim 1, characterized in that one or more SH enzymes in isolated form or above integrated, biologically active systems containing such SH enzymes are used as biologically active substances.

3. Stable biosynthesisers according to claim 1, characterized in that water-insoluble organic or inorganic carriers with covalently bonded complex-forming or aromatic heterocyclic compounds having endocyclic tertiary nitrogen atoms or functional groups constituting 8 heavy metals are used as the membrane material having the ability to bind heavy metals. low dissociated metals.

4. A process for the production of stable biosensors, characterized in that the electrochemical base sensor is contacted with a layer of a biologically active substance with a membrane, water-insoluble material capable of binding heavy metals.

5. The method of item 4, characterized by; that an electrochemical base sensor with a SH enzyme or a mixture of SH enzymes or with an above-integrated system comprising these SH enzymes captured on active surfaces is immersed! into a solution of the membrane material capable of binding heavy metals in an organic solvent or solvent mixture, and the solvent is then evaporated.

- 8 -

263 066

6, Method VII according to Claim 4, characterized by t1; by immersing the electrochemical base sensor in a suspension consisting of a membrane soluble in organic solvent and insoluble material capable of binding heavy metals and SH enzyme or a mixture of SH enzymes or an integrated system containing such enzymes and then evaporating the organic solvent,

7. The method of claim 5, wherein the biocatalytically active layer is formed by immersing an electrochemical base sensor first equipped with an SH enzyme or a mixture of SH enzymes or an integrated system comprising SH enzymes and a membrane material capable of binding heavy metals into an aqueous solution.