CS263606B1 - Enzyme electrochemical sensor for determination of alcohols and method of its preparation - Google Patents
Enzyme electrochemical sensor for determination of alcohols and method of its preparation Download PDFInfo
- Publication number
- CS263606B1 CS263606B1 CS861637A CS163786A CS263606B1 CS 263606 B1 CS263606 B1 CS 263606B1 CS 861637 A CS861637 A CS 861637A CS 163786 A CS163786 A CS 163786A CS 263606 B1 CS263606 B1 CS 263606B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- groups
- enzyme
- immobilized
- isonitrile
- membrane
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Řešení se týká enzymového elektrochemického senzoru na stanovení alkoholů, především ethylalkoholu, obsahujícího detektor kyslíku, na jehož povrchu je fixována vrstva s imobilizovaným enzymem alkoholoxidázou a způsobu jeho přípravy. Stanovení alkoholu se provádí na principu enzymové exidace katalyzované imobilizovanou alkoxidázou v kombinaci s elektrochemickou detekcí ekvivalentní spotřeby kyslíku. Obsahuje-li fixovaná vrstva aldehydové skupiny, imobilizuje se alkoholoxidáza reakcí svých karboxylových skupin nebo aminoskupin a přidanými složkami obsahujícími izonitrilové a karboxylové skupiny a/nebo aminoskupiny, v případě, že obsahuje aminoskupiny, imobilizuje se enzym alkohol- -oxidáza reakcí svých karboxylových skupin aminoskupinami a přidanými složkami obsahujícími izonitrilové a aldehydové skupiny. Obdobný způsob přípravy je i tehdy, když fixovaná vrstva obsahuje bud karboxylové skupiny nebo izonitrilové skupiny. Enzymový elektrochemický senzor umožňuje rychle a spolehlivě měřit koncentraci alkoholu v technologických vzorcích bez předchozí úpravy analyzované směsi, ve fyziologických roztocích, i v dechu intoxikovaných probantú.The solution relates to an enzyme electrochemical sensor for the determination of alcohols, especially ethyl alcohol, containing an oxygen detector, on the surface of which a layer with an immobilized enzyme alcohol oxidase is fixed and a method of its preparation. The determination of alcohol is carried out on the principle of enzyme oxidation catalyzed by an immobilized alkoxidase in combination with electrochemical detection of equivalent oxygen consumption. If the fixed layer contains aldehyde groups, the alcohol oxidase is immobilized by the reaction of its carboxyl groups or amino groups and added components containing isonitrile and carboxyl groups and/or amino groups, in the case that it contains amino groups, the alcohol oxidase enzyme is immobilized by the reaction of its carboxyl groups with amino groups and added components containing isonitrile and aldehyde groups. A similar method of preparation is also used when the fixed layer contains either carboxyl groups or isonitrile groups. The enzyme electrochemical sensor allows for quick and reliable measurement of alcohol concentration in technological samples without prior treatment of the analyzed mixture, in physiological solutions, and in the breath of intoxicated subjects.
Description
Vynález se týká enzymového elektrotechnického senzoru na stanovení alkoholů na principu jejich enzymové reakce - oxidace katalyzované imobilizovanou alkoholoxidázou v kombinaci s elektrotechnickou detekcí ekvivalentní spotřeby kyslíku a způsobu provedení tohoto enzymového senzoru.The invention relates to an enzyme electrotechnical sensor for the determination of alcohols based on the principle of their enzymatic reaction - oxidation catalyzed by immobilized alcohol oxidase in combination with electrotechnical detection of equivalent oxygen consumption and a method of implementing this enzyme sensor.
Stanovení primárních alkoholů, především metanolu a etanolu, ale i například n-propanolu, n-butanolu a allylalkoholu je velmi důležité v řadě technologií chemického průmyslu a zvláště v moderních biotechnologiích. V mnoha případech je významné stanovení těchto alkoholů i v surovinách nebo produktech potravinářského průmyslu. Stanovení etanolu je zvlášt potřebné a velmi časté i v soudních a klinických toxikologickýoh laboratořích především z důvodu legislativní kontroly při zajištování bezpečnosti dopravy.The determination of primary alcohols, especially methanol and ethanol, but also n-propanol, n-butanol and allyl alcohol, is very important in many technologies of the chemical industry and especially in modern biotechnology. In many cases, the determination of these alcohols is also important in raw materials or products of the food industry. The determination of ethanol is particularly necessary and very common in forensic and clinical toxicology laboratories, mainly due to legislative control in ensuring transport safety.
Z uvedených důvodů byla pro stanovení titulních alkoholů vypracována řada postupů chemických, většinou s fotometrickou detekcí, i fyzikálně chemických, z nichž největšího uplatnění doznala plynová chromatografie.For the above reasons, a number of chemical procedures, mostly with photometric detection, and physicochemical procedures have been developed for the determination of the title alcohols, of which gas chromatography has been the most widely used.
V souvislosti s rozvojem enzymových analytických postupů vyznačujících se vysokou citlivostí, jednoduchostí a speoifitou danou vlastní podstatou enzymové katalýzy, byla věnována pozornost též enzymovému stanovení především etanolu. Při tomto stanovení se využívá katalytického účinku alkoholdehydrogenázy (E.C.1.1.1.1), přičemž je nejběžněji množství oxidovaného etylalkoholu sledováno fotometrioky na základě ekvivalentní tvorby redukované formy koenzymu nikotinamidadenindinukleotidu (NADH).In connection with the development of enzyme analytical procedures characterized by high sensitivity, simplicity and specificity given by the very nature of enzyme catalysis, attention was also paid to the enzymatic determination of ethanol, especially. This determination utilizes the catalytic effect of alcohol dehydrogenase (E.C.1.1.1.1), while the amount of oxidized ethyl alcohol is most commonly monitored photometrically based on the equivalent formation of the reduced form of the coenzyme nicotinamide adenine dinucleotide (NADH).
K enzymovému stanovení etanolu je možno použít též alkoholoxidázu, která katalyzuje oxidaci alkoholu přímo kyslíkem, aniž by byla nutná přítomnosti koenzymu NAD+. Substrátová specifita alkoholoxidázy je však širší, zahrnuje i některé další primární alifatické alkoholy, i když jejich relativní rychlost oxidace je ve srovnání s etanolem výrazně nižší. Této skutečnosti může být na jedné straně využito pro stanoveni těchto jednotlivých alkoholů, na druhé straně však může být v některých případech zkreslen výsledek analýzy přítomností kontaminujících alkoholů. Z tohoto hlediska je největší nebezpečí ovlivnění výsledků analýzy přítomností etanolu jako kontaminující složky při stanovení jiných alkoholů. Naopak při stanovení etanolu zvláště ve fyziologických tekutinách, nebo jiných vzorcích fyziologického původu, toto nebezpečí prakticky nepřichází v úvahu.For the enzymatic determination of ethanol, it is also possible to use alcohol oxidase, which catalyzes the oxidation of alcohol directly by oxygen without the need for the presence of the coenzyme NAD + . However, the substrate specificity of alcohol oxidase is broader, including some other primary aliphatic alcohols, although their relative oxidation rate is significantly lower compared to ethanol. On the one hand, this fact can be used for the determination of these individual alcohols, but on the other hand, in some cases, the result of the analysis can be distorted by the presence of contaminating alcohols. From this point of view, the greatest danger of influencing the results of the analysis is the presence of ethanol as a contaminating component in the determination of other alcohols. On the other hand, when determining ethanol, especially in physiological fluids or other samples of physiological origin, this danger is practically out of the question.
Průběh enzymové reakce je možno sledovat přímo na základě tvorby nebo spotřeby určité substance, nebo pomoci následných chemických nebo enzymových reakcí vzniklých reakčních produktů. Vedle velmi často používané fotometrie má velký význam spojeni enzymové reakce s elektrochemickými čidly detekujícími substráty, produkty nebo jiné látky ovlivňující průběh enzymové reakce.The course of an enzyme reaction can be monitored directly based on the formation or consumption of a certain substance, or with the help of subsequent chemical or enzymatic reactions of the resulting reaction products. In addition to the very often used photometry, it is of great importance to connect the enzyme reaction with electrochemical sensors detecting substrates, products or other substances influencing the course of the enzyme reaction.
Použití volných enzymů je spojeno v některých případech s technickými nebo ekonomickými problémy jejich získáváni. Z tohoto důvodu je velmi atraktivní jejich fixace v blízkosti elektrochemického čidla, čímž je vytvořen senzor - enzymová elektroda, opakovaně použitelný při stovkách analýz bez jakékoliv spotřeby chemikálii, v některých případech pouze pufru.The use of free enzymes is sometimes associated with technical or economic problems in their acquisition. For this reason, their fixation near an electrochemical sensor is very attractive, thus creating a sensor - enzyme electrode, reusable for hundreds of analyses without any consumption of chemicals, in some cases only buffer.
Pro stanoveni alkoholů byla vypracována příprava enzymové elektrody spočívající v imobilizaci enzymu alkoholoxidázy ve spojení bud s elektrochemickou detekcí vznikajícího peroxidu vodíku, nebo s elektrochemickým stanovením spotřeby kyslíku kyslíkovým článkem Clarkova typu.For the determination of alcohols, an enzyme electrode preparation was developed consisting of the immobilization of the alcohol oxidase enzyme in conjunction with either electrochemical detection of the resulting hydrogen peroxide or electrochemical determination of oxygen consumption using a Clark-type oxygen cell.
S ohledem na stabilitu vytvořeni enzymové elektrody je výhodná imobilizace enzymu kovalentní vazbou. Pro přípravu enzymových elektrod je nejčastěji používanou technikou imobilizace prokříženi molekul, případně v kombinaci s jinými enzymy či přidanou bílkovinou pomocí·; glutaraldehydu.With regard to the stability of the enzyme electrode formation, immobilization of the enzyme by covalent bonding is preferred. For the preparation of enzyme electrodes, the most commonly used immobilization technique is cross-linking of molecules, possibly in combination with other enzymes or added protein, using glutaraldehyde.
Tento: problém je řešen enzymovým elektrochemickým senzorem na stanovení alkoholů a způ3 sobem jeho přípravy podle vynálezu. Senzor obsahuje detektor kyslíku, na němž je fixována vrstva nebo membrána s imobilizovaným enzymem alkoholoxidázou. Podstatou vynálezu je, že vrstva nebo membrána je tvořena polymerem obsahujícím reaktivní zbytek organické sloučeniny vybraný ze skupiny obsahující aldehydové skupiny, aminoskupiny, karboxylové skupiny nebo izonitrilové skupiny, přes které je na polymer enzym vázán kovalentní vazbou. Způsob přípravy spočívá v tom, že na polymerni vrstvu obsahující aldehydové skupiny se enzym alkoholoxidáza imobllizuje reakcí svých karboxylových skupin nebo aminoskupin a přidanými složkami obsahujícími izonitrilové a karboxylové skupiny a/nebo aminoskupiny, případně v tom, že na polymerni vrstvu obsahující aminoskupiny se enzym alkoholoxidáza imobilizuje reakcí svých karboxylových skupin s aminoskupinaml obsaženými v polymerni vrstvě a přidanými složkami obsahujícími izonitrilové a aldehydové skupiny. Dále na polymerni vrstvu se enzym alkoholoxidáza imobilizuje reakcí svých aminoskupin s karboxylovýmí skupinami obsaženými v této vrstvě a přidanými složkami obsahujícími izonitrilové a aldehydové skupiny, nebo na polymerni vrstvu obsahující izonitrilové skupiny se enzym alkoholoxidáza imobilizuje reakcí svých karboxylových skupin nebo aminoskupin a přidanými složkami obsahujícími aldehydové skupiny a/nebo aminoskupiny.This problem is solved by an enzyme electrochemical sensor for the determination of alcohols and a method of its preparation according to the invention. The sensor comprises an oxygen detector on which a layer or membrane with an immobilized enzyme alcohol oxidase is fixed. The essence of the invention is that the layer or membrane is formed of a polymer containing a reactive residue of an organic compound selected from the group containing aldehyde groups, amino groups, carboxyl groups or isonitrile groups, through which the enzyme is bound to the polymer by a covalent bond. The preparation method consists in that the enzyme alcohol oxidase is immobilized on a polymer layer containing aldehyde groups by the reaction of its carboxyl groups or amino groups and added components containing isonitrile and carboxyl groups and/or amino groups, or in that the enzyme alcohol oxidase is immobilized on a polymer layer containing amino groups by the reaction of its carboxyl groups with amino groups contained in the polymer layer and added components containing isonitrile and aldehyde groups. Furthermore, the alcohol oxidase enzyme is immobilized on a polymer layer by reacting its amino groups with carboxyl groups contained in this layer and added components containing isonitrile and aldehyde groups, or on a polymer layer containing isonitrile groups, the alcohol oxidase enzyme is immobilized by reacting its carboxyl groups or amino groups and added components containing aldehyde groups and/or amino groups.
Výhodou enzymového elektrochemického senzoru a způsobu jeho přípravy podle vynálezu je zvýšení jeho stability. Pro některé aplikace senzoru s ohledem na další zvýšení jeho stability je výhodné překrýt vrstvu s imobilizovaným enzymem další membránou propustnou pouze pro nízkomolekulární látky.The advantage of the enzyme electrochemical sensor and the method of its preparation according to the invention is its increased stability. For some applications of the sensor, with a view to further increasing its stability, it is advantageous to cover the layer with the immobilized enzyme with another membrane permeable only to low molecular weight substances.
Enzymový elektrochemický senzor na stanoveni alkoholu podle vynálezu umožňuje rychle a spolehlivě měřit koncentraci alkoholů v technologických vzorcích bez předchozí úpravy analyzované směsi, zvláště výhodný je pro stanovení ethylalkoholu ve fyziologických tekutinách, především plasmě a v dechu intoxikovaných probantů, v rozsahu desetin až stovek promile.The enzyme electrochemical sensor for alcohol determination according to the invention allows for quick and reliable measurement of alcohol concentration in technological samples without prior treatment of the analyzed mixture. It is particularly advantageous for the determination of ethyl alcohol in physiological fluids, especially plasma and in the breath of intoxicated probands, in the range of tenths to hundreds of per mille.
Předmět vynálezu je dokumentován dále uvedenými příklady použití, aniž by se jimi omezoval.The subject matter of the invention is documented by the following examples of use, without being limited thereto.
Příklad 1 oExample 1 about
Na terčík z karboxymethylcelulózy byly aplikovány 2 jul ethylaminu 0,5 mol/dm , 1 ul 3 ' cyklohexylisokyanidu a 150 jul alkoholoxidázy v 0,1 mol/dm fosfátového pufru pH 7,5. Po z 3 šesti hodinách byl terčík s navázanou alkoholoxidázou důkladně promyt 0,1 mol/dm fosfátovým pufrem pH 7,5 a poté byl fixován na detektor kyslíku. Pomocí takto připraveného enzymového elektrochemického senzoru byl stanoven n-butanol s lineární odezvou v koncentračním rozsahu 10 ® až 10 3 mol v dm3.2 µl of ethylamine 0.5 mol/dm, 1 µl of 3' cyclohexylisocyanide and 150 µl of alcohol oxidase in 0.1 mol/dm phosphate buffer pH 7.5 were applied to a carboxymethylcellulose target. After 3 to 6 hours, the target with bound alcohol oxidase was thoroughly washed with 0.1 mol/dm phosphate buffer pH 7.5 and then fixed to an oxygen detector. Using the enzyme electrochemical sensor thus prepared, n-butanol was determined with a linear response in the concentration range of 10 ® to 10 3 mol in dm 3 .
Příklad 2Example 2
Na terčík z modifikovaného bopolymeru styrenu s glycidylmethakrylátem obsahující izo3 nitrilové skupiny byly aplikovány 2 yul glutaraldehydu - 0,5 mol/dm a 150^ul alkoholoxidázy v 0,1 mol/dm3 fosfátovém pufru pH 7,5. Po šesti hodinách byl terčík s navázanou alkoholoxio dázou důkladně promyt 0,1 mol/dm fosfátovým pufrem pH 7,5 a poté byl fixován na detektor kyslíku. Pomocí takto připraveného enzymového elektrochemického senzoru byl stanoven n-buta“6 -3 3 nol s lineární odezvou v koncentračním rozsahu 10 až 10 mol v dm-.On a target made of modified styrene copolymer with glycidyl methacrylate containing iso3 nitrile groups, 2 μl of glutaraldehyde - 0.5 mol/dm and 150 μl of alcohol oxidase in 0.1 mol/dm 3 phosphate buffer pH 7.5 were applied. After six hours, the target with bound alcohol oxidase was thoroughly washed with 0.1 mol/dm 3 phosphate buffer pH 7.5 and then fixed on an oxygen detector. Using the enzyme electrochemical sensor thus prepared, n-buta“6 -3 3 nol was determined with a linear response in the concentration range of 10 to 10 mol in dm-.
Příklad 3Example 3
Na terčík z modifikovaného bopolymeru styrenu s glycidalmethakrylátem obsahující alde3 hydové skupiny byly aplikovány 2 /il kyseliny octové - 0,5 mol/dm , 1/il cyklohexylisokyanidu a 150yul alkoholoxidázy v 0,1 mol/dm3 fosfátového pufru pH 7,5. Po šesti hodinách byl terčík s navázanou alkoholoxidázou fixován na detektor kyslíku a dále překryt membránou z acetátu celulózy propouštějící pouze nízkomolekulární látky. Pomocí takto, připraveného enzymového elektrochemického senzoru byl stanoven ethylalkohol na základě úbytku kyslíku v reakční -7 -4 3 směsi s lineární odezvou v rozsahu 5.10 až 5.10 mol ethylalkoholu v dm .On a target made of modified styrene copolymer with glycidyl methacrylate containing aldehyde groups, 2 µl of acetic acid - 0.5 mol/dm , 1 µl of cyclohexyl isocyanide and 150 µl of alcohol oxidase in 0.1 mol/dm 3 of phosphate buffer pH 7.5 were applied. After six hours, the target with bound alcohol oxidase was fixed on an oxygen detector and further covered with a cellulose acetate membrane permeable only to low molecular weight substances. Using the enzyme electrochemical sensor thus prepared, ethyl alcohol was determined based on the loss of oxygen in the reaction mixture with a linear response in the range of 5.10 to 5.10 mol of ethyl alcohol in dm .
Příklad 4Example 4
Na terčík z porézního skla modifikovaného gama-aminopropyltriethoxysilanem byly apliko3 vány 2/il kyseliny octové - 0,5 mol/dm , 1/il cyklohexylinkyanidu a 150 /il alkoholoxidázy ' 3 v 0,1 mol/dm fosfátového pufru pH 7,5. Terčík byl fixován na detektor kyslíku a dále překryt membránou z acetátu celulózy propouštějící pouze nízkomolekulární látky. Pomocí takto připraveného enzymového elektrochemického senzoru byl stanoven methylalkohol ve vodných roztocích2 µl of acetic acid - 0.5 mol/dm, 1 µl of cyclohexyl cyanide and 150 µl of alcohol oxidase ' 3 in 0.1 mol/dm phosphate buffer pH 7.5 were applied to a porous glass target modified with gamma-aminopropyltriethoxysilane. The target was fixed to an oxygen detector and further covered with a cellulose acetate membrane permeable only to low molecular weight substances. The thus prepared enzyme electrochemical sensor was used to determine methyl alcohol in aqueous solutions
-7 -4 3 s lineární odezvou v rozsahu koncentrací 5.10 až 4.10 mol v dm .-7 -4 3 with a linear response in the concentration range of 5.10 to 4.10 mol in dm.
Claims (5)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS861637A CS263606B1 (en) | 1986-03-11 | 1986-03-11 | Enzyme electrochemical sensor for determination of alcohols and method of its preparation |
| CS88476A CS268357B1 (en) | 1986-03-11 | 1988-01-26 | A method for preparing an electrochemical sensor for determining alcohols |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS861637A CS263606B1 (en) | 1986-03-11 | 1986-03-11 | Enzyme electrochemical sensor for determination of alcohols and method of its preparation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS163786A1 CS163786A1 (en) | 1988-09-16 |
| CS263606B1 true CS263606B1 (en) | 1989-04-14 |
Family
ID=5351216
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS861637A CS263606B1 (en) | 1986-03-11 | 1986-03-11 | Enzyme electrochemical sensor for determination of alcohols and method of its preparation |
| CS88476A CS268357B1 (en) | 1986-03-11 | 1988-01-26 | A method for preparing an electrochemical sensor for determining alcohols |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS88476A CS268357B1 (en) | 1986-03-11 | 1988-01-26 | A method for preparing an electrochemical sensor for determining alcohols |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (2) | CS263606B1 (en) |
-
1986
- 1986-03-11 CS CS861637A patent/CS263606B1/en unknown
-
1988
- 1988-01-26 CS CS88476A patent/CS268357B1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CS163786A1 (en) | 1988-09-16 |
| CS268357B1 (en) | 1990-03-14 |
| CS47688A1 (en) | 1989-08-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6051389A (en) | Enzyme sensor | |
| Marazuela et al. | Free cholesterol fiber-optic biosensor for serum samples with simplex optimization | |
| KR101990301B1 (en) | Optical biosensor | |
| US4234681A (en) | Immobolized light emitting systems | |
| Barlikova et al. | Hybrid biosensor for the determination of sucrose | |
| Sundaram et al. | Routine glucose determination in serum by use of an immobilized glucose dehydrogenase nylon-tube reactor. | |
| US5147781A (en) | Enzyme electrode and assay for determining LDH5 | |
| CA1094477A (en) | Assays utilizing localized electromagnetic radiation sources | |
| GB2265718A (en) | Assay system employing enzymes and electrochemical detection | |
| Yao et al. | Amperometric flow-injection determination of glucose, urate and cholesterol and blood serum by using some immobilized enzyme reactors and a poly (1, 2-diaminobenzene)-coated platinum electrode | |
| Chirillo et al. | The use of immobilized enzyme reactors in continuous-flow analyzers for the determination of glucose, urea, and uric acid. | |
| Schelp et al. | Two fibre-optic sensors with confined enzymes and coenzymes: development and application | |
| Marquette et al. | Fiberoptic biosensors based on chemiluminescent reactions | |
| CS263606B1 (en) | Enzyme electrochemical sensor for determination of alcohols and method of its preparation | |
| US7585400B2 (en) | Chip for electrochemical immunoassay | |
| Kiba et al. | Chemiluminometric determination of uric acid in plasma by closed-loop FIA with a coimmobilized enzyme flow cell | |
| JPS63101743A (en) | Functional electrode | |
| JP3710166B2 (en) | Method for measuring D-sorbitol and kit for measuring the same | |
| Matuszewski et al. | Elimination of interferences in flow‐injection amperometric determination of glucose in blood serum using immobilized glucose oxidase | |
| Murachi et al. | [23] Use of immobilized enzyme column reactors in clinical analysis | |
| Botrè et al. | Determination of L-glutamate and L-glutamine in pharmaceutical formulations by amperometric L-glutamate oxidase based enzyme sensors | |
| Male et al. | A flow-injection (FI) mediated biosensor for on-line monitoring of lactate in mammalian cell culture | |
| Iida et al. | Spectrophotometric microdetermination of urea in a rice wine by using an immobilized acid urease column· FIA system | |
| Berezin et al. | Enzyme Electrodes | |
| JPH09257742A (en) | Alcohol sensor |