CS264022B1 - Process for fermentative preparing of secondary metabolites - Google Patents

Description

(57) Řešení ее týká získávání vedlejších metabolitů fermentací. Získávání vedlejšíoh metabolitů se dšje bezlimitním vedením fermentaoe· Způsob se provádí za nepřetržitá sledovaných a regulovaných společných parametrů procesu, jako hodnoty pH₉ rychlosti dávkování roztoku louhu, hodnoty ρθ2· reakčního tepla a složeni odcházejících plynů· Pro řízení dávkováním substrátů se používá jako měřitko fyziologicky aktivního množství fosfátu aktuální rychlost dávkování alkalického roztoku· Jako roztok se používá zejména hydroxid amonný·

CS 264022 Βί

- 1 264022

Название изобретения

Способ ферментативного получения вторичных метаболитов

Область применения изобретения

Изобретение относится к способу ферментативного получения вторичных метаболитов, предпочтительно антибиотиков, на характеристику образования которых можно воздействовать путем управления обменом веществ микроорганизмов-продуцентов способом прямого или/и косвенного прибавления различных, например, фосфатсодержащих веществ во время ферментации. Таким образом, изобретение имеет значение для микробиологической промышленности.

Характеристика известных технических решений

Было уже предложено, чтобы, наряду с установкой, в частности уменьшением, концентрации доступного фосфата в начальной питательной среде для ферментаций, с целью получения вторичных метаболитов периодически прибавлять фос* фатсодержащие вещества в начале ферментации и/или во время дальнейшего про-* текания ферментации č избежанием'дальнейших лимитаций, чтобы повлиять на регулируемые взаимодействия биологической системы с целью повышения скорости образования продукта. Что касается применения вышеназванного изобретения в так называемых ферментациях с управлением в реальном масштабе времени, то трудность его осуществления заключается в том, что приходится пользоваться установившимися в ферментационной технике, непрерывно измеряемыми общими параметрами процес-» са, как значение pH, значение р0₄, скорость дозирования, состав отходящего i газа (образования СО^), образование тепла и т.д‘., в качестве первичных ре^: гулируемых параметров процесса вместо концентраций субстрата, которые еле-* дует дополнительно определить только при помощи трудоемкого химического анализа. Эта необходимость вытекает из существующего уровня автоматизированной измерительной техники в области биотехнологии (Sukatsch, D»A., Ňesemann, G.: Automatische Parametererfassuiig bei industriellen Fermentationen. Chemie-Technik 6 (1977), 2617.

- 2 Цель изобретения

Целью изобретения является проведение без лимитаций ферментационных процессов получения вторичных метаболитов.

Изложение сущности изобретения

В основу изобретения положена задача описывать способ получения вторичных метаболитов, который включает в себя технологически удобное решение управления в реальном масштабе времени промышленными / процессами ферментации с прямым или/и косвенным дозированием субстрата, в частности фосфата, источников углерода, источников азота, микроэлементов и веществ с эффекторным действием. При этом управление дозированиями субстратов должно основываться на непрерывно учитываемых и регулируемых общих параметрах процесса, как значение ρθ_α, значение pH, образование тепла и С0₂, в частности на скоростях дозирования для регулирования pH и соответственно скоростях образования тепла и С0^, и обеспечивать осуществление эффективной скорости образования продукта в течение длительного периода времени ферментации.

Неожиданно было найдено, что временная характеристика скорости дозирования щелочного раствора при регулировании заданного значения pH отражает временную характеристику концентрации фосфата, физиологически активного для превращения источников углерода, источников азота, микроэлементов и веществ с эффекторным действием, пока не будет лимитаций в отношении этих субстратов и содержания растворенного кислорода. Имеется в виду, что скорость дозирования щелочного раствора, который должен прибавляться для сохранения выбранного нижнего порога регулирования pH, пропорциональна физиологически активной концентрации фосфата. Масштаб отображения, следовательно, зависит от установленного нижнего предела регулирования значения рН^ начало дозирования щелочного раствора определяется буфером начальной питательной среды.

В дальнейшем осуществлении изобретения в качестве дозируемого щелочного раствора для управления дозированием вышеназванных субстратов используют гидроокись аммония.

Способ осуществляют следующим образом:

На устройстве для регулирования значений pH устанавливают нижний регулируемый порог рН-значений, например, pH 6,2. Таким образом в процессе ферментации эквивалентная скорость дозирования гидроокиси аммония находится в зависимости от времени. Описанная функциональная взаимосвязь между этой скоростью дозирования и концентрацией физиологически активного фосфата и является мерой активности метаболизма ферментации. Потребляемые источники углерода, источники азота, микроэлементы и вещества с эффекторным действием, находящиеся в соответствии с этой активностью метаболизма, компенсируются дозированием субстратов.

Способ можно осуществить и таким образом, что наиболее эффективную для продуктообразования временную характеристику концентрации фосфата обеспечивают прямым дозированием фосфата за счет установки наиболее благоприятной для хода процесса скорости дозирования гидроокиси аммония. Что касается прямого дозирования фосфата путем добавления фосфатсодержащих веществ из внешней емкости, а также косвенного дозирования фосфата путем предоставления фосфатных соединений ферментативными или гидролитическим расщеплением комплексных компонентов питательной среды, как крахмал, соевой шрот, кукурузный экстракт и др., то было найдено, что величина скорости дозирования гидроокиси аммония своим достоверным нарастанием или падением указывает на переходы между

- 3 264022 прямым и косвенным методами дозирования фосфата. Величина изменения определяется притоком фосфата.

Прямое дозирование фосфата определяется также достижением содержания растворенного кислорода* минимально необходимого по причинам физиологического регулирования .

Кроме того способ пользуется фактом* что временная характеристика тепла реакции, возникающего в ферментаторе вследствие активности микроорганизмов, а также образования С0^, соответствует временным характеристикам скорости дозирования гидроокиси аммония и концентрации физиологически активного фосфата. По этой причине актуальное тепло реакции и актуальное образование С0₂, а в то же время и относящиеся к этим величинам скорости образования тоже являются величинами управления дозированием фосфата и других субстратов.

1-й пример осуществления .

Изобретение поясняется при помощи примеров осуществления на основании диаграмм. ’

Лиофилизированный на глюкозо-желатине консервированный мицелий (общий вес консервного содержимого около 300 мг) селектанта BF 32 ноурзеотрицинообразующего штамма IMET JA 3890b суспендируют 3 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия* 0*5 мл этой суспензии служит в качестве инокулюма для 400 мл среды первого пассажа.

Среда первого пассажа содержит следующие вещества из расчета на один литр водопроводной воды; глюкозы - 40 г, обезмасленной соевой муки - 15 г, КН2РО4 - 0*3 г* NaCl - 5 г* СаСО₃ - 3 г. Кислотность устанавливает перед стерилизацией на pH 6,5. По 400 мп этой среды заливают в широкогордые колбы емкостью 2500 мл* закрываемые ватной пробкой. Стерилизацию производят в течение 35 минут при нагревании до 121°С в автоклаве.

Охлажденные до комнатной температуры и засеянные культуры инкубируют в течение 48 часов на качалке (180 мин“¹) при 29°С. При помощи 800 мл получаемой !таким образом культуральной жидкости первого пассажа засевают на втором пассаже наполненный 180 л термостерилизованной среды (60 минут при 121°С) того Í же состава* что и первого пассажа, и оснащенный устройствами для аэрации !

: стерильным воздухом и перемешивающим устройством ферментатор из высококаче—, ственной стали (общий объём 250 л). Культивирование продолжается в течение 42 часов (pH 5,2) при 27°С - 29°С, при числе оборотов перемешивающего устройства 240 мин^и скорости аэрации 1 литр воздуха. на литр культуральной жидкости в минуту* Ранее приведенные данные касаются необходимых подготовительных работ. . .

Для основной культуры предназначается оснащенный устройствами для аэрации стерильным воздухом и центрально расположенным перемешивающим устройством ферментатор из высококачественной стали (общий объем 4200 л), наполненный , 2500 л питательной среды следующего состава из расчета на 1 литр водопровод ной воды: картофельного крахмала - 32 г, глюкозы - 60 г, обезмасленной соевой муки - 11 г, (NH₄)₂S0₄ - 11 г* MgSO₄*7Н₂0 -*2 г, NaCl - 1 г, СаСО₃ - 6г, ZnSO₄ - 0,5 г. На литр культуральйой я^идкости прибавляют по 0,5 г пеногасите-; ля на силиконовой основе. Кислотность устанавливают перед стерилизацией на J pH 6,2. Стерилизацию питательной среды (без гликозного компонента) произво- ® дят in šitu путем подогрева паром рубашки до 75° С и затем нагревом при помощи острого пара до Т20°С в течение 15 минут» После охлаждения до 29 С прибавляют в асептических условиях глюкозу, раздельно стерилизованную в форме

502-ного водного раствора 30-минутным нагревом до 120°С. Перед засевом начальную кислотность устанавливают серной кислотой таким образом, чтобы начальное значение pH после засева составляло 7,4. Ферментационную среду основной культуры, засеянную 4% инокулюма второго пассажа, культивируют в течение 120 часов при 29° С, скорости аэрации 1250 литров в минуту (0-й + 12-й часы) или 2500 литров в минуту (12-й + 120-й часы), избыточном давлении 0,03 МПа при перемешивании с числом оборотов 180 мин”¹.

Полученные временные характеристики показывают:

Диаграмма 1 - Временные характеристики продуцированного антибиотика.ноурзеотрицин и сухого веса биомассы

Диаграмма 2 - Временные характеристики рН-значения, концентрации глюкозы и аммонийного азота ·

Диаграмма 3 - Временную характеристику скорости дозирования гидроокиси ам. мония, концентрации фосфата и содержания растворенного кислорода

Диаграмма 4 - Временные характеристики состава отходящих газов из кислорода и двуокиси углерода, а также тепла реакции

Диаграмма 5 - Временные характеристики специфической скорости образования продукта и специфической скорости роста

Что касается управляющего вмешательства в процесс, то ферментацию ведут путем прямого дозирования фосфата и дозирования глюкозы в зависимости от условий скорости дозирования гидроокиси аммония.

Заданный предел pH составляет 6,2+0,05, а нижний предел pH 6,15 достигается через 38 часов ферментации.

Для прямого дозирования фосфата используют стерильный водный раствор дигидрофосфата калия. Этот раствор добавляют от 2-го до 32-го часа таким образом, что для возбуждения активности обмена веществ на один литр культуральной жидкости используют в целом 42 мг фосфора в форме фосфата.

С учетом выбранного интервала заданного рН-значения, буферного состояния питательной среды и концентрации щелочного раствора дозирование гидроокиси аммония (252-ный) начинают с 38-го часа. Наблюдаемое уменьшение нарастания скорости дозирования гидроокиси аммония вызывает дальнейшее прямое дозирование фосфата в количестве по 8,5 мг фосфатного фосфора на литр культуральной жидкости в пределах между 47-м и 48-м часами и соответственно 53-м и 54-м часами.

За счет этого скорость дозирования достигает своего максимального значения к 62-му часу и затем снижается в соответствии с переходом от прямого к косвенному дозированию фосфата. Таким образом процесс ферментации примерно в течение 20 часов протекает почти с благоприятной специфической скоростью дозирования порядка 230 мл 252-ного раствора гидроокиси аммония на кубический метр культуральной жидкости в час.

Прибавляемого раствора гидроокиси аммония достаточно для того, чтобы концентрацию азота держать в физиологически благоприятных пределах.

Поэтому дальнейших источников азота не прибавляют. Что касается источника углерода, то усиленное после второго дозирования фосфата уменьшение нараста

- 5 264022 ния скорости дозирования гидроокиси аммония служит поводом к прибавлению .48 г глюкозы на литр культуральной жидкости к 56-му часу.

Показание к переходу к косвенному дозированию фосфата путем легкого увеличения скорости дозирования гидроокиси аммония на 95-м часу служит критерием пуска второго дозирования глюкозы в количестве 18 г на литр культуральной жидкости4

Что касается прямого дозирования фосфата, то в отношении содержания растворенного кислорода лимитирований не имеется.

Тепло реакции и образование С0₂ имеют характеристику ферментационных фаз по аналогии со скоростью дозирования гидроокиси аммония и служат для предотвращения лимитаций субстратов.

Конечное значение ноурзеотрицина порядка 10,5 г на литр культуральной жидкости достигается тем, что эффективная специфическая скорость образования продукта в течение 45 часов составляет 7 ΊΟ”³ в час + 8Ί0'³β час. Кроме того имеет место полная ферментация глюкозы, а заданный технологией очистки лимит по биомассе не превышается.

2-й пример осуществления

Консервированные'споры (спорулированное просо) селектднта DG1 штамма Penicillium chrysogenum служат в качестве посевного материала для выращивания посевной культуры для двух процессов ферментации бензилпенициллина на основной культуре, переводя споровую суспензию с общим числом около 4· 10спор в посевную культуру, выращиваемую в течение 42,5 часа. Посевной ферментер (ферментер из высококачественной стали и стекла с перемешивающим устройством, имеющий общий объем 4,5 л), наполненный 2,5 л питательной среды, стерилизуют в автоклаве в течение 60 минут при 121°С.

Питательная среда содержит следующие компоненты из расчета на один литр среды: .

Глюкозы - 25 г, мелассы - 5 г, кукурузного экстракта (сухого вещества) 5 г, соевой муки - 20 г, СаСО^ - 2 г, (ΝΗ^ί-χδΟ^ - 5 г, NaN0₃ - 3 г, КН_йР0₄ 0,5 г, MgSO₄*7H_ž0 - 0,1 г, ΖηδΟ₄·7Η₂Ο - 0,02 г, Μηδ0₄·5Η₂0 - 0,007 г, подсолнечного масла - 5 г, полипропиленгликоля - 0,2 мл. Перед стерилизацией значение pH устанавливают при помощи водного раствора едкого натра на 6,5, а после стерилизации значение pH в среде, охлажденной до 25 С (температура процесса ферментации посевной и основной культур).., составляет 6,25.

В процессе выращийания посевной культуры непрерывно измеряемое и регулируемое значение р0> постоянно держат на уровне свыше 60% концентрации насыщенности путем регулирования числа оборотов перемешивающего устройства. · Значение pH тоже измеряют и регистрируют непрерывно. Поначалу pH снижается, проходя относительный минимум»рН. Затем pH проявляет местное повышение, после чего он достигает фазы своего минимального значения, которому следует быстрое нарастание. При значении pH 7,2 посевная культура достигает степени эре·* лости, а от нее используют по 500 мл для засева основных культур в ферментерах с общим объемом по 4,5 л· После подачи посевной культуры рабочий объем составляет по 3 литра. Приготовленные среды по 2,5 л содержат компоненты хлопкового масла - 120 г, глюкозы. - 45 г (NH^SO^, - 7,5 г, СаСО^ - 12 г, подсолнечного масла - 15 г, Na₂S₂0y5Н_г0 - 24 г, полипропиленгликоля - 0,6 г и стерилизуются в автоклаве в течение 60 мин при 121°С после их внесения в ферментер без предварительной установки значения pH. После стерилизации значение pH составляет 7,2_О . - о - . 264022

На регуляторе pH нижний порог регулирования устанавливают на 6,6. Для целей регулирования pH используют в качестве щелочного раствора гидроокись аммония (приемник 200 мл, стерильная фильтрация). В качестве дальнейших дозируемых субстратов запасаются для каждого ферментера 10%-ной фенилуксусной кислотой (pH установлено на 7,0 при помощи водного раствора едкого кали, объем 350 мл) и 70%-ным раствором глюкозы (1000 мл). Эти растворы стерилизуют одновременно с ферментерами, так как сосуды с запасными растворами уже подключены перед автоклавированием* Один ферментер имеет еще один дополнительный сосуд дозирования с 400 мл фосфатного раствора, содержащего всего

2,63 г КН*РО₄.

|Для пеногашения запасаются стерильным полипропиленгликолем в количествах по 20 мл. Из них в стартовой фазе выращивания основных культур в ферментеры добавляют по 5 мп для подавления склонности к пенообразованию. Наступает ί быстрое снижение значения pH, порог регулирования достигается через полчаса/ Здесь начинается дозирование ΝΗ_Ζ<ΟΗ; данная скорость дозирования раствора регистрируется каждый час. На диаграмме 6 представлены временные характеристики скорости дозирования ΝΗ₄ΟΗ и на основе этого скорости дозирования РО4-Р и глюкозы на один из ферментеров с основной культурой. Скорость дозирования щелочного раствора быстро снижается (в соответствии со снижением количества растворимого Р0₄-Р за счет растущей культуры).

Такой тенденции к снижению противодействуют способом внешнего дозирования фосфата, начиная со 2-го часа процесса. При этом дозирование РО₄-Р увеличивают только до такой меры, чтобы скорость подачи ΝΗ4ΟΗ продолжала монотонно снижаться. В таких условиях ее нулевая точка, наступающая с 6-го часа, показывает, что дозируемый РО₄-Р удовлетворяет потребности не полностью после . того, как стартовое количество Р0₄-Р (87 мг/л свободной стерилизации) израсходовано. Эту частичную лимитацию по РО4-Р используют для направленного формирования внеклеточной активности фосфатазы, т.е. косвенное дозирование ' Ρόψ-Ρ путем ферментативной эксплуатации комплексных субстратов устанавливается на реологическое равновесие.

В момент достижения нулевой точки дозирования ΝΗ₄ΟΗ начинает действовать дозирование фенилуксусной кислоты в дозе 0,65 мг/л.час. С 11-го часа возобновляётся дозирование щелочного раствора, а внешнее дозирование РО4-Р сокращается, так как ивдуцируется внутреннее дозирование РО₄-Р. Через 14,5 часа полностью заканчивается внешнее дозирование РО₄-Р. Через 15 часов нулевая точка скорости дозирования ΝΗ^ΟΗ показывает полное израсходование стартовой· глюкозы. Эта нулевая точка и является стартовой точкой дозирования глюкозы. Ее доза сначала устанавливается на величину 0,55 г/л.час, а с 15-го часа увеличивается до 1,25 г/л*час, чтобы стабилизировать скорость дозирования . ΝΗ^ΟΗ на уровне 0,1 мл/л-час. Эти установки вызывают безлимитационность в отношении снабжения углеродом и азотом на протяжении времени ферментации, которая проводится как основной цикл циклической ферментации бензилпенициллина. Ферментер сравнения работает по стандартному способу без использования показателя скорости дозирования ΝΗ₄0Η для управления дозированиями в истинном масштабе времени. .

Дозирование фенилуксусной кислоты проводится с 11-го часа в дозе 0,65 мп/л х хчас, дозирование глюкозы - с 23-го часа в дозе 1,25 г/л;час. Режим внешнего дозирования фосфата не используется. Во время ферментационных процессов значение рОд всегда держится на уровне свыше 50% путем изменения числа оборотов. Скорости дозирования регулируют по мере увеличения объема.

·- 7 264022

Временные характеристики выхода продукта во время основного цикла?

Бейзилпенициллин (МЕ/мл)

Время (час) .	Ферментер с управлением в истинном масштабе времени	Ферментер без управления в истинном масштабе времени
22	1750	900
35	4000	3450
47	6700	4800
59	8600	6100
71	13800	8200

В конце основного цикла наблюдается повышение выхода продукта на примерно 60%. Выход 8000-9000 МЕ/мп через 70 часов соответствует прежнему сосФоянию техники. ' . .

Формула изобретения . ·

1. Способ управления в истинном масштабе времени ферментативным получением вторичных метаболитов с дозированием субстрата и добавлением количества щелочного раствора, необходимого для сохранения выбранного нижнего порога регулирования значения pH, о’т л и ч а ю щ и й с я тем, что добавляемое за единицу времени количество щелочного раствора (скорость дозирования щелочного раствора) используют для управления дозированием щелочного раствора) используют для управления дозированием источников . углерода, источников азота, микроэлементов и веществ с эффекторным действием, а также устанавливают' безлимитационность.—

2. Способ по п, 1, отличающийся тем, что| дозирование, азота с использованием гидроокиси аммония осуществляется через самый щелочный раствор.·

3. Способ по п.п. 1 и 2, отличающийся тем, что скорость до- эирования щелочного раствора устанавливается путем добавления фосфатсодержащих веществ..

Аннотация.

Изобретение относится к способу ферментативного получения вторичных метабо·* литов. Оно предназначается для безлимитационного ведения ферментаций для по-> лучения вторичных метаболитов. ,'

Способ проводится путем применения непрерывно учитываемых и регулируемых общих параметров процесса, как значение pH, скорость дозирования щелочного раствора, значение р0<, тепло реакции, состав отходящих газов» Актуальная скорость дозирования щелочного раствора как мера физиологически активного количества фосфата используется для управления дозированием субстратов. В частности в качестве щелочного раствора используется гидроокись ам; мония.

- 8 264022

Признано изобретением по результатам экспертизы, осуществленной Ведомством по делам изобретений и патентов ГДР.

Claims (3)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1· Způsob fermentační výroby sekundárních metabolitů s řízením dávkování substrátu v určitém časovém úseku a přidávání množství alkalického roztoku, potřebného pro udržení a regulaci nižší hodnoty pH. vyznačující se tím, že množství alkaliokého roztoku, přidávané za časovou jednotku, tedy ryohlost dávkování alkalického roztoku, se používá pro řízení dáv· . o kováním zdrojů uhlíku, zdrojů dusíku, mikroelementů a efektorů a také se seřídí bezlimitní průběh·
2. 2· Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že du« siku za použití hydroxidu amonného se provádí přes samotný alkalický roztok·
3. 3· Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že rychlost dávkování alkaliokého roztoku se nastaví přidáním látek obsahujíoích fosforečnan·