CS267157B1

CS267157B1 - Testovacie tablety na stanovenie mikrobiálnel alfa amylázy

Info

Publication number: CS267157B1
Application number: CS869694A
Authority: CS
Inventors: Ludovit Ing Csc Kuniak; Jiri Ing Csc Zemek; Michal Rndr Tkac; Alfred Dr Taufel
Original assignee: Kuniak Ludovit; Zemek Jiri; Michal Rndr Tkac; Alfred Dr Taufel
Priority date: 1986-12-22
Filing date: 1986-12-22
Publication date: 1990-02-12
Also published as: CS969486A1

Description

Vynález sa týká spósobu přípravy testovacích tabliet na stanovenie mikrobiálněj alfa amylázy; alfa(1—^4) glukán glukánohydroláza EC 3.2.1.1.

Hydrolázové enzýmové aktivity sa stanovujú spolahlivo a poměrně jednoducho v posledných rokoch použitím příslušných chromolytických substrátov. Spravidla je stanovenie založené na tom, že nerozpustný chromolytický substrát sa nechá reagovat s roztokom, ktorého aktivitu meriame. Očinkom přítomného hydrolázového enzýmu sa nerozpustný chromolytický substrát štiepi na rozpustné farebné produkty, čím po přerušení enzýmovej reakcie a filtrácii rozpustného podielu sa získá farebný roztok, intenzita ktorého je priamo úměrná prítomnej enzýmovej aktivitě. Existujú už viaceré komerčně a praxou overené tabletové testy, najma pre potřeby humánněj diagnostiky, napr. tabletové testy na stanovenie úrovně alfa amylázy v biologických tekutinách pri diagnóze funkčných porúch pankreasu; Phadebas Amylase Test [^Clinical and technical information, Almquist, Wirksells Boktryckeri (19791J a čsl. výrobok SPOFA Test alfa amyláza £čs. AO č. 202 761 (19800. Prax potvrdila, že obzvlášť je výhodné, ked chromolytický substrát je upravený v tabletovéj forme, čo u užívatela značné šetří pracnost stanovenia najma v rutinněj prevádzke oddělení klinickéj biochémie, kde stanovenie alfa amylázy patří k základným a najpočetnejším stanoveniam.

Ďalšou oblasťou kde sa vyžaduje obdobný test na stanovenie alfa amylázy je výroba priemyslových enzýmov záměrně produkovaných róznymi mikroorganizmami najčastejšie baktériami, plesňami alebo hubami, štúdiom róznych typov alfa amylázy podlá typu mikrobiálnych producentov sa zistilo, že pH optimum mikrobiálnych amyláz nie je konštantné, ale značné kolíše. Z uvedených dóvodov známe alfa amylázové testy pre klinickú humánnu diagnostiku nie sú spolahlivé pre rožne typy mikrobiálnych amyláz. Kým ludská alfa amyláza má pH optimum okolo 7, tak u mikrobiálnych amyláz táto hodnota leží v širokom rozsahu pH 5 až 9,5. Tieto poznatky je potřebné rešpektovat pri meraní róznych typov amyláz, pretože nie je možné pre správné meranie absolútnych aktivit mikrobiálnej amylázy použit tabletové testy určené pre stanovenie úrovně ludskej amylázy v biologických tekutinách.

Uvedené nedostatky sú vyriešené testovacími tabletami na stanovenie mikrobiálnej alfa amylázy podlá vynálezu, ktorého podstatou je, že pozostávajú z 45 až 65 % hmot, mikrokryštalickej celulózy s velkosťou častíc 60 až 300 2 % hmot, mastenca, 2 až 3 S hmot, proteinu například práškového hovadzieho albuminu alebo rozpustnej frakcie vaječného bielka a 30 až 50 % hmot, chromýlitického škrobového substrátu s velkosťou častíc 60 až 300 pm s obsahom 5 až 8 % hmot, kovalentne viazaného farbiva dvojsodnej soli kyseliny 8-amino-5-p-(sulfoetylsulfonyl) anilino]-6-antrachinon sulfonovej vo forme 100 mg + 3 % hmot, tabliet o pevnosti 2,5 až 3,5 kp.

Tabletové testy pre stanovenie mikrobiálnej alfa amylázy neobsahujú teda zložky zabezpečujúce pH optimum meranej enzýmovej aktivity podlá typu mikroorganizmu. Výhodou takto připravených tabliet je ich univerzálnost pre široký rozsah pH'. Potřebné pH optimum pre alfa amylázy rozdielnych mikroorganizmov sa zabezpečuje tak, že pri analýze miesto destilovanej vody sa pipetuje predpísaný objem ústojného roztoku o potrebnom pH i ionovej sile. Takýmto spósobom merané aktivity alfa amylázy sú správné a zrovnatelné pre rózne typy mikrorganizmov produkujúcich tento dóležitý enzym. Spolu s ústojným roztokom sa dodává aj případný aktivátor chlorid vápenatý.

Pre tabletový test na stanovenie mikrobiálnej alfa amylázy je vhodné použiť chromolytický škrobový substrát s napúčacím objemom vo vodě 11 až 15 ml/g, čo podmieňuje dostatočnú citlivost testu i pre nízké úrovně amylázovej aktivity.

Zistilo sa, že pre správnost nameraných amylázových aktivit pre široké spektrum mikroorganizmov produkujúcich alfa amylázu je potřebné proteinové pozadie o niečo vyššie ako pre ludskú alfa amylázu. Preto je potřebné zvýšiť obsah proteinu v testovacej tablete v rozsahu 2 až’3 %. Ako protein je vhodný hovadzí albumin alebo rozpustná frakcia vaječného bielka v práškovej forme. Hlavnou výhodou nového tabletového testu je, že možno ním spolahlivo

CS 267 157 Bl merať alfa amylázovú aktivitu produkovaná róznymi mikroroganizmami. Okrem toho, nový test má všetky známe výhody tabletových testov; podstatnou mierou zrýchluje najma sériové analýzy, šetří pracovně sily a zvyšuje přesnost: analýz. Je obzvlášť cenný v sériovéj analýze najma pri mikrobiálnej produkcii alfa amyláz pri medzioperačnej kontrole jednotlivých technologických operácií.

Příklad 1

300 g chromolytického škrobového substrátu na stanovenie alfa amylázy s velkosťou častíc 60 až 300 ^m, napúčacím objemom vo vodě 11 ml/g a obsahom 8 % hmot, kovalentne viazaného farbiva dvojsodnej soli kyseliny' 8-amino-5-f3-(sulfoetylsulfonyl)anilinoJ-6-antrachinon sulfonovej, dalej 650 g mikrokryštalickej celulózy s velkosťou častíc 60 až 300 ^um, 20 g hovádzieho práškového albuminu a 20 g mastenca sa homogenizuje za sucha a tabletuje na tabletovacom stroji na tablety o pevnosti 2,5 kp a hmotnosti 100 mg s presnosťou + 3 %. Tablety sa samočinné rozpadnú vo vodě do 15 sekund, čo je postačujúce pre požadovanú presnosť a reprodukovatelnosť enzýmovej analýzy.

Příklad 2

Postup ako v příklade 1 s tým rozdielom, že chromolytický škrobový substrát, v množstvu 500 g, obsahoval 5 % hmot, kovalentne viazaného farbiva a mal napúčací objem vo vodě 15 ml/g, dalej sa použilo 450 g mikrokryštalickej celulózy a 3 % hmot, vodorozpustnej frakcie vaječného bielka v práškovej forme. Hotové tablety o pevnosti 3,5 kp majú analyticky obdobné vlastnosti ako tablety podlá příkladu 1.

Riešenie má široké uplatnenie predovšetkým v analytike mikrobiálněj alfa amylázy, resp. pri testovaní mikroorganizmov na alfa amylázovú aktivitu.

Claims

PREDMET VYNÁLEZU

Testovacie tablety na stanovenie mikrobiálnej alfa amylázy, vyznačujúce sa tým, že pozostávajú zo 45 až 65 % hmot, mikrokryštalickej celulózy s velkosťou častíc 60 až 300 ^im, 2 % mastenca, 2 až 3 % hmot, proteinu například práškového hovádzieho albuminu alebo rozpustnej frakcie vaječného bielka a 30 až 50 % hmot, chromylitického škrobového substrátu s velkosťou častíc 60 až 300 s obsahom 50 až 8 % hmot, kovalentne viazaného farbiva dvojsodnej soli kyseliny 8-amino-5-£3-- (sulfoetylsulfony) anilinoj-6-antrachinon sulfonovej vo forme 100 mg + 3 % hmot, tabliet o pevnosti 2,5 až 3,5 kp.