CS267157B1

CS267157B1 - Test tablets for the determination of microbial alpha amylase

Info

Publication number: CS267157B1
Application number: CS869694A
Authority: CS
Inventors: Ludovit Ing Csc Kuniak; Jiri Ing Csc Zemek; Michal Rndr Tkac; Alfred Dr Taufel
Original assignee: Kuniak Ludovit; Zemek Jiri; Michal Rndr Tkac; Alfred Dr Taufel
Priority date: 1986-12-22
Filing date: 1986-12-22
Publication date: 1990-02-12
Also published as: CS969486A1

Abstract

Účelom riešenia sú testovacie tablety na stanovenie mikrobiálnej alfa amylázy. Podstatou riešenia je, že testovacie tablety obsahujú 45 až 65 % hmot. mikrokryštalickej celulózy s velkosťou častíc 60 až 300 μιη, 30 až 50 % hmot. chromylitického škrobového substrátu s velkosťou častíc 60 až 300 μπι a obsahom 5 až 8 % hmot. kovalentne viazaného farbiva dvojsodnej soli kyseliny 8-amino-5-C3-(sulfoetylsulfonyl)- anilinoJ-6-antrachinon sulfonovéj, dalej 2 % hmot. mastenca a 2 až 3 % hmot. proteinu například práškového hovadzieho albuminu alebo rozpustnej frakcie vaječného bielka, pričom pevnost tabliet je 2,5 až 3,5 kp a hmotnost 100 mg + 3 %. Riešenie móže nájst uplatnenie najma v analytike mikrobiálnej alfa amylázy, připadne pri testovaní mikroorganizmov na alfa amylázovú aktivitu, ako i v biotechnologii pri príprave mikrobiálnej alfa amylázy.The purpose of the solution is test tablets for the determination of microbial alpha amylase. The essence of the solution is that the test tablets contain 45 to 65% by weight of microcrystalline cellulose with a particle size of 60 to 300 μιη, 30 to 50% by weight of chromylytic starch substrate with a particle size of 60 to 300 μιη and a content of 5 to 8% by weight of a covalently bound dye of the disodium salt of 8-amino-5-C3-(sulfoethylsulfonyl)-anilinoJ-6-anthraquinone sulfonic acid, further 2% by weight of talc and 2 to 3% by weight of protein, for example powdered bovine albumin or soluble egg white fraction, with the strength of the tablets being 2.5 to 3.5 kp and the weight being 100 mg + 3%. The solution can find application mainly in the analysis of microbial alpha amylase, or in testing microorganisms for alpha amylase activity, as well as in biotechnology in the preparation of microbial alpha amylase.

Description

Vynález sa týká spósobu přípravy testovacích tabliet na stanovenie mikrobiálněj alfa amylázy; alfa(1—^4) glukán glukánohydroláza EC 3.2.1.1.The invention relates to a process for the preparation of test tablets for the determination of microbial alpha amylase; alpha (1- ^ 4) glucan glucan hydrolase EC 3.2.1.1.

Hydrolázové enzýmové aktivity sa stanovujú spolahlivo a poměrně jednoducho v posledných rokoch použitím příslušných chromolytických substrátov. Spravidla je stanovenie založené na tom, že nerozpustný chromolytický substrát sa nechá reagovat s roztokom, ktorého aktivitu meriame. Očinkom přítomného hydrolázového enzýmu sa nerozpustný chromolytický substrát štiepi na rozpustné farebné produkty, čím po přerušení enzýmovej reakcie a filtrácii rozpustného podielu sa získá farebný roztok, intenzita ktorého je priamo úměrná prítomnej enzýmovej aktivitě. Existujú už viaceré komerčně a praxou overené tabletové testy, najma pre potřeby humánněj diagnostiky, napr. tabletové testy na stanovenie úrovně alfa amylázy v biologických tekutinách pri diagnóze funkčných porúch pankreasu; Phadebas Amylase Test [^Clinical and technical information, Almquist, Wirksells Boktryckeri (19791J a čsl. výrobok SPOFA Test alfa amyláza £čs. AO č. 202 761 (19800. Prax potvrdila, že obzvlášť je výhodné, ked chromolytický substrát je upravený v tabletovéj forme, čo u užívatela značné šetří pracnost stanovenia najma v rutinněj prevádzke oddělení klinickéj biochémie, kde stanovenie alfa amylázy patří k základným a najpočetnejším stanoveniam.Hydrolase enzyme activities are determined reliably and relatively easily in recent years using appropriate chromolytic substrates. As a rule, the determination is based on reacting the insoluble chromolytic substrate with the solution whose activity is being measured. By the action of the hydrolase enzyme present, the insoluble chromolytic substrate is cleaved into soluble color products, whereby after stopping the enzyme reaction and filtering the soluble fraction, a color solution is obtained, the intensity of which is directly proportional to the enzyme activity present. There are already several commercial and proven tablet tests, especially for human diagnostics purposes, e.g. tablet tests to determine the level of alpha amylase in biological fluids in the diagnosis of functional disorders of the pancreas; Phadebas Amylase Test [^ Clinical and technical information, Almquist, Wirksells Boktryckeri (19791J and SPOFA Czechoslovak product alpha amylase test No. AO No. 202 761 (19800). form, which significantly saves the user the laboriousness of the determination, especially in the routine operation of the department of clinical biochemistry, where the determination of alpha amylase is one of the basic and most numerous determinations.

Ďalšou oblasťou kde sa vyžaduje obdobný test na stanovenie alfa amylázy je výroba priemyslových enzýmov záměrně produkovaných róznymi mikroorganizmami najčastejšie baktériami, plesňami alebo hubami, štúdiom róznych typov alfa amylázy podlá typu mikrobiálnych producentov sa zistilo, že pH optimum mikrobiálnych amyláz nie je konštantné, ale značné kolíše. Z uvedených dóvodov známe alfa amylázové testy pre klinickú humánnu diagnostiku nie sú spolahlivé pre rožne typy mikrobiálnych amyláz. Kým ludská alfa amyláza má pH optimum okolo 7, tak u mikrobiálnych amyláz táto hodnota leží v širokom rozsahu pH 5 až 9,5. Tieto poznatky je potřebné rešpektovat pri meraní róznych typov amyláz, pretože nie je možné pre správné meranie absolútnych aktivit mikrobiálnej amylázy použit tabletové testy určené pre stanovenie úrovně ludskej amylázy v biologických tekutinách.Another area where a similar test for alpha amylase is required is the production of industrial enzymes intentionally produced by various microorganisms, most often bacteria, fungi or fungi. . For these reasons, the known alpha amylase assays for clinical human diagnosis are not reliable for various types of microbial amylases. While human alpha amylase has a pH optimum of about 7, for microbial amylases this value is in the wide pH range of 5 to 9.5. These findings need to be respected when measuring different types of amylases, because it is not possible to use tablet tests designed to determine the level of human amylase in biological fluids for the correct measurement of the absolute activities of microbial amylase.

Uvedené nedostatky sú vyriešené testovacími tabletami na stanovenie mikrobiálnej alfa amylázy podlá vynálezu, ktorého podstatou je, že pozostávajú z 45 až 65 % hmot, mikrokryštalickej celulózy s velkosťou častíc 60 až 300 2 % hmot, mastenca, 2 až 3 S hmot, proteinu například práškového hovadzieho albuminu alebo rozpustnej frakcie vaječného bielka a 30 až 50 % hmot, chromýlitického škrobového substrátu s velkosťou častíc 60 až 300 pm s obsahom 5 až 8 % hmot, kovalentne viazaného farbiva dvojsodnej soli kyseliny 8-amino-5-p-(sulfoetylsulfonyl) anilino]-6-antrachinon sulfonovej vo forme 100 mg + 3 % hmot, tabliet o pevnosti 2,5 až 3,5 kp.These shortcomings are solved by test tablets for the determination of microbial alpha amylase according to the invention, which consists in 45 to 65% by weight, microcrystalline cellulose with a particle size of 60 to 300 2% by weight, talc, 2 to 3% by weight, protein such as powder. bovine albumin or a soluble fraction of egg white and 30 to 50% by weight of a chromylitic starch substrate with a particle size of 60 to 300 μm containing 5 to 8% by weight of a covalently bound dye of 8-amino-5-p- (sulfoethylsulfonyl) anilino acid disodium salt ] -6-anthraquinone sulfonic acid in the form of 100 mg + 3% by weight, tablets with a strength of 2.5 to 3.5 kp.

Tabletové testy pre stanovenie mikrobiálnej alfa amylázy neobsahujú teda zložky zabezpečujúce pH optimum meranej enzýmovej aktivity podlá typu mikroorganizmu. Výhodou takto připravených tabliet je ich univerzálnost pre široký rozsah pH'. Potřebné pH optimum pre alfa amylázy rozdielnych mikroorganizmov sa zabezpečuje tak, že pri analýze miesto destilovanej vody sa pipetuje predpísaný objem ústojného roztoku o potrebnom pH i ionovej sile. Takýmto spósobom merané aktivity alfa amylázy sú správné a zrovnatelné pre rózne typy mikrorganizmov produkujúcich tento dóležitý enzym. Spolu s ústojným roztokom sa dodává aj případný aktivátor chlorid vápenatý.Thus, tablet assays for the determination of microbial alpha amylase do not contain components ensuring the pH optimum of the measured enzyme activity according to the type of microorganism. The advantage of tablets prepared in this way is their versatility for a wide pH range. The required pH optimum for alpha amylases of different microorganisms is ensured by pipetting the prescribed volume of buffer solution with the required pH and ionic strength instead of distilled water. The alpha amylase activities measured in this way are correct and comparable for the different types of microorganisms producing this important enzyme. Optional calcium chloride activator is supplied with the buffer solution.

Pre tabletový test na stanovenie mikrobiálnej alfa amylázy je vhodné použiť chromolytický škrobový substrát s napúčacím objemom vo vodě 11 až 15 ml/g, čo podmieňuje dostatočnú citlivost testu i pre nízké úrovně amylázovej aktivity.For the tablet test for the determination of microbial alpha amylase, it is suitable to use a chromolytic starch substrate with a swelling volume in water of 11 to 15 ml / g, which conditions sufficient sensitivity of the test even for low levels of amylase activity.

Zistilo sa, že pre správnost nameraných amylázových aktivit pre široké spektrum mikroorganizmov produkujúcich alfa amylázu je potřebné proteinové pozadie o niečo vyššie ako pre ludskú alfa amylázu. Preto je potřebné zvýšiť obsah proteinu v testovacej tablete v rozsahu 2 až’3 %. Ako protein je vhodný hovadzí albumin alebo rozpustná frakcia vaječného bielka v práškovej forme. Hlavnou výhodou nového tabletového testu je, že možno ním spolahlivoIt has been found that a protein background slightly higher than that of human alpha amylase is required for the accuracy of the measured amylase activities for a wide range of alpha amylase-producing microorganisms. Therefore, it is necessary to increase the protein content of the test tablet in the range of 2 to 3%. Suitable proteins are bovine albumin or a soluble fraction of egg white in powder form. The main advantage of the new tablet test is that it can be used reliably

CS 267 157 Bl merať alfa amylázovú aktivitu produkovaná róznymi mikroroganizmami. Okrem toho, nový test má všetky známe výhody tabletových testov; podstatnou mierou zrýchluje najma sériové analýzy, šetří pracovně sily a zvyšuje přesnost: analýz. Je obzvlášť cenný v sériovéj analýze najma pri mikrobiálnej produkcii alfa amyláz pri medzioperačnej kontrole jednotlivých technologických operácií.Measure alpha amylase activity produced by various microorganisms. In addition, the new test has all the known advantages of tablet tests; significantly speeds up, especially serial analyzes, saves manpower and increases the accuracy of analyzes. It is especially valuable in serial analysis, especially in the microbial production of alpha amylases in the inter-operational control of individual technological operations.

Příklad 1Example 1

300 g chromolytického škrobového substrátu na stanovenie alfa amylázy s velkosťou častíc 60 až 300 ^m, napúčacím objemom vo vodě 11 ml/g a obsahom 8 % hmot, kovalentne viazaného farbiva dvojsodnej soli kyseliny' 8-amino-5-f3-(sulfoetylsulfonyl)anilinoJ-6-antrachinon sulfonovej, dalej 650 g mikrokryštalickej celulózy s velkosťou častíc 60 až 300 ^um, 20 g hovádzieho práškového albuminu a 20 g mastenca sa homogenizuje za sucha a tabletuje na tabletovacom stroji na tablety o pevnosti 2,5 kp a hmotnosti 100 mg s presnosťou + 3 %. Tablety sa samočinné rozpadnú vo vodě do 15 sekund, čo je postačujúce pre požadovanú presnosť a reprodukovatelnosť enzýmovej analýzy.300 g of a chromolytic starch substrate for the determination of alpha amylase with a particle size of 60 to 300 [mu] m, a swelling volume in water of 11 ml / g and a content of 8% by weight, of covalently bound dye of 8-amino-5- [3- (sulfoethylsulfonyl) anilino] -6-anthraquinone sulfone, further 650 g of microcrystalline cellulose with a particle size of 60 to 300 μm, 20 g of bovine albumin powder and 20 g of talc are dry homogenized and tableted on a tablet machine into tablets with a strength of 2.5 kp and a weight of 100 mg with an accuracy of + 3%. The tablets disintegrate automatically in water within 15 seconds, which is sufficient for the required accuracy and reproducibility of the enzyme analysis.

Příklad 2Example 2

Postup ako v příklade 1 s tým rozdielom, že chromolytický škrobový substrát, v množstvu 500 g, obsahoval 5 % hmot, kovalentne viazaného farbiva a mal napúčací objem vo vodě 15 ml/g, dalej sa použilo 450 g mikrokryštalickej celulózy a 3 % hmot, vodorozpustnej frakcie vaječného bielka v práškovej forme. Hotové tablety o pevnosti 3,5 kp majú analyticky obdobné vlastnosti ako tablety podlá příkladu 1.The procedure is as in Example 1, except that the chromolytic starch substrate, in an amount of 500 g, contained 5% by weight of covalently bound dye and had a swelling volume in water of 15 ml / g, further 450 g of microcrystalline cellulose and 3% by weight of water-soluble fraction of egg white in powder form. The finished 3.5 kp tablets have analytically similar properties to the tablets of Example 1.

Riešenie má široké uplatnenie predovšetkým v analytike mikrobiálněj alfa amylázy, resp. pri testovaní mikroorganizmov na alfa amylázovú aktivitu.The solution has a wide application especially in the analysis of microbial alpha amylase, resp. when testing microorganisms for alpha amylase activity.

Claims

OBJECT OF THE INVENTION

Test tablets for the determination of microbial alpha amylase, characterized in that they consist of 45 to 65% by weight, microcrystalline cellulose with a particle size of 60 to 300 [mu] m, 2% talc, 2 to 3% by weight, protein such as bovine albumin powder or soluble fraction of egg white and 30 to 50% by weight of a chromylitic starch substrate with a particle size of 60 to 300 containing 50 to 8% by weight of a covalently bound dye of the disodium salt of 8-amino-5- (3- (sulfoethylsulfony) aniline-6-anthraquinone) sulfonic in the form of 100 mg + 3% by weight, tablets with a strength of 2.5 to 3.5 kp.