CS270051B1 - Analogy oxytocinu - Google Patents

Abstract

Řešeni se týká nových analogů oxytocinu vzorce II Me \ CH -CH -CO-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-X-Leu-GlyNH , kde X značí (3,4 )dehydroprolin (ila), nebo 3,4- C3H2) prolin (Hb) a chlrální aminokyseliny mají konfiguraci L. Analog Ha se připraví výstavbou peptidu na pevné fázi a jeho odštěpením pomocí kapalného fluorovodíku. Analog lib se připraví katalytickou redukcí látky Ha plynným triciem. Látka Ila slouží jako prekursor látky lib, která je využívána ve studiu distribuce a metabolismu klinicky využívané látky I (X-Pro).

Description

Vynález se týká syntetických analogů oxytocinu, přirozeného peptidového hormonu ze zadního laloku hypofýzy, Z více jak Jednoho tisíce syntetických analogů tohoto peplldu se Jen zlomek uplatnil pro výhodnější vlastnosti v praxi (Jošt K. a spol. v knize Handbook of neurohypophyseal hormone analogs, CRC Press, USA, 1987). Mezi analogy oxytocinu využívané v praxi pro výhodné vlastnosti se zařadil i [2-O-methyltyrosinJdeamino-l-karba-oxytocln (autorské osvědčení č. 149o28) vzorec I, který pro snížené vedlejší nepříznivé účinky a prodloužení doby účinku na děložní stahy a vylučování mléka (AO 167829) byl uveden do využívání ve veterinární praxi. Pro rozžíření indikačních oblastí, Jakož i případný vývoj nových analogů brání zatím malé znalostí o jeho metabolismu a distribuci v živočišných tkáních a tekutinách po jejím podání do organismu. Jednou z účinných cest poznání metabolismu a distribuce Je využití vhodné značené látky. Jejíž mttabolické produkty a změny hladin intaktní látky Je možné sledovat vhodněji než samotné neznačené látky.

Me \

CH₂-CH₂-CO-Tyr-ne-Gln-Asn-Cye-Pro-beu-GlyNH₂ ---------------------------------------------------------------------------------------------¹ (I)

[2-0 -me thyltyroain J do amin o- 1-karba-oxy tocin

Předmětem tohbto vynálezu Jsou dva nové analogy ^2-0—methyltyrosinj deamlno-l-karba-oxytocinu a to [2-O-methyltyrosin, 7-(3,4 )dehydroproiln]deamino-l-karba—oxytocin (vzorec Ha) a [2-O-mothyltyrosin, 7-(3,4-[³H₂]-prolÍn)Jdeamino-l-karba-oxytocin (vzorec lib) a způsob Jejich přípravy. V dalším jo příprava obou látek a jejich charakteristika přiblížena na příkladech .

N^e .

CH_-CH_—CO-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys—X—Leu-GlyNH_

I ^{2 2}_______________________________________| ² ch₂-------------------------------¹ (n)

Ila, X - (3,4)dehydroprolin| lib, X - 3,4-C^H^J-prolin

Příklad 1

Syntéza [ 2-Q-methyltyrosin, 7-(3,4)dehydroprolin]deamino—1-karba—oxytocinu byla provedena na p-methylbenzhydrylamlnové pryskyřici (o,4 g, o,8 mmol NH./g). Po'navázání karboxyterminální aminokyseliny (Boc-Gly) byly postupně navázány Boc-Leu, Boc-A’’ -Pro, FmocCys(C^H6COOBu^), Fmoc—Asn, Fmoc-Gln, Fmoc—Ile, Boc-Tyr standardním postupem uvedeným v tabulce 1. Po připojení poslední aminokyseliny byla Boc-chránicí skupina odštěpena kyselinou trifluoroctovou, pryskyřice byla neutralizována roztokem triothylaminu a peptid byl cyklizován účinkem lo ekvivalentů dicyklohexylkarbodiimldu a N—hydroxýbenztriazolu v 2,2,2-tri8uoethanolu. Po dosažení negativního, výsledku v ninhydrinovém testu byla pryskyřice důkladné promyta dimethylformamidem a dichlormothanom. Pryskyřice a navázaným peptidem byla vysušena ve vakuu, suependována v teflonové aparatuře · 2o ml kapalného fluorovodíku, 1 ml anisolu a o,5 ml ethandithiolu. Po 1 hod míchání při o °C byl fluorovodík odpařen, suspenze promyta ethylacetátem na fritě a po vysušení ve vakuu byl produkt eluován 3o% kyselinou octovou. Získaný roztok byl zlyofilizován.

Příklad 2

Část (5o mg) lyofilizátu byla rozpuštěna v 3 mol/l(4 ml) AcOH a nanesena na kolonu Bio-Gelu P—4 (7oxl cm). Frakce obsahující žádaný produkt byly spojeny a lyofilizovánv. Produkt

CS 27oo51 Bl byl rozpuštěn v 3 ml/1 AcOH 2 ml a nanesen na kolonu Separonu SI C-18 (25 x o,4 cm). Elucí 5o% methanolem v o,o5% kyselině trifluoroctové byla frakce obsahující 2-O-methyltyro»in, 7-(3,4)dehydroprolin deamino-l-karba-oxytocin zahuštěna ve vakuu a lyofllizována. Bylo získáno 6,2 mg chromatograUcky jednotného produktu, jehož biologické vlastnosti jsou uvedeny v tabulce 2, který hydrogenací na čerstvě vyredukovaném paladiu v dimethylacetátu přechází v [jí—O-methyl-tyrosin| deamino-l-karba-oxytocin (srovnání pomocí HPLC a biol. aktivit ).

Tabulka 1

Výstavba peptldového řetězce na pryskyřici s použitím Fmoc-amtnokyseliny nebo Boc-amlnokyseliny. Obecné schéma.

	Fmoc -aminokyseliny			Boc-aminokyseliny
krok	reagencie (15 ml)	min	krok	reagencie (15 ml)	min
1	CH2C12 (2x)	3	1	CH2C12 (4x)	7
2	DMF (2x)	3	2	45% TFA V CH2C12	2
3	DMFtpiperidin (1:1) (2x)	2o	3	_ _	2o
4	DMF (2x)	3	4	CH2C12 (3x)	5
5	dioxan: H2O (2 t 1) (2x)	lo	5	8% TEA v CH2C12 (2x)	3
6	DMF (3x)	5	6	CH2C12 (4x)	7
7	CH2C12 (či DMF) (3x)	5	7	HOBt ester Boc-Ak čl symetrický anhydrid (3 ekv.) V ch2ci2	4o i více
8	HOBt ester Fmoc AK 21 symetrický anhydrid (3 ekv.) v CH2C12 čl CH2C12 : DMF	15 i více	8	ninhydrinový test	5
9	ninhydrinový test	5	9	CH2C12 (3x)	5
lo	v případě potřeby opakovat kondenzaci (krok 7 až 9)		lo	2—propanol ( 3x )	5
11	DMF (5x)	8	11	CH2C12 (4x)	7
12	1-propanol (5x)	8	12	v případě potřeby opakovat kondenzaci (krok 7 až 11)
13	CH2C12 (5x)	8

Pozn.

TEA

AK

DME trlethylamin aminokyselin a dime thylformamid

CS 27oo51 Bl

Tabulka 2

Biologické vlastnosti t2-0-methyltyrosln]deamlno-l-karba-oxytoclnu a derivátu s 3,4 dehydroprollnem v poloze 7

Látka

Děloha krysy

Gaiaktogoglcký test test in vitro in vivo in vivo (intenzita účinku.

IU/mg

IU/mg

IU/mg)

C 2—O-Methyltyrosln3 -17 deamino-l-karba-oxytocin

17.1

[2-O-Methyltyrosin, 7- ( 3,4 )

36,2

169,3

91,o de hydro prolinj -deamino-1-karba-oxytocin

Příklad 3

19,o mg PdO bylo předredukováno Hj v methanolu, který byl následně odpařen. Ke katalyzátoru bylo přidáno 0,5 mg [2-O-methyl tyros in, 7—(3,4)dehydroprolin3deamino-l-karba-oxytoclnu a 1 ml dlmethylacstamidu. Smě* byla redukována 6o% plynným trlclem 2,5 h při tlaku 84 kPa.

Po odlyofilizovánf DMAA a odcentrifugování katalyzátoru byl produkt izolován pomocí HPLC na Se par onu SX 18, 25o x 8 mm 53% vodným roztokem methanolu. Výtěžek byl 15o MBq. Biologickým testem na Izolovaně krysí dělo*· in situ bylo ukázáno, že bylo získáno celkem 15o AS (o, 15 βmolu) biologicky účinného triclovaného C2-O-methyltyroslnJdeamino-l-karba-oxytocinu, jehož specifická reaktivita byla (o,99 TBq/mmol).

Claims (2)

1. P ň E D Μ £ T VYNÁLEZU

   Analogy oxytocinu obecného vzore· 11 . ^Me .

   CH_o-CH„-CO-\ryr—Ue—Gin—Asn-Cys—X—Leu—GlyNH, • Z Z । .Z kde X značí (3,4 )dehydroprolin nebo
2. 3,4-C³H₂jprolin a chirálnf aminokyseliny mají konfiguraci L.