CS275662B6 - Nosič na stabilizáciu enzýmov a spósob jeho přípravy - Google Patents

Abstract

Riešpnie sa týká nosiča na stabilizáciu enzýmov tia báze proteínov. Jeho podstatou je, že je tvořený práškovou formou proteinu, s výhodou vaječného bielka, alebo hovadzieho albuminu, alebo kazefnu, zosieteného epi- chlórhydrínom v množstve 15 až 25 X hmot. na hmotnost sušiny proteinu, pričom velkost .častíc nosiča je v rozsahu 40 až 300 mikro- metrov a hodnota napúčania vo vodě je v rozsahu 6 až 15 ml/g. Podstata spósobu přípravy spočívá v tom, že roztok proteinu, s výhodou vaječného albuminu sa zosietuje epi- chlórhydrínom v alkalickom prostředí při teplote 15 až 30 °C po dobu 12 až 20 hodin. Potom sa zosietený protein za mokra defi- bruje na částice o velkosti 40 až 300 mikro- metrov a po premytí sa z nich voda vytěsní etanolom, ktorý sa z gélu volné odpaří. Na vysušený nosič sa nanesie enzýmový roztok hydrolázy v pomere 0,75 ml enzýmového roztoku na 1 g suchého nosiča a nechá sa volné vysušit. Takto zakotvený enzým má vysokú stabilitu pri dlhodobom skladovaní. Rieše- nie má použitie všade, kde je potřebné dlho- dobo stabilizovat hlavně hydrolázové enzýmy . při dlhodobom skladovaní bez straty enzýmo- vej aktivity.

Description

Vynález sa týká nosiča na stabilizáciu enzýmov a spůsobu jeho přípravy.

Stabilizácia enzýmov je důležitá tak pře účely základného výskumu, ako i pre potřeby spoločenskej praxe. Mnohé enzýmy najma pri vysokých stupňoch čistoty sú velmi citlivé na stratu aktivity při skladovaní, a to nielen pri laboratórnych teplotách, ale i při znížených teplotách, čím sa znehodnocuje práca spojená s ich izoláciou a purifikáciou. Sú známe různé spůsoby stabilizácie enzýmov tak v roztoku, alebo v pevnom stave ich chemickou modifikáciou /R.Axén, P.Marin, Jonson J.: Biopolymers 9,401 /1970/, resp. immobilizáciou/ K. Mosbach: Meth. Enzymol. 44,453 /1976/. Společným nedostatkem známých postupov stabilizácie enzýmov je spravidla ich technologická náročnost’, ako i strata značnej časti aktivity enzýmu v modifikačnom stupni.

Uvedené nedostatky rieši nosič na stabilizáciu enzýmov na báze proteínov podlá vynálezu, ktorého podstatou je, že je tvořený práškovou formou proteinu, s výhodou vaječného bielka alebo hovádzieho albuminu alebo kazeínu, zosieteného epichlórhydrínom v množstve 15 až 25 % hmot, na hmotnost’ sušiny proteinu, pričom velkost’ častíc nosiča je v rozsahu 40 až 300 mikrometrov a hodnota napúčania vo vodě je v rozsahu 6 až 15 ml/g. Podstatou spůsobu přípravy nosiča je, že vodný roztok proteinu o koncentrácii 10 až 13 % hmot., s výhodou čerstvý vaječný bielok, sa sieťuje v prostředí hydroxidu sodného o koncentrácii 0,8 až 1,2 % hmot, pri teplote 15 až 25 °C po dobu 12 až 20 h s epichlórhydrínom v množstve 1,5 až 2,5 % hmot, na hmotnost sletovaného proteinového roztoku, načo sa zosietený protein zmixuje v rýchloobrátkovom mixeri v etanole na velkost častíc 40 až 3.00 mikrometrov, suspenzia sa premyje na filtri destilovanou vodou do neutrálnej reakcie a nakoniec sa voda z gelu vytěsní alkoholem a alkohol sa odpaří volné na vzduch alebo vo vákuovej sušiarni pri teplote do 40 °C.

Při využití nosiča podlá vynálezu nedochádza k poklesu aktivity enzýmu a spůsob přípravy nosiča je technologicky podstatné jednoduchší v porovnaní s doteraz známými postupmi.

Výsledný produkt, biely prášok s velkosťou častíc 40 až 300 mikrometrov je vhodný ako pevný nosič na stabilizáciu najma hydrolázových enzýmov. Stabilizácia enzýmu na pripravenom nosiči sa robí jednoducho tak, že enzýmový roztok nalejeme na suchý nosič najlepšie v pomere 0,75 ml roztoku enzýmu na 1 g suchého nosiča, dobré rozmiešame necháme 5 až 10 minút nasat kvapalnú fázu do pórov nosiča a potom zvlhčený nosič necháme volné na vzduchu vysušit .... v tenkej vrstvě. Vysušený nosič s enzýmom sa může skladovat při laboratórnej teplote, resp. u citlivějších enzýmov pri teplote 4 až 8 °C dlhú dobu bez zjavnej straty enzýmovej aktivity. Enzým podlá potřeby uvolníme z nosiča miešaním v 20 až 50 násobku destilovanej vody pri izbovej teplote po dobu 15 minút. Zosietený gél sa odcentrifuguje alebo odfiltruje. Supernatant, resp. filtrát s rozpuštěným enzýmom o původnej aktivitě použijeme podlá potřeby.

Pochopitelné roztok enzýmu před štabilizáciou s ohladom na pH a ionovú silu upravíme na optimálně hodnoty konkrétného enzýmu. Pri navrhovanom spůsobe stabilizácie enzýmov na pevnej bielkovinovej matrici nedochádza ku kovalentnej vazbě enzýmu na pevný nosič, ale jedná sa tu o fyzikálnu adsorbciu enzýmu na pevný nosič, ktorý má protektorové vlastnosti oproti molekule enzýmu, ktorá sa při vysušování orientuje na povrchproteinu tak, že aktivně centra uchovávaného enzýmu sú chráněné proti fyzikálno-chemickej dezakťivácii.

Na přípravu navrhovaného nosiča možno použit aj iný typ proteinu, napr. hovadzí albumin, kazeín a.i., no ekonomicky je najvýhodnejší vaječný bielok.

Hlavnou výhodou navrhovaného spůsobu přípravy nosiča na stabilizáciu enzýmov je jeho všeobecná dostupnost’, jednoduchost přípravy a vysoká účinnost stabilizácie hydrolázových enzýmov.

Příklad 1 .

K 100 g vaječného bielka so sušinou 12,6 % sa přidá 1,5 ml epichlórhydrínu a mieša sa pri laboratórnej teplote 30 min., kedy je epichlórhydrín homogénne rozpuštěný v celom objeme bielka. Potom sa přidá za zrýchleného miešania 1,5 ml 17,5 % hydroxid sodný a nechá sa CS 275 662 B6 2 při laboratórnej teplote sletovat 20 hodin. Po zosietení sa pevný gél mixuje v mixeri pri otáčkách 1500/min v 200 ml etanolu po dobu 2 minut. Zmixovaný gél sa potom odfiltruje cez sklený filter a na filtri sa premýva destilovanou vodou do neutrálnej reakcie filtrátu. Voda sa z gélu vytěsní etanolom a etanol sa odpaří na vzduchu z tenkej vrstvy gelu na filtračnom papieri, alebo sa odpaří vo vákuovej sušiarni při teplote do 40 °C. Vysušený gél sa presituje cez šitá 0,04 a 0,3 mm. Hrubšie částice, ktoré ostáné na site 0,3 mm, sa zo melú za sucha tak, až celý podiel častíc přejde cez šito 0,3 mm. Frakcia, ktorá přejde sitom 0,04 sa pře účely stabilizácie enzýmov nepoužije, ale len frakcia v rozsahu 0,04 až 0,03 mm. Výťažok použitelnej frakcie sa pohybuje v rozsahu 90 až 95 % hmot, na hmotnost sušiny použitého proteinu. Stabilizácia enzýmu: Na 10 g připraveného suchého proteinového nosiča sa naleje naraz 7,5 ml roztoku <?6-amylázy pankreatickej o aktivitě 6,0 yukat vo fosfátovom pufri 0,05 M o pH 7,0 a dobře sa zamieša, aby sa kvapalná fáza rovnoměrně rozdělila na pevnom nosiči. Po 15 min možno vzorku v tenkej vrstvě na celofáne nechať vysušit cez noc při izbovej teplote. Po vysušení sa vzorka homogenizuje v trecej miske a uskladní při izbovej teplote. Po polročnom skladovaní aktivita enzýmu poklesla len o 4,5 %. .

Ak sa rovnaký roztok enzýmu naniesol na rovnaké množstvo suchej mikrokryštalickej celulózy a nechal sa rovnako vysušit, tak sa regenerovalo ihned po vysušení už len 2 % pfívodnej aktivity, tj. mikrokryštalická celulóza nemá žiadné protektorové vlastnosti pře uchovávanie enzýmovej aktivity pri skladovaní enzýmov.

Příklad 2

Postup ako v příklade 1 s tým rozdielom, že na sieťovanie sa použije 2,5 ml epichlórhydrínu a sieťovanie trvá 12 hodin pri laboratórnej teplote. Výsledný produkt má obdobné vlastnosti ako produkt v příklade 1.

Příklad 3

Postup ako v příklade 1 s tým rozdielom, že ako protein sa použije hovádzí albumin rozpustný v destilovanej vodě na koncentráciu 12,0 % hmot. Výsledný produkt má porovnatelné vlastnosti ako produkt z příkladu 1.

Příklad 4 .

Postup ako v příklade 1 s tým rozdielom, že ako enzým na štabilizáciu sa použije slinná alfa-amyláza. Stabilita enzýmu je obdobná po pol roku ako v příklade pankreatickej alfa amylázy.

Vynález má použitie všade, kde je potřebné skladovat hydrolázové enzýmy bez straty aktivity, napr. při přípravě enzýmových štandardov slinnej a pankreatickej alfa amylázy pri diagnostikovaní funkčných porúch pankreasu v humánněj medicine.

Claims (3)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1 .Nosič na štabilizáciu enzýmov na báze proteínov, vyznačujúci sa tým, že je tvořený práškovou formou proteinu, s výhodou vaječného bielka alebo hovadzieho albuminu alebo kazeínu, zosieteného epichlórhydrínom v množstve 15 až 25 % hmot, na hmotnost sušiny proteiny, pričom velkost’ častíc nosiča je v rozsahu 40 až 300 mikrometrov a hodnota napúčania vo vodě je v rozsahu 6 až 15 ml/g.
2. 2 . Spósob přípravy nosiča na štabilizáciu enzýmov podía bodu 1, vyznačujúci sa tým, že vodný roztok proteinu o koncentrácii 10 až 13 % hmot., s výhodou čerstvý vaječný bielok, sa sieťuje v prostředí hydroxidu sodného o koncentrácii 0,8 až 1,2 % hmot, pri teplote 15 až 3 CS 275 662 B6 30 °C po dobu 12 až váného proteinového 20 h s epichlórhydrínom v množstve 1,5 až 2,5 % hmot, na hmotnost sieťoroztoku, načo sa zosietený protein zmixuje v etanole na velkost’ častíc

   40 až 300 mikrometrov suspenzia sa premyje na filtr! destilovanou vodou do neutrálnej reakcie, voda sa z gélu vytěsní alkoholem a alkohol sa odpaří pri teplote do 40 °C.