CS276181B6

CS276181B6 - Spůsob izolácie povrchového antigénu 987-p baktérií Escherichia coli

Info

Publication number: CS276181B6
Application number: CS902167A
Authority: CS
Inventors: Oto Mudr Csc Sova
Original assignee: Ustav Fyziologie Hospod Zviera
Priority date: 1990-05-02
Filing date: 1990-05-02
Publication date: 1992-04-15
Also published as: CS216790A3

Description

X, CS 276181 G 6

Vynález sa týká spdsobu izolácie povrchového antigénu 987-P (pilusového) bakteriíEschorichia coli, ktorý slúži bu3 samostatné k imunizácii prašných prasnic alebo telnýchkrav alebo ako doplnok k iným vakcínam proti črevným zápalom a hnačkám.

Kolienteritídy a kolihnačky novorodených teliat a prasiat spósobujú enteropatogénnebaktérie Escherichia coli, ktoré sa adherujú na črevnú stenu postihnutých zvierat a potomvylučováním enterotoxínov spósobujú črevný zápal a hnačky, v dósledku kterých novorodencičasto hynu. Zdolanie tohoto črevného zápalu je vážným problémom. Najúspesnějsou je imuni-zácia zvierat antigénom adherencie, ktorý zabraňuje baktériám přilnut’ ku črevnej stene atým aplikovat’ v potrebnom množstve svoje toxíny a tak spósobovaf onemocnenie. Ooteraz naj-účinnejšou bola imunizácia matiek před půrodom parenterálnou cestou, celulárnou alebo sub-celulárnou vakcínou obsahujúcou buď celé, šetrne usmrtené enteropatogénne baktérie nesúcena svojom povrchu příslušný antigéen, alebo izolovaný pilusový antigén či kombináciu oboch. V poslednom čase sa stává aktuálnou otázka výroby vakcíny z povrchového antigénu987-P. Ooteraz známe postupy izolácie tohoto povrchového pilusového antigénu E.coli majúkomplikovaný postup a vel’kú prácnosť. Při izolácii sa používá až deváť operácií, z ktorýchmožno spomenúť centrifugáciu, ultracentrifugáciu, ionexovú chromatografiu, zrážanie, ultra-filtráciu, gólové chromatografiu (Nagy, L.K., Mc Kenzie, T., Painter, K.R.: Veterinary re-curd (1905), 117, 408-413), pričom výťažok je relativné nízký.

Uvedené nedostatky v podstatnej miere odstraňuje spósob izolácie povrchového piluso-vého antigénu 907-P z baktérií Escherichia coli podl’a vynálezu, ktorého podstata spočíváv tom, že sa pilusový antigén 987-P z povrchu těla enteropatogénnych baktérií E.coli sepa-ruje homogenizáciou a izoluje autofokusáciou do takej koncentrácie, že vykazuje jasné pre-cipitačné líniu při difúzii v agare voči antiséru anti 987-P až do riedenia 1 : 128. Výhodou izolácie povrchového pilusového antigénu podl’a vynálezu sú nízké výrobně ná-klady, jednoduchá manipulácia při imunizácii zvierat, jednoduchost’ vlastného spósobu izo-lácie antigénu, ktorý vylučuje trvalé obsluhu aparatury a potřebu akýchkolvek chemikálií,pretože scparácia prebieha len v apyrogénnej destilovanej vodě.

Uvedený příklad ilustruje, ale neobmedzuje predmet vynálezu. Příklad 1

Enteropatogénne baktérie Escherichia coli 987-P, nesúce na svojom povrchu pilusovýantigén 987-P, sa po be/uej kultivócii, zaručujúccj produkciu uvedeného antigénu, odstrediaa bakteriu bez supernatautu sa resuspeuduje v sterilně destilovanej vodě chladenej na 4 ”cpomocou homogenizéra počas 5 až 10 minét při 3 000 1/min a teplote do 4 °C. Tým nastaneodseparovanie pilusov obsahujúcich bielkovinovú zložku antigénu 907-P. Homogenát sa potomodstředí při 70 000 m.s-2 po dobu 20 minét při teplote do 4 °C. Supernatant, ktorého vodi-vost’ sa upraví na hodnoty do 800 /uS.cm-^ přidáním destilovanej vody, sa aplikuje do auto-fokusačnej aparatéry a po jej uzatvorení sa aplikuje jednosměrný elektrický préd maximálně3V a roztok sa fokusuje při teplote do 4 °C, kým prúd neklesne na jednu desatinu svojejpčvodnej hodnoty při maximálnom napatí 1 000 V. Po fokusácii sa zmeria vo všetkých pracov-ných komůrkách aparatéry pH a obsah antigénu 907-P ntisérom. Pilusový antigén 907-P foku-suje automaticky k pH 4,2 až 4,8. Z priehradiek s pH v tomto rozmedzí sa zhromažďuje pilu-sový antigén 987-P. Jeho pil sa upraví na hodnotu 7 a koncentrácia sa upraví tak, že vyka-zuje pri sledovaní precipitácie v agare jasné precipitačnú líniu voči antiséru anti 907-Paž do riedenia 1 : 120.

Po dosiahnutí tejto koncentrácie sa do roztoku přidá olejové adjuvans a podává saparenterálne prašným prasniciam asi 6 týždňov před půrodom. Táto doba postačuje k tomu,aby uvedená dávka vytvořila u matiek protilátky voči 907-P antigénu a po napití mlezivasa tieto přenesu do čriev novorodencov. Tieto protilátky potom zabraňujé enteropatogénnymbaktériám E.coli 987-P adherovať sa na črevnú stenu a tak sposobovať kolienteritídy a koli-hnačku.

Claims

CS 276181 86
2 Příklad 2 Postup rovnaký ako v příklade 1, vodivost' supernatantu sa upravila dialýzou a pH zhromaždeného pilusového antigénu 987-P sa upravilo na 7,2. Příklad
3 Postup rovnaký ako v příklade 1, vodivost’ supernatantu sa upravila ultrafiltrácioua pH zhromaždeného pilusového antigénu 987-P sa upravilo na 7,4. Příklad
4 Postup rovnaký ako v příklade 1, vodivost’ supernatantu sa upravila dalším přidánímantigénu 987-P a pH zhromaždeného pilusového antigénu 987-P sa upravilo na 7,5. Vynález móže nájsť široké praktické využitie v živočíšnej výrobě vo velkochove osípa-ných, kde podstatné může prispieť k znižovaniu úhynu novorodencov z titulu kolienteritída kolihnačiek. PATENTOVÉ NÁROKY Spůsob izolácie povrchového pilusového antigénu 987-P bielkovinovej povahy z povrchutěla enteropatogénnych baktérií Escherichia coli, vyznačujúci sa tým, že pilusový antigén987-P sa z povrchu těla baktérií separuje homogenizáciou a izoluje autofokusáciou v auto-maticky sa vytvarajúcom gradiente pH k hodnotám pH 4,2 až 4,8 do koncentrácie, v ktorejvykazuje jasnu precipitačnú líniu pri difúzii v agare voči antiséru anti907-P až do rie-denia 1 ·. 128.