CS276181B6 - Spůsob izolácie povrchového antigénu 987-p baktérií Escherichia coli - Google Patents

Abstract

-Riešenie sa týká sposobu izolácie povrcho- ' vého pilusového antigénu 987-P z povrchu těla baktérií Escherichia coli, ktorý je vhodný ako imunizačný ochranný prostriedok v prevencii proti kolihnačkám a koliinfekciám-novorodených prasiat a teliat. Baktérie E.coli, nesúce na svojom povrchu pilusový antigén 987-P, sa odstredia, resuspendujú a z povrchu baktérií sa odstránia pilusy s antigénom 987-P. Roztok s antigénom 987-P sa aplikuje do autofokusačného prístroja a antigén sa odíokusuje. Frakcie sa zhromaždia a ich koncentrácia sa upraví tak, aby v riedení 1 ·. 128 vykazovali jasnu precipitačnú líniu pri difdzii v agare voCi antiséru.

Description

Vynález sa týká spdsobu izolácie povrchového antigénu 987-P (pilusového) bakterií

Escherichia coli, který sléži buď samostatné k imunizácii prašných prasnic alebo telných krav alebo ako doplnok k iným vakcínam proti črevným zápalom a hnačkám.

Kolicnteritídy a kolihnačky novorodených teliat a prasiat spósobujú enteropatogénne baktérie Escherichia coli, ktoré sa adherujú na črevné stenu postihnutých zvierat a potom vylučováním enterotoxínov sposobujú črevný zápal a hnačky, v dósledku ktorých novorodenci často hynu. Zdolanie tohoto črevného zápalu je vážným problémem. Najúspešnějsou je imunizácia zvierat antigénom adherencie, ktorý zabraňuje baktériám přilnut’ ku črevnej stene a tým aplikovat’ v potrebnom množstva svoje toxíny a tak sposobovať onemocnenie. Ooteraz najúčinnejšou bola imunizácia matiek před půrodom parenterálnou cestou, celulárnou alebo subcelulárnou vakcínou obsahujúcou buď celé, šetrne usnirtené enteropatogénne baktérie nesúce na svojom povrchu příslušný antigéen, alebo izolovaný pilusový antigén či kombináciu oboch.

V poslednom čase sa stává aktuálnou otázka výroby vakcíny z povrchového antigénu 987-P. Ooteraz známe postupy izolácie tohoto povrchového pilusového antigénu E.coli majú komplikovaný postup a velké prácnosť. Při izolácii sa používá až devať operácií, z ktorých možno spemenéť centrifugáciu, ultracentrifugáciu, ionexovú chromatografiu, zrážanie, ultrafiltráciu, gélovú chromatografiu (Nagy, L.K., Me Kenzie, T., Painter, K.R.: Veterinary record (1985), 117, 408-413), pričom výťažok je relativné nízký.

Uvedené nedostatky v podstatnej miere odstraňuje spůsob izolácie povrchového pilusového antigénu 987-P z baktérií Escherichia coli podlá vynálezu, ktorého podstata spočívá v tom, že sa pilusový antigén 987-P z povrchu těla enteropatogénnych baktérii E.coli separuje homogenizáciou a izoluje autofokusáciou do takej koncentrácie, že vykazuje jasné precipitačnú liniu pri difúzii v agare voči antiséru anti 987-P až do riedenia 1 : 128.

Výhodou izolácie povrchového pilusového antigénu podlá vynálezu sú nízké výrobně náklady, jednoduchá manipulácia pri imunizácii zvierat, jednoduchost’ vlastného spósobu izolácie antigénu, ktorý vylučuje trvalé obsluhu aparatury a potřebu akýchkoťvek chemikálií, protože scparácia prebieha len v apyrogénnej destilovanej vodo.

Uvedený příklad ilustruje, ale neobmedzuje predmet vynálezu.

Příklad 1

Enteropatogénne baktérie Escherichia coli 987-P, neséce na svojom povrchu pilusový antigén 987-P, r>n po bežnej kultivácii, zaručujúccj produkciu uvedeného antigénu, udstredia a bakteriu bez supurna luntu sa resuspenduje v sterilně destilovanej vodě chladenej na 4 °C pomocou homogenizéra počas 5 až 10 minut při 3 000 1/min a teplete do 4 °C. Tým nastane odseparovanie pilusov obsahujúcich bielkovinové zložku antigénu 987-P. Homogenát sa potom odstředí pri 70 000 m.s^-2 po dobu 20 minét při teplete do 4 °C. Supernatant, ktorého vodivost’ sa upraví na hodnoty do 800 yuS.cm^-1 přidáním destilovanej vody, sa aplikuje do autofokusačnej aparatury a po jej uzatvorení sa aplikuje jednosměrný elektrický préd maximálně 3V a roztok sa fokusuje pri teplote do 4 °C, kým préd neklesne na jednu desatinu svojej původnej hodnoty pri maximálnom napatí 1 000 V. Po fokusácii sa zmeria ve všetkých pracovných komůrkách aparatéry pH a obsah antigénu 987-P ntisérem. Pilusový antigén 987-P fokusuje automaticky k pH 4,2 až 4,8. Z priehradiek s pH v tomto rozmedzí sa zhromažďuje pilusový antigén 987-P. Jeho pil sa upraví na hodnotu 7 a koncentrácie sa upraví tak, že vykazuje pri sledovaní prucipitácie v agare jasné precipitačnú liniu voči antiséru anti 987-P až do riedenia 1 : 128.

Po dosiahnutí tejto koncentrácie sa do roztoku přidá olejové adjuvans a podává sa parenterálne prašným prasniciam asi 6 týždňov před půrodoni. Táto doba postačuje k tomu, aby uvedená dávka vytvořila u matiek protilátky voči 987-P antigénu a po napití mleziva sa tieto přenesu do čriev novorodencov. Tieto protilátky potom zabraňujú enteropatogénnym baktériám E.coli 987-P adherovať sa na črevné stenu a tak sposobovať kolienteritídy a kolihnačku.

CS 276181 86 2

Příklad 2 '

Postup rovnaký ako v příklade 1, vodivost' supernatantu sa upravila dialýzou a pH zhromaždeného pilusového antigénu 987-P sa upravilo na 7,2.

Příklad 3

Postup rovnaký ako v příklade 1, vodivost’ supernatantu sa upravila ultrafiltráciou a pil zhromaždeného pilusového antigénu 987-P sa upravilo na 7,4.

Příklad 4

Postup rovnaký ako v příklade 1, vodivost’ supernatantu sa upravila dalším přidáním antigénu 987-P a pH zhromaždeného pilusového antigénu 987-P sa upravilo na 7,5.

Vynález může nájsť široké praktické využitie v živočíšnej výrobo vo velkochove ošípaných, kde podstatné může prispieť k znižovaniu úhynu novorodencov z titulu kolienteritíd a kolihnačiek.

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   Spůsob izolácie povrchového pilusového antigénu 987-P bielkovinovej povahy z povrchu těla enteropatogénnych baktérií Escherichia coli, vyznačujúci sa tým, že pilusový antigén 987-P sa z povrchu těla baktérií separuje homogenizáciou a izoluje autofokusáciou v automaticky sa vytvárajúcom gradiente pH k hodnotám pH 4,2 až 4,8 do koncentrácie, v ktorej vykazuje jasnu precipitačnú líniu pri difúzi! v agare voči antiséru anti907-P až do riedenia 1 ·. 128.