CS276775B6 - Sposob pripravy (^H) radioizotopem značených frakcii kyseliny hyaluránovej alebo jej soli - Google Patents

Description

y 1

CS 276 775 BS o

Vynález sa týká sposobu přípravy ( H) rádioizotopom značených frakcií kyseliny hya-lurónovej alebo jej soli o definovnnej raolekulovej hmotnosti a hodnotenia kvality týchtolátok.

Kyselina hyalurónová /Ha/ a jej deriváty sá polysacharidy glykozaminoglykány zlože-né z opakujúcich sa jednotiek glukuronátu a N-acetylglukozamínu. Narastujáci záujam ovýskům HA a jej derivátov je sposobený rozširujácim sa uplatněním radu preparátov s obsa-hom HA v oftalmológii, reumatológii, dermatológii a v Salších odboroch medicinskej praxe.Možnosti rozširenia aplikácii HA a jej derivátov závisia tiež od Salšieho poznania ichbiochemie v organizme živočichov. Pre in vivo štúdie sa s výhodou používá rádioizotopomznačená HA resp. jej deriváty. Tieto látky musia mat vysoká /= 95 %/ rádiochemická čisto-tu a vysoká měrná rádioaktivitu. HA resp. jej soli je možné získat z tkaniva kohátichhrebienkov, z ludskej pupočnej šnúry, zo sklovca alebo z priedušnice hovadzieho dobytka,ale z baktérii Streptococcus zooepidemicus. HA izolovaná z ktoréhokolvek zdroja je struk-turálně identická, može však byt izolovaná s variabilným stupnom čistoty i polymerizač-ného stupňa.

Na přípravu rádioaktivne- značenej HA a jej derivátov sa využivajá dva sposoby: 1. I< danému biosyntetizujácemu systému /buňky, tkaninové kultáry/ produkujácemu HA sapridajá rádioaktivne prekurzory /napr. (3H)-, (^C)- glukóza, N-acetylglukózamín/.Týmto sposobom sa připravila (3H)- i (^4C)- značená HA s molekulovou hmotnostou rá-dovo až 106 Da /Gallagher 3.T. + kol.: Biochem. 3. 148, 187, /1975/; Winterbourna D. 3. + kol.: Biochem. 3. 182, 707, /1979/; Underhill C.B., Toole B.P.: 3. Cell Biol. 82,475, /1979/). Výhodou tejto metody je, že sa získá HA s vysokou molekulovou hmotnostou a použitímspecificky značených prekurzorov može byt radioaktivita zavedená na specifické mies-to v molekule HA.

Nevýhodou tohto spfisobu přípravy rádioaktivnej HA je prácnost izolácie značenej HAz reakčnej zmesi, potřeba jej dočistenia od balastných rádioizotopom značených endo-génnych látok, poměrně nízký rádiochemický výtažok, často nízká alebo neznáma měrnáradioaktivita, přístrojová náročnost. 2. Chemická metoda přípravy rádioaktivne značenej HA bola prvýkrát publikovaná v r.1982 /Hook M. + kol.: Anal. Biochem. 119, 235, /1982/, ke3 autoři připravili hyalurónová3 3 kyselinu N-deacetyláciou nativnej HA hydrazinom a následnou N( H)-acetyláciou s ( H)--acetanhydridom. Izolácia vysokomolekulovej frakcie (3H)-hyalurónovej kyseliny odnízkomolekulových frakcií sá robila rovnovážnou dialýzou a gélovou chromatografiou.Touto metodou sa připravila HA s měrnou radioaktivitou (3-4) x 10 cpm/ ^,ug kyselinyurónovej.·

Nevýhodou tohto postupu je, že celý proces přípravy a izolácie (3H)-hyalurónovejkyseliny je náročný vzhladom na materiálně vybavenie i čas a poskytuje derivát s poměrněnízkou měrnou rádioaktivitou.

Calšiu metodu na přípravu vysokomolekulovej HA /o mol. hmot. 3 x 103 Da/ značená triciom vypracovali Orlando a kol. /Orlando P. + kol.: 3. Label, Comp. Radiopharm. 22, 951, /1985/). HA sa oxidovala jodistanom sodným a po vyčistění oxidačnóho produktu ultrafil- tráciou a rovnovážnou dialýzou sa spatné redukovala s ( H)-NaBH.. Po dočištěni produktu3 z * rovnovážnou dialýzou a ultrafiltráciou sa získala ( H)-hyaluronová kyselina s rádioche-mickou čistotou 95 % a s měrnou rádioaktivitou zv5,55 MBq/mg.·

Nevýhodou tejto metody je, že pri oxidácii sa znižuje molekulová hmotnost HA a žeultrafiltrácia ňie je najvhodnejšia, keóže biomakromolekuly často upchávajá póry v ultra-filtračných membránách. ’

Metoda, pri ktorej sa zachovává integrita molekuly HA po zavedeni izotopu s vysokouměrnou rádioaktivitou pozostúva z redukcie oligosacharidov HA pomocou NaBH^ /modifikuje sa

CS 275 775 BS 2 iba koncový rodukujúci cukor/, oxidácie vicinálnych hydroxylových skupin a reakcie s al-kyldiaminmi a s Bolton-Hunterovým reagensora /N-sukcinimidyl-3-(4-hydroxyfenyl)propionát/.Výsledný hydroxyfenyl derivát HA sa lahko rádioiodiduje s Na I na redukujúcom konciretazca. Touto metodou možno získat oligosacharidy HAsměrnou rádioaktivitou až lOOOkrátvyššou (Raja R.3. + kol.: Anal. Biochem. 139, 158, /1984/) ako udávájú autoři vyššie opí-saných metod.

Nevýhodou metody je, že nie je vhodná pre polymérnu, ale iba pre oligomernu HA.

Kyselinu hyaluronovú možno jednoducho previest na kyselinu ( H)-hyaluronovú izoto-povou výměnou vodikov za tricium vo vodnom roztoku za katalýzy Pd/CaCOg.

Derivát (3H)-hyalurónovej kyseliny možno tiež připravit alkyláciou nativneho biopo-lyméru s ( H)-metylbromidom s vysokou měrnou rádioaktivitou /1,5 TBq/moll/, v prostředíkvapalného amoniaku pri nizkej teplote (-33,5 °C) bez špeciálnej úpravy východiskovoj HA.Týmto spo'sobom sa připraví reakčná zmes s vysokou měrnou rádioaktivitou, z ktorej sa vy-sokomolekulový derivát H-hyaluronovej kyseliny, resp. jeho frakcie dalej vyizolujú niekto-rou vhodnou metodou a charakterizuji!*

Na charaktěrizáciu molekulových hmotností HA bolí použité nasledujúce techniky: a) viskozimetria (H. Bothner, T. Waaler, O. Wik: Int. □. Biol. Macromol. 1988, 10, 287--291; E. Shimada, G. Matsumura: O. Biochem. 78, 513-517, 1975; b) rozptyl světla (H. Bothner; T. Waaler, 0. Wik: Ing. 0. Biol. Macromol. 1988, 10, 287--291; R. L. Cleland: Arch. Biochem. Biophys. 1977, 180, 57-53; Barret T.W., Baxter 0. E.: Physiol. Chen. Phys. 1982, 14, 19-29); c) sedimentačně analýza (Swann 0. A.: Biochem. Biophys. Acta 1958, 155, 17-30; T. C. Lau-rent, M. Ryan; A. Pietruszkiewicz: Biochim. Biophys. Acta 1950, 42, 476-485); d) rovnovážná ultracentrifugácia (E. Shimada, G. Matsumura: O. Biochem. 78, 513-517, 1975); e) gólová chromatografia (N. Motohashi, I. Moři: O. Chromatogr. 1984, 299, 508-512; M.Terbojevich, A. Česáni, M. Palumbo: Carbohydr. Res, 1985, 157, 259-272; Beaty N. B.,

Tew W. P., Mello R. □.: Anal. Biochem. 1985, 147, 387-395). Zásadnou nevýhodou viskozimetria a rozptylu světla je, že sa týrnito metodami stano-ví len priemerná molekulová hmotnost (viskozitný, Rv, resp. hmotnostný, M^, priemer) apolymery s rozdielnou distribúciou molekulových hmotnosti možu byt považované v dosled-ku rovnakých hodnot Mv, či Rw za totožné látky. Sedimentačně analýza ako i rovnovážnáultracentrifugácia poskytujú sice širšiu výpove3 o tvare distribúcie molekulových hmot-ností analyzovaného polyméru, avšak prevádzka týchto metod je cenovo neúmerne vysoká. Gó-lová chromatografia na rozdiel od jej vysokoéčinnej modifikácie (HP GPC) je poměrně poma-lá. Oedna analýza spravidla trvá niekolko hodin až desiatok hodin.

Pre charaktěrizáciu distribúcie molekulových hmotnosti, ako aj jednotlivých defino-vých priemerov molekulovej hmotnosti polymérov (biopolymérov) sa dnes vo svete najfrekven-tovanejšie použiva metoda vysokoúčinnej gélovej permeačnej chromatografie (HP GPC).

Uvedené nevýhody známých postupov odstraňuje sposob pripravy ( H) rádioizotopom zna-čených frakcii kyseliny hyalurónovej alebo jej soli o definovanej molekulovej hmotnostipodlá vynálezu. Oeho podstata je, že sa nativna kyselina hyalurónová alebo jej sol označí(3H) rádioizotopom a zmeria sa radioaktivita odobratej vzorky metodou kvapalinovej scin-tilačnej spektrometrie (LSS). Značená HA sa s výhodou robí tak, že sa na vodný roztok kyseli-ny hyalurónovej alebo jej soli pžsobi za přítomnosti katalyzátore Pd/CaCOg plynným trí-ciom, odstráni sa rozpúštadlo a labilná rádioaktivta. Iným vhodným sposobom značenia HAje, že sa alkyluje s ( H)-methylbromidom v prostředí kvapalného amoniaku, ktorý sa po neu-tralizácii odstráni. (3H) rádioizotopom označená kyselina hyalurónová alebo jej sol sa ne- 3 CS 275 775 B6 chá prechádzat cez vrstvu kationomeniča, s výhodou zo skupiny dsrivátov karboxymetylce-lulózy, Následné sa HA alebo jej sol rozdělí na frakcie a stanoví sa ich modekulováhmotnost metodou vysokoúčinnej gélovej permeačnej chromatografie (HP GPC). HP GPC izolá-cia a identifikácia frakcii (3H)-HA ako aj soli sa robi pomocou chromatografických kolonnaplněných hydroxyethylmetakrylátom. Ako mobilná fáza sa použije 0,1 M vodný roztok du-sičnanu sodného, NaNOg. Nakoniec sa‘zmeria radioaktivita odobratej vzorky prislušnej frak-cie HA alebo jej soli metodou kvapalinovej scintilačnej spektrometrie. Přednosti navrhovaného sposobu spočívajú predovšetkým v tom, že bez predchádzajúcejmodifikácie východiskovéj HA, ktorá často mala za následok zniženie molekulovej hmotnos-ti, sa dosiahne označenie HA triciom s molovou rádioaktivitou niekolkonásobne vyššou akopri doteraz používaných metodách. Dalej izolócia ( H)-hyaluronovej kyseliny alebo jej so-li z reakčnej zmesi pomocnou GPC,' ktorá je Jednoduchá a nenáročná, je účinnejšia ako do-teraz používané (dialýza resp. ultrafiltrácia); vysokoúčinná modifikácia GPC je aj pod-statné rýchlejšia. Okrem vysokém mernej radioaktivity sa sposobom podlá vynálezu pripra-ví ( H)-hyaluronová kyselina resp. jej sol s vysokou rádiochemickou čistotou pričom kom-bináciou metod· GPC a LSS možno okrem toho-jednoducho charakterizovat ich molekulová dis-tribúciu a polymolekularitu a stanovit mernú radioaktivitu roznych frakcii. Ďalej uvedené příklady ozrejmujú navrhovaný postup, pričom však nijako neobmedzujúrozsah ochrany vynálezu. Příklad 1

Do reakčnej banky o objeme 1,0 ml sa odváži 10 mg katalyzátore (10% PdO/CaCOg) apripipetuje sa 0,5 ml vodného roztoku kyseliny hyalurónovej (10 mg). Reakčná banka sa po-tom připojí k titračnej aparatúre. Dej obsah sa ochladí kvapalným dusikom a titračná apa-ratura sa evakuuje. Do reakčnej banky sa za pomoci Toeplerovej pumpy privedie do zásob-níka 200 G3q trícia bez nosiča. Reakčná zmes sa premiešava elektromagneticky pri teplo-to 295 K. Po 100 min. sa reakcia ukonči, obsah reakčnej banky sa zmrazí a zostatkovétrícium sa prevedie do zásobniko. Mrazovou sublimáciou v uzavretoro systéme sa odstránirozpúštadlo a labilná rádioaktivita. Odparok sa rozpustí v 2’ml redestilovanej vody a ka-talyzátor sa oddělí odstředěním. Zbytky labilně viazaného trícia sa odšťránia opakovanoumrazovou sublimáciou v uzavretom systéme. Vzorka reakčnej zmesi sa nastrekne do HP GPCsystému a na kolonách naplněných hydroxyethylmetakrylátom (Separon HEMA S-1000 a SeparonHEMA S-300) zapojených v sérii sa reakčná zmes rozdělí do frakcii o roznej molekulovejhmotnosti. Mobilnú fázu tvoři 0,1 M vodný roztok dusičnanu, sodného, NaN0„. I< izolovaným 3 , ·* -frakciám ( H) hyaluronovej kyseliny sa přidá álikvotné množstvo-kvapalného scintilátoraa ich rádioaktivita sa zmeria metodou kvapalinovej scintilačnej spektrometrie na přístro-ji Packard 300 CD. Z vysokomolekulových frakcii ( H)-HA s vysokou rádioaktivitou sa alikvotnó část (100 ,ul) — 3 » opatovne nastrekne do HP GPC systému a stanovia sa molekulové charakteristiky (JH)-hyalu-rónovej kyseliny. Zo získaných hodnot boli vypočítané následovné charakteristiky: - 3 5 - priemerná molekulová hmotnost Mp ( H)-HA a 2,28 x 10 Da - polymolekularita vzorky D a 1,98 - měrná rádioaktivita čistej ( H)-HA = 3,3 MBq/mg Přiklad 2 K vodnému roztoku kyseliny hyalurónovej (5 mg v 0,5 rol redestilovanej vody) sa přidá0,6 ml etanolu a 9 ml éteru. Vzniknutý·roztok s bielou suspenziou sa odpari na vákuovejodparke a odparok sa vysuší do konštantnej hmotnosti. Reakčná aparatura so spatným chla-dičom sa vypláchne sušeným amoniakom. I< odparku v reakčnej banka o objeme 10 ml sa pri-destilujú 3 ml suchého amoniaku. Reakčná zmes sa mieša 10 min za varu amoniaku a k re-akčnej zmesi sa pridajú 2 mg sodika. Vzniknutý modrý roztok sa za minutu odfarbi. Přidá

Claims (3)

1. CS 27G 775 B5 4 o sa O,'5 ml toluénu, v ktorom je rozpuštěných 5 GBq ( H)-metylbromidu. Reakčná zmes sa re-fluxuje 1 hodinu pri elektromagnetickom miešani. Kvapalný amoniak sa pa neutralizácii(4 mg HN^Cl) nechá odpařit. Odparok sa rozpust! v redestilovanej vodě a znova odpaří. Porozpuštění odparku sa čistá (3H)-hyalurónová kyselina izoluje zo zraesi pomocou gélovejpermeačnej chromatografie na kolóne Superose 6 (sietovaná agaróza) tak, že zmes sa roz-dělí do frakci! podlá molekulových hmotností, v ktorých sa zmeria radioaktivita metodou 3 LSS. Vysokomolekulové frakcie čistej ( H)-HA s vysokou měrnou rádioaktivitou sa spoja aopatovno analyzujú gólovou permeačnou chromatografiou na přístroji FPLC Pharmacia a kva-palinovou scintilačnou spoktrometriou na přístroji Packard 300 CD. 2 nameraných hodnot boli vypočítané následovně charakteristiky: *•3 5 - priemerná molekulová hmotnost M ( H)-HA = 3,92 x 10 DA - polymolekularita vzorky D = 1,55 3 - měrná radioaktivita ( H)-HA a 37,2 MBq/mg. Přiklad 3 Z reakčnej zmesi; pripravenej podlá příkladu 2, sa alikvotná část vysokomolekulové-ho (3H)-derivátu kyseliny hyalurónovej nastrekne do HP GPC systému, uvedeného v přikla-de 1 a frakcionuja sa na frakcie-po 0,65 ml efluenta, v ktorých sa zmeria radioaktivitametodou LSC uvedenou v přiklade 1. 2 frakcie s najvyššou rádioaktivitou sa do HP GPC sys-tému opatovne nastrekne vzorka, kvoli charakterizaci! distribúcie jej molekulových hmot-nosti. 2istili sa tieto hodnoty (3H)-derivátu kyseliny hyalurónovej: Priemerná molekulová hmotnosti Mp = 9,91 x 104 Da; polymolekularita D = 1,37; měrná rádio-aktivita 7,6 MBq/mg. Obdobné možno danou metodou charakterizovat ktorúkolvsk frakciu vysokomolekulového 3 ? ( H)~derivátu kyseliny hyalurónovej. Příklad 4 čistá (3H)-hyalurónová kyselina připravená podlá přikladu 2 sa podrobila enzymatic-kej degradácii enzýmom-hyaluronidázou EC 3.2.1.35 (Sevac, USOL Praha) pri 37 °C. Množ-stvo přidaného enzýmu bolo 48 TRU/1 mg ( H)-HA. V časových intervaloch (0,2, 6, 10 a 24 h)sa odoberalo po 100 ^ul reakčnej .zmesi, 10 rainút sa nechalo povarit na inaktiváciu enzý-mu a odcentrifugovalo pri 15 000 ot/min. HP GPC analýza, rovnako ako meranie distribúcierádioaktivity jednotlivých vzoriek bolo robené ako v přiklade 1. 2 distribúcie radioak-tivity po 24 hod. digescii vyplynulo, že elučný objem je 14,4 ml, čo odpovedá hodnotěM = 30 000 Da a radioaktivita 19 693 dpm. Po 48 hod. digescii bol elučný objem 15 ml arádioakvitia 21 183 dpm. Vzniklý pík rádioaktívnej (3H)-HA sa už Salšim působením enzýmu nezměnil. Výsledná frakcia nízkomolekulovej ( H)-HA sa vyznačuje nízmou polydisperzitou, 3 preto jej rádioaktivita narástla. Uvedená kinetika degradácie ( H)-HA je totožná s kine-tikou degradácie neznačenej kyseliny hyalurónovej. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. SpSsob přípravy (3H) radioizotopem značených frakcii kyseliny hyalurónovej alebo jejsoli o definovanej molekulovej hmotnossi, vyznačujúci sa tým, že sa nativna kyselinahyaluronová alebo jej sol označí ( H) rádioizotopom, zmeria sa radioaktivita odobra-tej vzorky metodou kvapalinovej scintilačnej spektrometrie, rádioizotopom označenákyselina hyaluronová,' alebo jej sol sa nechá prechádzat cez vrstvu kationomeniča s vý-hodou zo skupiny derivátov karboxymetylcelulózy,' následné sa kyselina hyaluronová ale-bo jej sol rozdělí na frakcie metodou vysokoúčinnej gélovej permeačnej chromatografiea potom sa zmeria radioaktivita odobratej vzorky příslušnéJ frakcie kyseliny hyaluro-novej alebo jej soli metodou kvapalinovej scintilačnej spektrometrie. 4 3. 5 CS 276 775 B6
2. 2. Sposob přípravy podlá bodu 1, vyznačujúci sa tým, že sa nativna kyselina hyalurónováalebo jej sol označí (¾) ródioizotopom tak, že sa na vodný roztok kysoliny hyaluró-novej alebo jej soli posobi za přítomnosti katalyzátore Pd/CaCOg plynným triciom, od-stráni sa rozpúštadlo a labilná radioaktivita. Sposob přípravy podlá bodu 1, vyznačujúci sa tým,' že sa nativna kyselina hyalurónováalebo jej sol označí (3H) rádioizotopom tak, že sa alkyluje s (3H)-metylbromidom vprostředí kvapalného amoniaku, ktorý sa po neutralizaci! odstráni.