CS276775B6 - Sposob pripravy (^H) radioizotopem značených frakcii kyseliny hyaluránovej alebo jej soli - Google Patents

Abstract

Riešenie sa týká sposobu přípravy ("^H) rádioizotopom značených frakcii kyseliny hyalurónovej (HA) alebo jej solí o definevanej molekulovej hmotnosti. Postup spočiva v tom, že sa natívna HA alebo jej sol označí (3H) rádioizotopom, zmeria zsa radioaktivita odobratej vzorky metodou kvapalinovej scintilačnej spektrometrie (LSC). Následné sa HA alebo jej sol nechá prechádzat cez vrstvu kationomeniča, s výhodou zozskupiny derivátov karboxymetylcelylozy, a potom sa rozdělí na frakcie metodou vysokoúčinnej gélovej permeačnej chromatografie a potom sa zmeria radioaktivita odobratej vzorky prislušnej frakcie HA alebo jej soli metodou LSC. Produkt má vysokú rádiochemickú čistotu a vysokú mernú rádioáktivitú.

Description

Vynález sa týká sposobu přípravy ( H) radioizotopem značených frakci! kyseliny hyaluronovej alebo jej solí o definovanej molekulovej hmotnosti a hodnotenia kvality týchto látok.

Kyselina hyalurónová /Ha/ a jej deriváty sú polysacharidy glykozaminoglykány zložené z opakujúcich sa jednotiek glukuronátu a N-acetylglukozamínu. Narastujúci záujem o výskům HA a jej derivátov je sposobený rozširujúcim sa uplatněním radu preparátov s obsahom HA v oftalmológii, reumatológii, dermatológii a v Salšich odboroch medicinskej praxe. Možnosti rozšírenia aplikácii HA a jej derivátov závisia tiež od Salšieho poznania ich biochemie v organizme živočichov. Pre in vivo štúdie sa s výhodou používá rádioizotopom značená HA resp. jej deriváty. Tieto látky musia mat vysoká /= 95 %/ rádiochemickú čistotu a vysokú mernú radioaktivitu. HA resp. jej soli je možné získat z tkaniva kohútich hrebienkov, z ludskej pupočnej šnúry, zo sklovca alebo z priedušnice hovádzieho dobytka, ale z baktérii Streptococcus zooepidemicus. HA izolovaná z ktoréhokolvek zdroja je strukturálně identická, može však byt izolovaná s variabilným stupnom čistoty i polymerizačného stupňa.

Na přípravu rádioaktivne^- značenej HA a jej derivátov sa využívajú dva sposoby:

1. K danému biosyntetizujúcemu systému /buňky, tkaninové kultúry/ produkujúcemu HA sa pridajú radioaktivně prekurzory /napr. (^H)-, (^C)- glukóza, N-acetylglukózamín/. Týmto sposobom sa připravila (³H)- i (^C)- značená HA s molekulovou hmotnostou rádovo až ΙΟθ Da /Gallagher 3.T. + kol.: Biochem. 9. 148, 187, /1975/; Winterbourne D.

3. + kol.: Biochem. □. 182, 707, /1979/; Underhill C.B., Toole B.P.: 3. Cell Biol. 82, 475, /1979/).

Výhodou tejto metody je, že sa získá HA s vysokou molekulovou hmotnostou a použitím specificky značených prekurzorov može byt radioaktivita zavedená na Specifické miesto v molekule HA. ·

Nevýhodou tohto spfisobu přípravy rádioaktivnej HA je prácnost izolácie značenej HA z reakčnej zmesi, potřeba jej dočistenia od balastných rádioizotopom značených endogénnych látok, poměrně nízký rádiochemický výtažok, často nízká alebo neznáma měrná radioaktivita, přístrojová náročnost.

2. Chemická metoda přípravy rádioaktivne značenej HA bola prvýkrát publikovaná v r.1982 /Hook M. + kol.: Anal. Biochem. 119, 236, /1982/, ke3 autoři připravili hyalurónovú 3 3 kyselinu N-deacetyláciou natívnej HA hydrazinom a následnou N( H)-acatyláciou s ( H)3 *

-acetanhydridom. Izolácia vysokomolekulovej frakcie ( H)-hyaluronovej kyseliny od nizkomolekulových frakcii sá robila rovnovážnou dialýzou a gélovou chromatografiou. Touto metodou sa připravila HA s měrnou radioaktivitou (3-4) x 10 cpm/ ^ug kyseliny uronovej.·

Nevýhodou tohto postupu je, že celý proces přípravy a izolácie ( H)-hyaluronovej kyseliny je náročný vzhladom na materiálně vybavenia i čas a poskytuje derivát s poměrně nízkou měrnou rádioaktivitou.

„ _z 5

Dalšiu metodu na přípravu vysokomolekulovej HA /o mol. hmot. 3 x 10 Da/ značená tríciom vypracovali Orlando a kol. /Orlando P. + kol.: □. Label, Comp. Radiopharm. 22, 961, /1985/). HA sa oxidovala jodistanom sodným a po vyčistění oxidačného produktu ultrafiltráciou a rovnovážnou dialýzou sa spatné redukovala s ( H)-NaBH.. Po dočištění produktu z * rovnovážnou dialýzou a ultrafiltráciou sa získala ( H)-hyaluronová kyselina s rádiochemickou čistotou 95 % a s měrnou rádioaktivitou zv5,55 MBq/mg.·

Nevýhodou tejto metody je, že pri oxidácii sa znižuje molekulová hmotnost HA a že ultrafiltrácia nie je najvhodnejšia, ke3že biomakromolekuly často upehávajú póry v ultrafiltračných membránách. ....... ’

Metoda, při ktorej sa zachovává integrita molekuly HA po zavedení izotopu s vysokou měrnou rádioaktivitou pozostáva z redukcie oligosacharidov HA pomocou NaBH^ /modifikuje sa

CS 276 775 86 iba koncový redukujúci cukor/, oxidácie vicinálnych hydroxylových skupin a reakcis s alkyldiamínmi a s Bolton-Hunterovým reagensora /N-sukcinimidyl-3-(4-hydroxyfenyl)propionát/. Výsledný hydroxyfenyl derivát HA sa lahko rádioiodiduje s Na I na redukujúcom konci retazca. Touto metodou možno získat oligosacharidy HAsměrnou rádioaktivitou až lOOOkrát vyššou (Raja R.3. + kol.: Anal. Biochem. 139, 168, /1984/) ako udávájú autoři vyššie opisaných metod.

Nevýhodou metody je, že nie je vhodná pře polymérnu, ale iba pře oligoměrnu HA.

Kyselinu hyaluronovú možno jednoducho previest na kyselinu ( H)-hyaluronovú izotopovou výměnou vodíkov za trícium vo vodnom roztoku za katalýzy Pd/CaC0₃. ·

Derivát ( H)-hyaluronovej kyseliny možno tiež připravit alkyláciou natívneho biopolyméru s ( H)-metylbromidom s vysokou měrnou rádioaktivitou /1,5 TBq/moll/, v prostředí kvapalného amoniaku pri nízkej teplote (-33,5 °C) bez špeciálnej úpravy východiskovoj HA. Týmto spo'sobom sa připraví reakčná zmes s vysokou měrnou rádioaktivitou, z ktorej sa vysokomolekulový derivát H-hyaluronovej kyseliny, resp. jeho frakcie dalej vyizolujú niektorou vhodnou metodou a charakterizujú.

Na chařaktěrizáciu molekulových hmotností HA boli použité nasledujúce techniky:

a) viskozimetria (H. Bothner, T. Waaler, O. Wik: Int. 3. Biol. Macrotnol. 1988, 10, 287-291; E. Shimada, G. Matsumura: □. Biochem. 78, 513-517, 1975;

b) rozptyl světla (H. Bothner; T. Waaler, 0. Wik: Ing. □. Biol. Macromol. 1988, 10, 287-291; R. L. Cleland: Arch. Biochem. Biophys. 1977, 180, 57-63; Barret T.W., Baxter 3. E.: Physiol. Chen. Phys. 1982, 14, 19-29);

c) sedimentačná analýza (Swann D. A.: Biochem. Biophys. Acta 1963, 156, 17-30; T. C. Laurent, M. Ryan; A. Pietruszkiewicz: Biochim. Biophys. Acta I960, 42, 476-485);

d) rovnovážná ultracentrifugácia (E. Shimada, G. Matsumura: O. Biochem. 78, 513-517, 1975);

e) gólová chromatografia (N. Motohashi, I. Mori: O. Chromatogr. 1984, 299, 508-512; M. Terbojevich, A. Česaní, M. Palumbo: Carbohydr. Res, 1986, 157, 269-272; Beaty N. B., Tew W. P., Mello R. Anal. Biochem. 1985, 147, 387-395).

Zásadnou nevýhodou viskozimetria a rozptylu světla je, že sa týmito metodami stanoví len priemerná molekulová hmotnost (viskozitný, R_v, resp. hmotnostný, M^, priemor) a polymery s rozdielnou distribúciou molekulových hmotností možu byt považované v dosledku rovnakých hodnot M_v, či za totožné látky. Sedimentačná analýza ako i rovnovážná ultracentrifugácia poskytujú sice širšiu výpoveň o tvare distribúcle molekulových hmotnosti analyzovaného polyméru, avšak prevádzka týchto metod je cenovo neúmeřne vysoká. Gólová chromatografia na rozdiel od jej vysokoúčinnej modifikácie (HP GPC) je poměrně pomalá. Oedna analýza spravidla trvá niekolko hodin až desiatok hodin.

Pre chařaktěrizáciu distribúcie molekulových hmotnosti, ako aj jednotlivých definevých priemerov molekulovej hmotnosti polymérov (biopolymérov) sa dnes vo svete najfrekventovanejšie použiva metoda vysokoúčinnej gélovej permeačnej chromatografie (HP GPC).

Uvedené nevýhody známých postupov odstraňuje sposob přípravy (³H) rádioizotopom značených frakcii kyseliny hyaluronovej alebo jej solí □ definovanej molekulovej hmotnosti podía vynálezu. Deho podstata je, že sa nativna kyselina hyalurónová alebo jej sol označí ( H) rádioizotopom a zmeria sa radioaktivita odobratej vzorky metodou kvapalinovej scintilačnej spektrometrie (LSS). Značená HA sa s výhodou robi tak, že sa na vodný roztok kyseliny hyaluronovej alebo jej soli pžsobi za přítomnosti katalyzátore Pd/CaCOg plynným tríciom, odstráni sa rozpúštadlo a labilná rádioaktivta. Iným vhodným sposobom značenia HA je, že sa alkyluje s ( H)-methylbromidom v prostředí kvapalného amoniaku, ktorý sa po neutralizácii odstráni. (³H) rádioizotopom označená kyselina hyalurónová alebo jej sol sa ne

CS 275 775 B6 chá prechádzat cez vrstvu kationomeniča, s výhodou zo skupiny derivátov karboxymetylcelulózy. Následné sa HA alebo jej sol rozdělí na frakcis a stanoví sa ich modekulová hmotnost metodou vysokoúčinnej gélovej permeačnej chromatografie (HP GPC) . HP GPC izolácia a identifikácia frakci! ( H)-HA ako aj soli sa robí pomocou chromatografických kolon naplněných hydroxyethylmetakrylátom. Ako mobilná fáza sa použije 0,1 M vodný roztok dusičnanu sodného, NaNOg. Nakoniec sa'zmeria radioaktivita odobratej vzorky prislušnej frakcie HA alebo jej soli metodou kvapalinovej scintilačnej spektrometrie.

Přednosti navrhovaného sposobu spočivajú predovšetkým v tom, že bez predchádzajúcej modifikácie východiskovéj HA, ktorá často mala za následok zníženie molekulovej hmotnosti, sa dosiahne označenie HA tríciom s molovou rádioaktivitou niekoíkonásobne vyššou ako pri doteraz používaných metodách. Dalej izolácia ( H)-hyaluronovej kyseliny alebo jej soli z reakčnej zmesi pomocnou GPC,' ktorá je jednoduchá a nenáročná, je účinnejšia ako doteraz používané (dialýza resp. ultraflltrácia); vysokoúčinná modifikácia GPC je aj podstatné rýchlejšia. Okrem vysokém mernej radioaktivity sa sposobom podía vynálezu pripraví ( H)-hyaluronová kyselina resp. jej sol s vysokou rádiochemickou čistotou pričom kombináciou metod·GPC a LSS možno okrem toho-jednoducho charakterizovat ich molekulová distribúciu a polymolekularitu a stanovit měrné radioaktivitu režných frakci!.

Ďalej uvedené příklady ozrejmujú navrhovaný postup, pričom však nijako neobmedzujú rozsah ochrany vynálezu.

Příklad 1

Do reakčnej banky o objeme 1,0 ml sa odváži 10 mg katalyzátore (10% PdO/CaCOg) a pripipetuje sa 0,5 ml vodného roztoku kyseliny hyaluronovej (10 mg). Reakčná banka sa potom připoj! k titračnej aparatére. Dej obsah sa ochladí kvapalným dusíkem a titračná aparatura sa evakuuje. Do reakčnej banky sa za pomoci Toeplerovej pumpy privedie do zásobníka 200 GBq trícia bez nosiča. Reakčná zmes sa premiešava elektromagneticky pri teplo to 295 K. Po 100 min. sa reakcia ukončí, obsah reakčnej banky sa zmrazí a zostatkové trícium sa prevedie do zásobnika. Mrazovou sublimáciou v uzavretom systéme se odstráni rozpúštadlo e labilná radioaktivita. Odparok sa rozpustí v 2’ml redestilovanej vody a katalyzátor sa oddělí odstředěním. Zbytky labilně vlaženého trícia sa odšťránia opakovanou mrazovou sublimáciou v uzavretom systéme. Vzorka reakčnej zmesi sa nastrekne do HP GPC systému a na kolonách naplněných hydroxyethylmetakrylátom (Separon HEMA S-1000 a Separon HEMA S-300) zapojených v sérii sa reakčná zmes rozdělí do frakci! o roznej molekulovej hmotnosti. Mobilnú fázu tvor! 0,1 M vodný roztok dusičnanu, sodného, NaNO„. K izolovaným 3 , . ^J

-frakciám ( H) hyaluronovej kyseliny sa přidá álikvotné množstvo-kvapalného scintilátora a ich radioaktivita sa zmeria metodou kvapalinovej scintilačnej spektrometrie na přístroji Packard 300 CD.

Z vysokomolekulových frakci! ( H)-HA s vysokou rádioaktivitou sa alikvotná čas opětovně nastrekne do HP GPC systému a stanovie sa molekulové charakteristiky t (100 .ul) (^dH)-hyalurónovej kyseliny. Zo získaných hodnot boli vypočítané následovně charakteristiky:

- 3 5

- priemerná molekulová hmotnost Mp ( H)-HA = 2,28 x 10 Da

- polymolekularita vzorky D a 1,98 q

- měrná radioaktivita čistej ( H)-HA = 3,3 MBq/mg

Příklad 2

K vodnému roztoku kyseliny hyaluronovej (5 mg v 0,5 ml redestilovanej vody) sa přidá 0,6 ml etanolu a 9 ml éteru. Vzniknutý· roztok s bielou suspenziou sa odpaří na vákuovej odparke a odparok sa vysuší do konštantnej hmotnosti. Reakčná aparatura so spatným chladičem sa vypláchne sušeným amoniakem. K odparku v reakčnej banke o objeme 10 ml sa pridestilujú 3 ml suchého amoniaku. Reakčná zmes sa mieša 10 min za varu amoniaku a k reakčnej zmesi sa pridajú 2 mg sodíka. Vzniknutý modrý roztok sa za minutu odfarbí. Přidá

CS 276 775 B5 o

sa 0,5 ml toluénu, v ktorom je rozpuštěných 5 GBq ( H)-metylbromidu. Reakčná zmes sa refluxuje 1 hodinu při elektromagnstickom miešaní. Kvapalný amoniak sa po neutralizácii (4 mg HN.C1) nechá odpařit. Odparek sa rozpustí v redestilovanej vodě a znova odpaří. Po rozpuštění odparku sa čistá ( H)-hyaluronová kyselina izoluje zo zmesi pomocou gélovej permeačnej chromatografie na koloně Superose 6 (sletovaná agaroza) tak, že zmes sa rozdělí do frakci! podlá molekulových hmotností, v ktorých sa zmeria radioaktivita metodou 3

LSS. Vysokomolekulové frakcie čistej ( H)-HA s vysokou měrnou rádioaktivitou sa spoja a opatovne analyzuji! gólovou permeačnou chromatografiou na přístroji FPLC Pharmacia a kvapalinovou scintilačnou spektrometriou na přístroji Packard 300 CD.

Z nameraných hodnot boli vypočítané následovně charakteristiky: *· 3 5

- priemerná molekulová hmotnost M ( H)-HA = 3,92 x 10 DA

- polymolekularita vzorky D = 1,55

- měrná radioaktivita ( H)-HA a 37,2 MBq/mg.

Přiklad 3

Z reakčnej zmesi; pripravenej podlá přikladu 2, sa alikvotná část vysokomolekulové3 ho ( H)-derivátu kyseliny hyaluronovej nastrekne do HP GPC systému, uvedeného v přikla de 1 a frakcionujo sa na frakcie-po 0,65 ml efluenta, v ktorých sa zmeria radioaktivita metodou LSC uvedenou v příklade 1. Z frakcie s najvysšou rádioaktivitou sa do HP GPC syskvoli charakterizaci! diotribúcie jej molekulových hmot3 * ( H)-derivátu kyseliny hyaluronovej:

= 9,91 x 10⁴ Da; polymolekularita 0 = 1,37; měrná rádiotému opatovne nastrekne vzorka, ností. Zistili sa tieto hodnoty Priemerná molekulová hmotností M aktivita 7,6 MBq/mg.

Obdobne možno danou metodou charakterizovat ktorúkolvek frakciu vysokomolekulověho 3 / ( H)~derivátu kyseliny hyaluronovej.

Příklad 4 čistá (¾)-hyaluronová kyselina připravená podlá příkladu 2 sa podrobila enzymatickej degradácii enzýmom-hyaluronidázou EC 3.2.1.35 (Sevac, USOL Praha) pri 37 °C. Množ3 stvo přidaného enzýmu bolo 48 TRU/1 mg ( H)-HA. V časových intervaloch (0,2, 6, 10 a 24 h) sa odoberalo po 100 ^ul reakčnej .zmesi, 10 minút sa nechalo povarit na inaktiváciu enzýmu a odcentrifugovalo pri 15 000 ot/min. HP GPC analýza, rovnako ako meranie distribúcie rádioaktivity jednotlivých vzoriek bolo robené ako v příklade 1. Z distribúcie radioaktivity po 24 hod. digescii vyplynulo, že elučný objem je 14,4 ml, čo odpovedá hodnotě M a 30 000 Da a radioaktivita 19 693 dpm. Pa 48 hod. digescii bol elučný objem 15 ml a rádioakvitia 21 183 dpm. Vzniklý pík rádioaktívnej ( H)-HA sa už dalším posobením enzýmu o nezměnil. Výsledná frakcia nízkomolekulovej ( H)-HA sa vyznačuje nízmou polydisperzitou, preto jej rádioaktivita narástla. Uvedená kinetika degradácie ( H)-HA je totožná s kinetikou degradácie neznačenej kyseliny hyaluronovej.

Claims (3)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   3 _Λ

   1. Sposob přípravy ( H) radioizotopem značených frakcií kyseliny hyaluronovej alebo jej solí o definovansj molekulovej hmotnossi, vyznačujúci sa tým, že sa nativna kyselina hyaluronová alebo jej sol označí ( H) rádioizotopóm, zmeria sa rádioaktivita odobratej vzorky metodou kvapalinovej scintilačnej spektrometrie, radioizotopem označená kyselina hyaluronová,' alebo jej sol sa nechá prechádzat cez vrstvu kationomsniča s výhodou zo skupiny derivátov karboxymetylcelulozy,' následné sa kyselina hyaluronová alebo jej sol rozdělí na frakcie metodou vysokoúčinnej gélovej permeačnej chromatografie a potom sa zmeria radioaktivita odobratej vzorky príslušnej frakcie kyseliny hyaluronovej alebo jej soli metodou kvapalinovej scintilačnej spektrometrie.

   CS 276 775 B6
2. 2. Sposob přípravy podía bodu 1, vyznačujúci sa tým, že sa natívna kyselina hyalurónová alebo jej sol označí (¾) rádioizotopom tak, že sa na vodný roztok kyseliny hyalurónovej alebo jsj soli posobí za přítomnosti katalyzátore Pd/CaCO₃ plynným tríciom, odstrání sa rozpúštadlo a labilná radioaktivita.
3. 3. Sposob přípravy podía bodu 1, vyznačujúci sa tým; že sa natívna kyselina hyalurónová alebo jej sol označí (³H) rádioizotopom tak, že sa alkyluje s (³H)-metylbromidom v prostředí kvapalného amoniaku, ktorý sa po neutralizácii odstraní.