CS276937B6 - Kmen mikroorganismu Rhizopus arrhizus CCM 8109 - Google Patents

Abstract

Podstatou řešeni je nový kmen mikroorganismu Rhizopus arrhizus, mutant R-41, produkující o submerzní kultivaci kyselinu L-mléčnou a i-linolénovou, uložený v čsl. sbírce mikroorganismů pod číslem 8 109. Kmen dosahuje na minerálních médiích výtěžnost kyseliny L-mléčné cca 95 % a výtěžnost T-linolénové kyseliny se pohybuje v rozmezí 0.3-0.4 g/dm3 média.

Description

Vynález se týká nového vysokoprodukčního kmene Rhizopus arrhizus R-41, tvořícího při submerzní kultivaci kyseliny L-mléčnou a τ-linolénovou, které mají široké použití především ve farmaceutickém a potravinářském průmyslu a je uložený v Čsl. sbírce mikroorganismů Masarykovy univerzity v Brně pod číslem CCM 8109.

Kyselina mléčná je produkovaná širokou paletou baktérií rodu Lactobacillus, které mohou vytvářet jak D(-), tak L (+) a DL formy této kyseliny a jsou využívány na průmyslovou produkci. Mléčné baktérie jsou limitovány při produkci řadou růstových faktorů a vyžadují proto náročná komplexně produkční média, což zvyšuje nároky na sterilitu procesu a izolaci čistého produktu. Vláknité houby rodu Rhizopus, produkující kyselinu mléčnou, jsou podstatně méně náročné na výživné faktory a navíc, vykazují vysokou stereospecificitu (produkují výhradně L(+) formu kyseliny mléčné [Vickroy, T.B.: In Comprehensive Biotech, vol.3, str. 761-776, Pergamon Press, 1985]. Tvorba kyseliny mléčné vláknitými houbami rodu Rhizopus je aerobní proces s vysokou rychlostí konverze. Tento fakt je velmi významný z hlediska fermentační přípravy vápenaté soli kyseliny mléčné, protože při použití laktobacilů, díky minimální aeraci a minimálnímu míchání, neutralizace uhličitanem vápenatým je problematická a významně prodlužuje dobu fermentace, ovlivňuje výtěžky, hladinu zbytkových sacharidů a podobně. V neposlední řadě je producent z rodu Rhizopus zajímavý i svou schopností tvořit mastné kyseliny, především τ-linolénovou. Vyšší obsah této mastné kyseliny u vláknitých hub byl pozorován kromě rodu Rhizopus také u dalších tukotvorných hub (rody Mucor, Mortierella, Phycomyces, Aerobasidium, atd.) [Ratledge, C., Boulton, C,A,: In Comprehensive Biotech, vol.3, str. 983, Pergamon, Oxford 1985 ]. Nevýhody přípravy τ-linolénové kyseliny, zmíněnými mikroorganismy spočívají ve vysoké výživové náročnosti, době kultivace (5 až 7 dnů) a vysokými nároky na sterilitu.

Uvedené nedostatky odstraňuje vynález, kterým je nový kmen mikroorganismu Rhizopus arrhizus, mutant R-41 uložen v Čsl. sbírce mikroorganismů, Masarykovy univerzity v Brně, pod označením CCM 8109. Nový kmen byl získán izolací z půdy a byl podroben mutaci. Získaný mutant byl vyočkován na tuhé kultivační médium a spory tohoto mikroorganismu byly použité na inokulaci tekutého kultivačního média s vyšším obsahem sacharidického substrátu a celý postup byl několikrát opakován. Tímto selekčním tlakem byl připraven mutant s ustálenými produkčními parametry, který je schopen vysokoselektivní tvorby kyseliny L-mléčné (výtěžky vyšší než 95 %) ze sacharidických substrátů (glukóza, sacharóza, hydrolyzáty škrobnatých surovin), s obsahem dalších organických kyselin menším než 0,05 mg/ml. Po ukončení konverze sacharidického substrátu na kyselinu L-mléčnou (cca 24 až 30 h) obsahuje producent cca 17 % tuku v sušině, s obsahem τ-linolénové kyseliny cca 18 %. Protože námi selektován producent není schopen*dále utilizovat kyselinu mléčnou, je možné dobu fermentace prodloužit, a tim i zvýšit a regulovat obsah mastních kyselin u producenta (například po 48 h fermentaci je obsah tuku 23 % s obsahem τ-linolénové kyseliny 20 %). Kyselinu L-mléčnou je možné z fermentačního média izolovat např.ve formě vápenaté soli krystalizací, kyselinu τ-linolénovou po promytí mycélia běžnými izolačními postupy [Floch,J., Less,M., Stanlez, G.H.S.: J.Biol.Chem. 226, 1957, s. 497-509].

CS 276937 B6 2

Podstatou vynálezu je nový kmen mikroorganismu Rhizopus arrhizus, mutant R-41 produkující při submerzní kultivaci kyselinu L-mléčnou a τ-linolénovou, uložený v čsl. sbírce mikroorganismů Masarykovy univerzity v Brně pod označením CCM

8109.

Nový kmen Rhizopus arrhizus CCM 8109, mutant R-41 dobře roste a sporuluje na běžných kultivačních médiích (sladinový agar, agar s glukózou a kvasničným extraktem) hůře roste na Czapek-Doxovém agaru. Kolonie jsou charakteristické rychlým růstem vzdušného mycélia, které je spočátku bílé, později šedé. Spodní strana kolonie je bez pigmentu. Spory jsou spočátku bílé, později se od kraje kolonie sbarvují černě. K hojné sporulaci na celé kolonii dochází na třetí den kultivace. Kolonie po 38 h kultivaci při 30 °C dosahují průměr 9.0 cm. Sporangiofóry jsou 2 až 4 mm vysoké. Šířka sporangicforů se pohybuje od 6.0 do 10.5 yum. Sporangiá jsou kulovitá, veliká 100 až 175 /um. Spory jsou oválné s rozměry 5.0 až 8.0 /um. Viabilita spor je velmi dobrá.

Rhizopus arrhizus CCM 8109 mutant R-41 je možné využít na vysokoselektivní přípravu kyseliny L-mléčné a τ-linolénové, které mají široké spektrum využití ve farmaceutickém, potravinářském i chemickém průmyslu. Kmen je schopen konvertovat sacharidické substráty obsahující volnou glukózu, respektive sacharózu na kyselinu L-mléčnou s výtěžky přesahující 95 % vzhledem na původní substrát. Přídavek dalších výživových komponent k minerálnímu médiu (CSL, kvasničný autolyzát) neovlivňují rychlost ani selektivitu kyseliny L-mléčné, ale zvyšují obsah vyšších mastních kyselin v mycéliu. Výtěžnost H-linolénové kyseliny (po izolaci) po ukončení tvorby kyseliny L-mléčné je 0.3-0.4 g/1 fermentačního média.

Vynález ilustruje následující příklad provedení, jimž se však rozsah vynálezu v žádném směru neomezuje.

Příklad 1

Na vodní suspenzi spor Rhizopus arrhizus v koncentraci cca 20 spór/ml s přídavkem 0,1 % (V/V) Tweenu 80 v Petriho misce se působí UV-germicídní lampou (4,8 W/m²) po dobu 7 až 10 minut. V průběhu ozařování byla suspenze míchaná pomocí magnetického míchadla. Suspenze byla potom 2 krát zředěná sterilní vodou a rozlita na sladinový agar a temperovaná 2 dny při 30°C. Vysporulovaná kolonie se odočkuje, spory se nařadí v 0,1 % Tweenu 80 a znovu kultivují na sladinovém agaru 2 dny při 30 °C. Jednotlivé kolonie se hodnotí fermentačními zkouškami na produkci kyseliny L-mléčné a tvorbu gama-linolénové kyseliny v mycéliu.

Takto byl vybrán Rhizopus arrhizus, mutant R-41.

Příklad 2

Připraví se inokulační médium, které obsahuje v Idm³ vodovodní vody: glukózu 15.Og, melasu 10.0g, (NH₄)₂SO₄ 4.0g, KH₂PO₄ 1.6g, MgSO₄. 7H,0 0.25g, ZnSO₄. 7H₂O 0.066g, Fe₂(SO₄)₃ 0,01g, kukuřičný škrob 30.0g, CSL 3.0 ml. 0.1 dm³ inokulačního média v 0.5 dm³ kultivačních baňkách se zaočkuje sporami produkčního mikroorganismu Rhizopus arrhizus CCM 8109 (koncentrace spor cca

2.0.10⁶/ml média) a po 24 h kultivaci na rotační třepačce při 28 °C se submerzní kultura produkčního mikrootganizmu použije na inokulaci produkčního média v 20.0 dm³ fermentoru. Produkční médium obsahuje v 1.0 dm³ vodovodní vody: glukózu 100.0 g,(NH4)2SO4 2.0g, KH2PO4 0.3g, MgSO4.7H?O 0,4g, Fe2(SO4)3 0.01g, ZnSO4< 7H2O 0.044g, CSL 0.5 ml. Samostatná fermentace se provádí při ’28°C, vzdušnění 0.5 až 0.7 objemu vzduchu/objem fermentačního média za minutu, míchaní 420 otáčkách za minutu a přetlaku 0.01 až 0.03 MPa. Hodnota pH fermentačního média byla udržována v průběhu kultivace jednorázovým přídavkem CaCO3 (50g/dm³). Po 30h fermentaci médium obsahuje 73.Og kyseliny L-mléčné, což je 97.3 % teoretického výtěžku. Po skončení fermentace byla biomasa separovaná, promytá destilovanou vodou až do vymytí zbytkového CaCO3. Z takto připravené biomasy se extrahují lipidy běžnými postupy. [Floch, J., Less,M. and Stanley, G.H.S.: J. Biol. Chem. 226, 1957, s 497 až 509]. Objemová výtěžnost kyseliny τ-linolénové se pohybuje v rozmezí 0.3 až 0.35g/l fermentačního média.

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   Kmen mikroorganismu Rhizopus arrhizus CCM 8109 produkující při submerzní kultivaci kyselinu L-mléčnou a τ-linolénovou.

   Konec dokumentu