CS277248B6 - Sposob kvantitativného hodnotenia účinku antibakteriálnych látok "in vitro" - Google Patents

Abstract

Za vhodných rastových podmienok sa paralelné porovnává rast a rozmnožovanie kontrolnej a různými koncentráciami antimikrobiálnej látky ovplyvnených bakteriálnych kultrúr. Na kvantitativné hodnotenie životnosti a rastových vlastností baktérií sa do kultivačného prostredia přidá vo vodě rozpustná sol tetrazóliového farbiva, výhodné 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromid v konečnej koncentrácii 0,005 až 5,0 g/1, výhodné 0,25 g/1, redukcia přidaného tetrazoliového farbiva prebieha vo všetkých kultúrach paralelné a presne ohraničenú dobu, výhodné 15 minút, po ktorej sa reakcia ukončí a vo vodě rozpustný farebný produkt sa solubilizuje přidáním zmesi detergentů a organického rozpúštadla, množstvo vytvořeného farebného produktu sa kvantitativné určí spektrofotometricky, výhodné v oblasti jeho absorpčné- ;ho maxima, a podlá množstva vytvořeného farebného produktu sa určí koncentrácia ;a antimikrobiálnej látky potřebná pre dosiahnutie požadovaného bakteriostatické- ho, alebo bakteriocídneho účinku na vyšet­ řovánu kultúru mikroorganizmov.

Description

Vynález sa týká postupu na in vitro hodnotenie účinku antibakteriálnych látok na základe merania kvantitativných zmien rastu a rozmnožovania baktérií pomocou spektrofotometrickej metody, pri ktorej množstvo za určitý čas živými organizmami vytvořené farebného produktu priamo závisí od ich počtu a metabolickej aktivity.

Hodnotenie počtu, rastu a rozmnožovania baktérií in vitro sa v praxi často využívá pri posudzovaní účinnosti antimikrobiálnych látok. Jednou zo základných požiadaviek kladených na takéto stanovenie je popři přesnosti a jednoduchosti aj jeho rýchlost.

Pre rýchle stanovenie počtu, rastu a rozmnožovania baktérií sa doposial vyvinulo niekolko postupov:

1. Priame mechanické, alebo elektronické počítanie častíc (Pringle, J.R. Mor, J.R.: Methods for monitoring the growth of yeast cultures and for dealing with the clumping problem. Methods Cell. Biol., XI, 1975, 153-168).

2. Fotometrické meranie zmien zákalu (turbidimetria), alebo rozptylu světla (nefelometria) prechádzajúceho suspenziou baktérií (Koch, A.L.: Theory of the angular dependence of light scattered by bacteria and similar-sized biological objects. J. Theor. Biol., 18, 1968, 133-156).

3. Meranie zmien elektrickej impedancie v kultúre rastúcich mikroorganizmov (Ur. A., Brown, D.F.J.: Rapid detection of bacterial activity using impedance measurement. J. Biomed. Eng., 9, 1974, 18-20, patent US 4528270).

4. Mikrokalorické meranie v kultúre rastúcich mikroorganizmov (Binford, J.S., Binford, L.S., Adler, P.: A semiautomated mikcrocalorimetric method of antibiotic sensitivity testing. Am. J. ciin. Pathol·., 59, 1973, 86—94).

5. Meranie zmeny pH spósobenej skvasovaním glukózy v nepufrovanom kultivačnom médiu (čs. patent 215861),

6. Meranie množstva živými baktériami vytvořeného ATP (Karl, D.M.: Cellular nucleotide measurements and applications in microbial ecology, Microbiol. Rev., 44, 1980, 739-796).

7. Radiometrické metody (De Blanc, J.J., Charache, P., Wagner, H.N.: Automatic radiometric measurement of antibiotic effect on bacterial growth. Antimicrob. Agents Chemother., 2, 1972, 360—366).

8. Kvantitativné meranie množstva enzýmov uvolněných rastúcimi baktériami do kultivačného prostredia pomocou fluorogénnych substrátov (Philips, I., Waren, C., Waterworth, P.M.: Determination of antibiotic sensitivities by Sensititre system. J. Clin. Pathol., 31, 1978, 531-535).

Metody podia uvedených príkladov majú viaceré nedostatky, ktoré spočívajú najma v nutnosti používaú suspenziu mikroorganizmov o hustotě až 3 x 108/ml (postupy 2,4), zložitosti postupu a prácnosti metody (1, 4, 6), požiadavke na zložité vyhodnocova cie zariadenie (3, 4,, 6, 7, 8), nutnosti pracovať s radioaktivnymi látkami (7) a komplikovanom rozlišeni medzi stupňom meranej aktívnej odpovede od pozadia a nešpecifických artefaktov (8).

Uvedené nedostatky odstraňuje postup kvantitativného hodnotenia účinku antibakteriálnych látok in vitro podía vynálezu, ktorý spočívá v kvantitatívnom hodnotení zmien počtu, rastu a rozmnožovania živých, metabolicky aktívnych baktériálnych buniek na základe nimi spósobenej redukcie soli tetrazóliového farbiva. Pri reakci!, ktorá prebieha výlučné v živých buňkách, dochádza k interakci! medzi tetrazóliovou solou a cytochrómovým systémem bakteriálněj buňky, pričom sa tetrazóliová sol redukuje za vzniku farebného produktu, ktorého množstvo je úměrné počtu a metabolickej aktivity přítomných baktériálnych buniek.

K výhodám postupu podlá vynálezu v porovnaní s doterajšimi prístupmi patří vysoká citlivost (na stanovenie stačí už hustota bakteriálnej suspenzie 2 x 10⁴/ml), reakcie prebieha výlučné v živých buňkách, minimálny potřebný reakčný čas sa podlá metabolickej aktivity pre váčšinu baktérií pohybuje v rozmedzí 1 až 30 minút. .Metodický postup je jednoduchý a nevyžaduje žiadne separačné kroky, čo spolu so spektrofotometrickým spósobom vyhodnocovania vytvára vhodné podmienky pre jednoduchá automatizáciu. Finančně náklady na stanovenie sú nižšie než pri porovnatelných metodách.

Možnosti použitia postupu podlá vynálezu sú objasněné na príkladoch rýchleho stanovenia citlivosti baktérie Escherichia coll na rožne koncentrácie bakteriostatického antibiotika tetracyklinu. (A) a bakteriocídneho antibiotika s rýchlym nástupom účinkom kolicínu (B). .

Příklad A. Hodnotenie antibakteriálneho účinku tetracyklínu.

Do jednotlivých jamiek mikrotestovej platničky s 96 jamkami s plochým dnom sa napipetuje 100 ul bojónu podlá Mueller-Hintonovej, s klesajúcimi koncentráciami tetracyklínu (256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 a 0 ug/ml). V tomto bujóne sa připraví suspenzia z 18 hodinovej kultúry baktérie Escherichia coli o hustotě lxlO⁶ baktérií/ml. Do jamiek s antibiotikom sa přidá 100 ul bakteriálnej suspenzie, čím sá dosiahnu výsledné koncentrácie antibiotika 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 0,25 a 0 ug/ml. Kontrolně jamka obsahuje namiesto bakteriálnej suspenzie len čistý Mueller-Hintonovej bujón. Platnička sa umiestni do termostatu a inkubuje pri 35 °C 120 minút. Po inkubácii sa do všetkých jamiek přidá 20 ul 3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl tetrazolium bromidu vo fyziologickom roztoku, koncentrácia 2,5 mg/ml) a inkubuje sa dalších 15 minút v termostate pri 35 °C. Potom sa do všetkých jamiek přidá 50 ul solubilizačného roztoku (20% SDS v 50% vodnom roztoku Κ,Ν-dimetylformamidu, pH upravené HC1 a kyselinou octovou na 4,7). Obsah j amiek sa premieša. a platničky sa inkubujú. dalších 5 minút pri 35 °C. Absorbancia v jednotlivých jamkách sa zmeria pomocou spektrofotometre (ELISA reader) pri 550 nm (špecifická absorbancia) a pri 630 nm (nešpe— cifická absorbancia). Namerané korigované hodnoty absorbancie (E55O^-E63o) ^sa vynesu v lineárnom zobrazení oproti koncentrácii antibiotika a zostrojí sa příslušná křivka (obr. 1). Účinnost antibiotika na testovaný bakteriálny kmeň sa posúdí z priebehu získanéj křivky.

Příklad B. Hodnotenie^ antibakteriálneho účinku kolistínu.

Postupuje sa zhodne ako v příklade A, len antibiotikum tetracyklín sa nahradí antibiotikom kolistín. Hodnotenie výsledkov je rovnaké ako v příklade A, pričom pokles absorbancie na nulovú hodnotu (obr. 2) znamená usmrtenie baktérií vo vyšetřované j suspenzii.

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   Spósob kvantitativného hodnotenia účinku antibakteriálnych látok in vitro, pri ktoromsa za vhodných rastových podmienok paralelné porovnává rast a rozmnožovanie kontrolnej a róznymi koncentráciami antimikrobiálnej látky ovplyvnený bakteriálnych kultúr, vyznačený tým, že sa kvantitativné hodnotenie životnosti a rastových vlastností baktérií sa do kultivačného prostredia přidá vo vodě rozpustná sol tetrazóliového farbiva, výhodné 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromid v konečné j koncentrácii 0,005 až 5,0 g/1, výhodné 0,25 g/1, redukcia přidaného tetrazoliového farbiva prebieha vo všetkých kultúrach paralelné a presne ohraničenú dobu, výhodné 15 minút, po ktorej sa reakcia ukončí a vo vodě rozpustný farebný produkt sa solubilizlue přidáním zmesi detergentu a organického rozpúšťadla, množstvo vytvořeného farebného produktu sa kvantitativné určí spektrofometricky, výhodné v oblasti jeho absorpčného maxima, a podía množstva vytvořeného· farebného produktu sa určí koncentrácia antimikrobiálnej látky potřebná pre dosiahnutie požadovaného bakteriostatického, alebo bakteriocídneho účinku na vyšetrovanú kultúru mikroorganizmov.