CS277456B6

CS277456B6 - A method for purifying crude thymosin

Info

Publication number: CS277456B6
Application number: CS428189A
Authority: CS
Inventors: Premysl Ing Csc Vacha; Vladimir Rndr Csc Prochazka; Vladimir Rndr Csc Schwarz
Original assignee: Vyzk Ustav Farm Biochem Sp
Priority date: 1989-07-13
Filing date: 1989-07-13
Publication date: 1993-03-17
Also published as: CS8904281A1

Abstract

Řešení se.týká způsobu čištění surového thymosinu, získaného vysolením brzlíkového extraktu síranem amonným a spočívá v tom, že se na surový thymosin ve vodném roztoku o hodnotě pH 3,0 až 5,0 působí středně basickým měničem aniontů s vázaným aniontem kyseliny o disociační konstantě menší než disociační konstanta kyseliny fosforečné a větší než disociační konstanta složek thymosinu. Efluent z iontoměniče se po zahuštění odsolí gelovou filtrací a lyofilizuje, přičemž získaný thymosin frakce 5 obsahuje méně než 1 % hmot.štěpů nukleových 'CO kyselin (nukleotidů). Zvláště výhodnéJe použít k iyfc iontové výměně kyseliny octové, která vytváří z -W části síranu amonného těkavý octan amonný. Jeho odstraněním při zahuštění eíluentu se w sníží potřeba gelu pro odsolování thymosinu 10 frakce 5. Thymosin frakce 5 se používá k léčbě poruch imunitního systému.The solution relates to a method for purifying crude thymosin obtained by salting out thymus extract with ammonium sulfate, and consists in treating crude thymosin in an aqueous solution with a pH of 3.0 to 5.0 with a moderately basic anion exchanger with a bound acid anion with a dissociation constant smaller than the dissociation constant of phosphoric acid and greater than the dissociation constant of thymosin components. The effluent from the ion exchanger is desalted by gel filtration and lyophilized after concentration, with the obtained thymosin fraction 5 containing less than 1% by weight of nucleic acid grafts (nucleotides). It is particularly advantageous to use acetic acid for ion exchange, which forms volatile ammonium acetate from a portion of ammonium sulfate. Its removal during concentration of the eluent reduces the need for gel for desalting thymosin fraction 5. Thymosin fraction 5 is used to treat immune system disorders.

Description

Vynález se týká způsobu odstraňování nežádoucích štěpů nukleových kyselin (nukleotidů) ze surového thymosinu, který se získává z telecích brzlíků jako meziprodukt při výrobě thymosinu frakce 5. K odstranění nukleotidů slouží středně basický měnič aniontů za podmínek, při nichž se na iontoměnič nezachycují žádané složky thymosinu frakce 5. .The present invention relates to a process for removing unwanted nucleic acid grafts from crude thymosin obtained from calf thymos as an intermediate in the production of fraction 5 thymosin. A medium-basic anion exchanger is used to remove nucleotides under conditions in which the desired thymosin components are not captured on the ion exchanger. fraction 5..

Thymosin frakce 5 je komplex imunomodulačních peptidů, vylučovaných brzlíkem (thymem), které umožňují dozrávání a diferenciaci T lymfocytů v imunokompetentní buňky á podílejí se na správné funkci imunitního systému. Tento komplex se připravuje extrakcí zmražených telecích brzlíků a jeho složení je charakterizováno použitými čistícími a izolačními stupni. Podle hodnoty svých isoelektrických bodů pí se řadí peptidy thymosinu usančně do tří skupin: thymosiny alfa a o pí v rozmezí hodnot 3,0 až 5,0, thymosiny beta opiv rozmezí hodnot 5,0 až 7,0 a basické thymosiny gama o hodnotách pí od 7,0 výše. Z terapeutického hlediska jsou nejcennější thymosiny alfa, jež jsou výrazně kyselé povahy.Thymosin fraction 5 is a complex of immunomodulatory peptides secreted by the thymus (thymus), which allow the maturation and differentiation of T lymphocytes into immunocompetent cells and are involved in the proper functioning of the immune system. This complex is prepared by extraction of frozen calf thymus and its composition is characterized by the purification and isolation steps used. According to the value of their isoelectric points pi, thymosin peptides fall into three groups: thymosins alpha and pi in the range of 3.0 to 5.0, thymosins beta opiv in the range of 5.0 to 7.0 and basic thymosins gamma with pi values from 7.0 above. From a therapeutic point of view, the most valuable are alpha thymosins, which are markedly acidic in nature.

Způsob přípravy thymosinu frakce 5 byl od roku 1972 postupně zdokonalován (A. L. Goldstein se sp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1800, 1972; J. A. Hooper se sp., Ann. N. Y. Acad. Sci. 249, 125, 1975) a spočívá v těchto základních operacích: 1. Extrakce brzlíkového homogenátu 0,15 M vodným roztokem chloridu sodného, 2. tepelná denaturace balastních bílkovin v extraktu, 3. delipidace extraktu, 4. vysolení dalších bílkovin síranem amonným při 25 % nasycení roztoku, 5. vysolení surového thymosinu dalším přídavkem síranu amonného do 50 % nasycení roztoku po úpravě pH na hodnotu 4,0, 6. ultrafiltrace thymosinu přes membránu s vylučovacím limitem 10 000, 7. odsolení gelovou filtrací a 8. lyofilizace. Pro průmyslové využití postupu bylo nutno dále vyřešit některé technologicky obtížné stupně. Podle čs. autorského osvědčení č. 250631 se např. tepelná denaturace provádí zahřátím celého objemu brzlíkového homogenátu a extrakt se oddělí od sražených bílkovin a brzlíkové tkáně filtrací za horka. Postupem podle čs. autorského osvědčení č. 264100 se výhodně odstraňují lipidy z teplého extraktu vytřepáním do octanu ethylnatého a dále se po ultrafiltraci roztoku surového thymosinu vysráží zahuštěním a okyselením ultrafiltrátu částečně odsolený thymosin, který se acetonem převede na'stabilní suchý meziprodukt.The process for the preparation of fraction 5 thymosin has been gradually improved since 1972 (AL Goldstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1800, 1972; JA Hooper et al., Ann. NY Acad. Sci. 249, 125, 1975) and consists of the following basic operations: 1. Extraction of thymus homogenate with 0,15 M aqueous sodium chloride solution, 2. thermal denaturation of ballast proteins in the extract, 3. delipidation of the extract, 4. salting of other proteins with ammonium sulphate at 25% saturation of the solution, 5. salting out the crude thymosin by further addition of ammonium sulphate to 50% saturation of the solution after adjusting the pH to 4.0, 6. ultrafiltration of thymosin through a membrane with an exclusion limit of 10,000, 7. desalting by gel filtration and 8. lyophilisation. For the industrial use of the process, it was necessary to further solve some technologically difficult stages. According to MS. of the author's certificate No. 250631, for example, thermal denaturation is performed by heating the entire volume of thymus homogenate and the extract is separated from the precipitated proteins and thymus tissue by hot filtration. In accordance with MS. U.S. Pat.

Dosud popsané postupy poskytují sice produkty se srovnatelnými obsahy thymosinových peptidů, avšak neumožňují kontrolu obsahu nukleotidů, kterých může být přítomno ve finální substanci až 10 %. Tyto štěpy nukleových kyselin mohou mít nežádoucí účinky jako látky lidskému organismu cizí (např. pyrogenní). Nelze je účinně odstranit ultrafiltraci ani gelovou filtrací, protože mají molekulovou hmotnost blízkou thymosinům (tj. 1 000 až 15 000).Although the methods described so far provide products with comparable contents of thymosin peptides, they do not allow control of the content of nucleotides, which may be present in the final substance up to 10%. These nucleic acid grafts can have side effects as substances foreign to the human body (eg pyrogenic). They cannot be effectively removed by ultrafiltration or gel filtration because they have a molecular weight close to thymosins (i.e. 1,000 to 15,000).

Uvedenou nevýhodu dosavadních postupů odstraňuje způsob čištění surového thymosinu, získaného vysolením brzlíkového extraktu síranem amonným, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se na surový thymosin ve vodném roztoku o hodnotě pH 3,0 až 5,0 působí středně basickým měničem aniontů s vázaným aniontem kyseliny o disociační konstantě menší než disociační konstanta kyseliny fosforečné a větší než disociační konstanta složek thymosinu frakce 5, načež se efluent zahustí a získaný koncentrát odsolí gelovou filtrací a lyofilizuje, přičemž konečný thymosin frakce 5 obsahuje nukleotidy v množství menším než 1 % hmot.The disadvantage of the prior art is eliminated by the process for purifying crude thymosin obtained by salifying thymus extract with ammonium sulphate, according to the invention, which consists in treating the crude thymosin in an aqueous solution of pH 3.0 to 5.0 with a medium-basic anion exchanger with a bound acid anion having a dissociation constant less than the phosphoric acid dissociation constant and greater than the dissociation constant of the fraction 5 thymosin components, after which the effluent is concentrated and the concentrate obtained is desalted by gel filtration and lyophilized.

Způsob podle vynálezu se výhodně provádí tak, že se pH roztoku * surového thymosinu upraví na hodnotu kolem 4,5 kyselinou octovou a že se dále měnič aniontů převede před sorpcí nukleotidů do octanového cyklu.The process according to the invention is preferably carried out by adjusting the pH of the crude thymosin solution to about 4.5 with acetic acid and by further converting the anion exchanger to the acetate cycle before the nucleotide sorption.

Způsob podle vynálezu se provádí tak, že se vodný roztok surového thymosinu okyselí na hodnotu pH 3,0 až 5,0, s výhodou 4,5 vhodnou alifatickou karboxylovoú kyselinou, nejlépe kyselinou octovou. Pak se roztok nechá reagovat vsádkovým způsobem nebo na koloně se středně basickým měničem aniontů, převedeným do octanového cyklu. Za těchto podmínek se nukleotidy váží na měnič aniontů prostřednictvím svých zbytků kyseliny fosforečné, které se vyskytují při uvedené hodnotě pH prostředí ve formě aniontů, zatímco disociace kyselých skupin thymosinů je potlačena a tím je zabráněno jejich sorpci na iontoměnič. Jako sorbent lze použít jakýkoliv měnič aniontů obsahující středně basické, např. diethylaminoethylové skupiny, jehož nosná kostra je chemicky . a mechanicky odolná a neobsahuje funkční skupiny ovlivňující nepříznivě strukturu peptidů. Dále je důležité, aby se kapacita iontoměniče nesnižovala postupně ireversibilními vazbami a bylo možno jej vícekrát regenerovat. Výhoda kyseliny octové jako vyměňovaného aniontů spočívá jednak v tom, že má vhodnou disociační konstantu pro odlišení thymosinů a fosfátových skupin nukleotidů a jednak v tom, že vytváří při iontové výměně z části průvodního síranu amonného těkavý octan amonný, odstranitelný při dalším zpracování thymosinu destilací nebo lyofilizací. Po zachycení nukleotidů a části síranových iontů na iontoměniči se oddělený supernatant nebo efluent z kolony zahustí destilací za sníženého tlaku na sirup, přičemž z roztoku vytéká většina vzniklého octanu amonného. Použitý měnič aniontů se obvyklým způsobem regeneruje nejprve převedením do OH“ cyklu 0,5 M roztokem hydroxidu sodného a posléze do octanového cyklu 5% roztokem kyseliny octové.The process according to the invention is carried out by acidifying an aqueous solution of crude thymosin to a pH of 3.0 to 5.0, preferably 4.5, with a suitable aliphatic carboxylic acid, most preferably acetic acid. The solution is then reacted in a batchwise manner or on a medium anion exchange column converted to an acetate cycle. Under these conditions, the nucleotides bind to the anion exchanger via their phosphoric acid residues, which occur at the pH of the medium in the form of anions, while the dissociation of the acidic groups of thymosins is suppressed, thus preventing their sorption on the ion exchanger. As the sorbent, any anion exchanger containing moderately basic, e.g. diethylaminoethyl, groups whose support backbone is chemically can be used. and mechanically resistant and does not contain functional groups adversely affecting the structure of the peptides. Furthermore, it is important that the capacity of the ion exchanger is not gradually reduced by irreversible bonds and that it can be regenerated several times. The advantage of acetic acid as an anion exchange is that it has a suitable dissociation constant to distinguish thymosins and phosphate groups of nucleotides and that it forms volatile ammonium acetate from ion exchange in part of the concomitant ammonium sulphate, which can be removed by further distillation or lyophilisation of thymosin. . After capturing the nucleotides and a portion of the sulfate ions on the ion exchanger, the separated supernatant or effluent from the column is concentrated by distillation under reduced pressure to a syrup, with most of the ammonium acetate formed flowing out of the solution. The anion exchanger used is regenerated in the usual way by first transferring it to the OH cycle with 0.5 M sodium hydroxide solution and then to the acetate cycle with 5% acetic acid solution.

Výhodou postupu podle vynálezu je snížení obsahu nežádoucích nukleotidů v thymosinu frakci 5 na hodnotu nižší než 1 % a též podstatné snížení obsahu síranu amonného v meziproduktu. Odstranění nukleotidů a části soli umožňuje zvýšit nanášku při následném odsolování gelovou filtrací a tím snížit potřebu drahého dextranového gelu. Další výhodou je možnost použití tuzemských měničů aniontů, vyráběných např. na basi perlové celulosy.The advantage of the process according to the invention is the reduction of the content of undesired nucleotides in thymosin fraction 5 to a value lower than 1% and also a substantial reduction of the content of ammonium sulphate in the intermediate. The removal of nucleotides and part of the salt makes it possible to increase the loading during the subsequent desalting by gel filtration and thus to reduce the need for an expensive dextran gel. Another advantage is the possibility of using domestic anion exchangers, manufactured for example on the basis of pearl cellulose.

V dalším je vynález blíže objasněn příkladem provedení, aniž by se jím omezoval.In the following, the invention is further elucidated by way of non-limiting example.

PříkladExample

Navážka 50,0 g surového thymosinu, obsahující 1,9 g peptidů thymosinu, 0,2 g štěpů nukleových kyselin (nukleotidů) a 47,9 g síranu amonného z předchozího vysolování, se rozpustí v 3 000 ml vody a pH roztoku se upraví koncentrovanou kyselinou octovou na hodnotu 4,5. K roztoku se přidá 1 500 g nabobtnalého měničeA portion of 50.0 g of crude thymosin, containing 1.9 g of thymosin peptides, 0.2 g of nucleic acid (nucleotide) grafts and 47.9 g of ammonium sulfate from the previous salting out, is dissolved in 3,000 ml of water and the pH of the solution is adjusted with concentrated acetic acid to 4.5. 1500 g of a swollen transducer are added to the solution

CS 277456 B6 * aniontů (např. Ostsorb DEAE), který byl převeden do octanového cyklu, a suspenze se míchá, po dobu 30 minut při teplotě do 20 °C. Poté se odsaje přes sintr G 3a vrstva iontoměniče se promyje 500 ml vody. Filtrát se zahustí destilací za sníženého tlaku při vnější teplotě do 50 °C a vnitřní teplotě do 30 °C na objem 100 ml. Tento koncentrát o hodnotě pH kolem 6,0 obsahuje 1,8 g peptidů thymosinu a neměřitelné množství nukleotidů. Analyticky stanovené množství NH₄ ⁺ iontů je kolem 3,62 g a SO₄ ²⁺ iontů kolem 2,0 g, což odpovídá obsahu 2,75 g síranu amonného a 12,28 g octanu amonného. Celkový obsah amonných solí počítaný jako síran je 13,27 g, což znamená, že 34,63 g z původního síranu amonného v navážce surového thymosinu vytékalo při vakuové destilaci ve formě octanu amonného. Koncentrát se použije přímo k úplnému odsolení thymosinu frakce 5 gelovou filtrací. Výtěžek thymosinu frakce 5 po lyofilizaci odsoleného roztoku je 1,8 g.CS 277456 B6 * anions (e.g. Ostsorb DEAE), which has been converted to an acetate cycle, and the suspension is stirred for 30 minutes at a temperature up to 20 ° C. It is then filtered off with suction through a sinter G 3a and the ion exchanger layer is washed with 500 ml of water. The filtrate is concentrated by distillation under reduced pressure at an external temperature of up to 50 ° C and an internal temperature of up to 30 ° C to a volume of 100 ml. This concentrate, with a pH of about 6.0, contains 1.8 g of thymosin peptides and an immeasurable amount of nucleotides. The analytically determined amount of NH ₄ ⁺ ions is about 3.62 g and SO ₄ ²⁺ ions are about 2.0 g, which corresponds to a content of 2.75 g of ammonium sulfate and 12.28 g of ammonium acetate. The total ammonium salt content, calculated as sulphate, is 13.27 g, which means that 34.63 g of the original ammonium sulphate in the crude thymosin batch flowed out in a vacuum distillation in the form of ammonium acetate. The concentrate is used directly to completely desalinate thymosin fraction 5 by gel filtration. The yield of thymosin fraction 5 after lyophilization of the desalted solution is 1.8 g.

Obsahy peptidů a nukleotidů se sledují během procesu diferenční spektrofotometrickou metodou v UV oblasti (Waddell W. J., J. of Laboratory Clin. Med. 48 , 311, 1956). Úbytek nukleotidů v roztoku během sorpce na iontoměnič lze rychle a velmi citlivě kontrolovat barevnou reakcí s difenylaminem (Dische Z. se sp., Mikrochim. Acta 2, 13, 1937).Peptide and nucleotide contents are monitored during the process by differential spectrophotometric method in the UV region (Waddell W. J., J. of Laboratory Clin. Med. 48, 311, 1956). The loss of nucleotides in solution during sorption on an ion exchanger can be rapidly and very sensitively controlled by a color reaction with diphenylamine (Dische Z. et al., Mikrochim. Acta 2, 13, 1937).

’ Regenerace iontoměniče: odsátý a vodou promytý měnič aniontů (Ostsorb DEAE) o výměnné kapacitě 1,1 mval/g a hmotnosti 1 500 g se míchá s objemem 2x po 1 500 ml 0,5 M roztoku hydroxidu sodného vždy po dobu 30 minut. Po každém míchání se suspenze odsaje na sintru G 3. Tímto postupem se odstraní nukleotidy a síranové ionty. Iontoměnič, převedený takto do OH“ cyklu, se promyje vodou a poté převede do octanového cyklu opakovaným rozmícháním 2x s 1 500 ml 5%'roztoku kyseliny octové, vždy po dobu 30 minut. Po odsátí je iontoměnič použitelný bez promývání vodou k další rafinaci surového thymosinu.’Regeneration of the ion exchanger: an aspirated and water-washed anion exchanger (Ostsorb DEAE) with an exchange capacity of 1.1 mval / g and a weight of 1,500 g is mixed with a volume of 2 x 1,500 ml of 0.5 M sodium hydroxide solution for 30 minutes each. After each stirring, the suspension is filtered off with suction onto sinter G 3. This procedure removes nucleotides and sulfate ions. The ion exchanger, thus converted into an OH cycle, is washed with water and then transferred to the acetate cycle by repeatedly mixing twice with 1500 ml of 5% acetic acid solution, each time for 30 minutes. After aspiration, the ion exchanger can be used without washing with water for further refining of crude thymosin.

Claims

PATENT CLAIMS

A process for the purification of crude thymosin obtained by salting out a brilliant extract with ammonium sulphate, characterized in that the crude thymosin in an aqueous solution of pH 3.0 to 5.0 is treated with a medium-basic anion exchanger with a bound acid anion of dissociation constant less than dissociation constant of phosphoric acid and greater than the dissociation constant of the thymosin components of fraction 5, after which the effluent is concentrated and the obtained concentrate is desalted by gel filtration and lyophilized.

2. The process according to claim 1, characterized in that the crude thymosin solution is adjusted to a pH of 3 to 5, preferably 4.5, with acetic acid.

3. The method of claim 1, wherein the anion exchanger is converted to an acetate cycle prior to nucleotide sorption.