CS277456B6 - Způsob čištění surového thymosinu - Google Patents

Abstract

Řešení se.týká způsobu čištění surového thymosinu, získaného vysolením brzlíkového extraktu síranem amonným a spočívá v tom, že se na surový thymosin ve vodném roztoku o hodnotě pH 3,0 až 5,0 působí středně basickým měničem aniontů s vázaným aniontem kyseliny o disociační konstantě menší než disociační konstanta kyseliny fosforečné a větší než disociační konstanta složek thymosinu. Efluent z iontoměniče se po zahuštění odsolí gelovou filtrací a lyofilizuje, přičemž získaný thymosin frakce 5 obsahuje méně než 1 % hmot.štěpů nukleových 'CO kyselin (nukleotidů). Zvláště výhodnéJe použít k iyfc iontové výměně kyseliny octové, která vytváří z -W části síranu amonného těkavý octan amonný. Jeho odstraněním při zahuštění eíluentu se w sníží potřeba gelu pro odsolování thymosinu 10 frakce 5. Thymosin frakce 5 se používá k léčbě poruch imunitního systému.

Description

Vynález se týká způsobu odstraňování nežádoucích štěpů nukleových kyselin (nukleotidů) ze surového thymosinu, který se získává z telecích brzlíků jako meziprodukt při výrobě thymosinu frakce 5. K odstranění nukleotidů slouží středně basický měnič aniontů za podmínek, při nichž se na iontoměnič nezachycují žádané složky thymosinu frakce 5. .

Thymosin frakce 5 je komplex imunomodulačních peptidů, vylučovaných brzlíkem (thymem), které umožňují dozrávání a diferenciaci T lymfocytů v imunokompetentní buňky á podílejí se na správné funkci imunitního systému. Tento komplex se připravuje extrakcí zmražených telecích brzlíků a jeho složení je charakterizováno použitými čistícími a izolačními stupni. Podle hodnoty svých isoelektrických bodů pí se řadí peptidy thymosinu usančně do tří skupin: thymosiny alfa a o pí v rozmezí hodnot 3,0 až 5,0, thymosiny beta opiv rozmezí hodnot 5,0 až 7,0 a basické thymosiny gama o hodnotách pí od 7,0 výše. Z terapeutického hlediska jsou nejcennější thymosiny alfa, jež jsou výrazně kyselé povahy.

Způsob přípravy thymosinu frakce 5 byl od roku 1972 postupně zdokonalován (A. L. Goldstein se sp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1800, 1972; J. A. Hooper se sp., Ann. N. Y. Acad. Sci. 249, 125, 1975) a spočívá v těchto základních operacích: 1. Extrakce brzlíkového homogenátu 0,15 M vodným roztokem chloridu sodného, 2. tepelná denaturace balastních bílkovin v extraktu, 3. delipidace extraktu, 4. vysolení dalších bílkovin síranem amonným při 25 % nasycení roztoku, 5. vysolení surového thymosinu dalším přídavkem síranu amonného do 50 % nasycení roztoku po úpravě pH na hodnotu 4,0, 6. ultrafiltrace thymosinu přes membránu s vylučovacím limitem 10 000, 7. odsolení gelovou filtrací a 8. lyofilizace. Pro průmyslové využití postupu bylo nutno dále vyřešit některé technologicky obtížné stupně. Podle čs. autorského osvědčení č. 250631 se např. tepelná denaturace provádí zahřátím celého objemu brzlíkového homogenátu a extrakt se oddělí od sražených bílkovin a brzlíkové tkáně filtrací za horka. Postupem podle čs. autorského osvědčení č. 264100 se výhodně odstraňují lipidy z teplého extraktu vytřepáním do octanu ethylnatého a dále se po ultrafiltraci roztoku surového thymosinu vysráží zahuštěním a okyselením ultrafiltrátu částečně odsolený thymosin, který se acetonem převede na'stabilní suchý meziprodukt.

Dosud popsané postupy poskytují sice produkty se srovnatelnými obsahy thymosinových peptidů, avšak neumožňují kontrolu obsahu nukleotidů, kterých může být přítomno ve finální substanci až 10 %. Tyto štěpy nukleových kyselin mohou mít nežádoucí účinky jako látky lidskému organismu cizí (např. pyrogenní). Nelze je účinně odstranit ultrafiltraci ani gelovou filtrací, protože mají molekulovou hmotnost blízkou thymosinům (tj. 1 000 až 15 000).

Uvedenou nevýhodu dosavadních postupů odstraňuje způsob čištění surového thymosinu, získaného vysolením brzlíkového extraktu síranem amonným, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se na surový thymosin ve vodném roztoku o hodnotě pH 3,0 až 5,0 působí středně basickým měničem aniontů s vázaným aniontem kyseliny o disociační konstantě menší než disociační konstanta kyseliny fosforečné a větší než disociační konstanta složek thymosinu frakce 5, načež se efluent zahustí a získaný koncentrát odsolí gelovou filtrací a lyofilizuje, přičemž konečný thymosin frakce 5 obsahuje nukleotidy v množství menším než 1 % hmot.

Způsob podle vynálezu se výhodně provádí tak, že se pH roztoku * surového thymosinu upraví na hodnotu kolem 4,5 kyselinou octovou a že se dále měnič aniontů převede před sorpcí nukleotidů do octanového cyklu.

Způsob podle vynálezu se provádí tak, že se vodný roztok surového thymosinu okyselí na hodnotu pH 3,0 až 5,0, s výhodou 4,5 vhodnou alifatickou karboxylovoú kyselinou, nejlépe kyselinou octovou. Pak se roztok nechá reagovat vsádkovým způsobem nebo na koloně se středně basickým měničem aniontů, převedeným do octanového cyklu. Za těchto podmínek se nukleotidy váží na měnič aniontů prostřednictvím svých zbytků kyseliny fosforečné, které se vyskytují při uvedené hodnotě pH prostředí ve formě aniontů, zatímco disociace kyselých skupin thymosinů je potlačena a tím je zabráněno jejich sorpci na iontoměnič. Jako sorbent lze použít jakýkoliv měnič aniontů obsahující středně basické, např. diethylaminoethylové skupiny, jehož nosná kostra je chemicky . a mechanicky odolná a neobsahuje funkční skupiny ovlivňující nepříznivě strukturu peptidů. Dále je důležité, aby se kapacita iontoměniče nesnižovala postupně ireversibilními vazbami a bylo možno jej vícekrát regenerovat. Výhoda kyseliny octové jako vyměňovaného aniontů spočívá jednak v tom, že má vhodnou disociační konstantu pro odlišení thymosinů a fosfátových skupin nukleotidů a jednak v tom, že vytváří při iontové výměně z části průvodního síranu amonného těkavý octan amonný, odstranitelný při dalším zpracování thymosinu destilací nebo lyofilizací. Po zachycení nukleotidů a části síranových iontů na iontoměniči se oddělený supernatant nebo efluent z kolony zahustí destilací za sníženého tlaku na sirup, přičemž z roztoku vytéká většina vzniklého octanu amonného. Použitý měnič aniontů se obvyklým způsobem regeneruje nejprve převedením do OH“ cyklu 0,5 M roztokem hydroxidu sodného a posléze do octanového cyklu 5% roztokem kyseliny octové.

Výhodou postupu podle vynálezu je snížení obsahu nežádoucích nukleotidů v thymosinu frakci 5 na hodnotu nižší než 1 % a též podstatné snížení obsahu síranu amonného v meziproduktu. Odstranění nukleotidů a části soli umožňuje zvýšit nanášku při následném odsolování gelovou filtrací a tím snížit potřebu drahého dextranového gelu. Další výhodou je možnost použití tuzemských měničů aniontů, vyráběných např. na basi perlové celulosy.

V dalším je vynález blíže objasněn příkladem provedení, aniž by se jím omezoval.

Příklad

Navážka 50,0 g surového thymosinu, obsahující 1,9 g peptidů thymosinu, 0,2 g štěpů nukleových kyselin (nukleotidů) a 47,9 g síranu amonného z předchozího vysolování, se rozpustí v 3 000 ml vody a pH roztoku se upraví koncentrovanou kyselinou octovou na hodnotu 4,5. K roztoku se přidá 1 500 g nabobtnalého měniče

CS 277456 B6 * aniontů (např. Ostsorb DEAE), který byl převeden do octanového cyklu, a suspenze se míchá, po dobu 30 minut při teplotě do 20 °C. Poté se odsaje přes sintr G 3a vrstva iontoměniče se promyje 500 ml vody. Filtrát se zahustí destilací za sníženého tlaku při vnější teplotě do 50 °C a vnitřní teplotě do 30 °C na objem 100 ml. Tento koncentrát o hodnotě pH kolem 6,0 obsahuje 1,8 g peptidů thymosinu a neměřitelné množství nukleotidů. Analyticky stanovené množství NH₄ ⁺ iontů je kolem 3,62 g a SO₄ ²⁺ iontů kolem 2,0 g, což odpovídá obsahu 2,75 g síranu amonného a 12,28 g octanu amonného. Celkový obsah amonných solí počítaný jako síran je 13,27 g, což znamená, že 34,63 g z původního síranu amonného v navážce surového thymosinu vytékalo při vakuové destilaci ve formě octanu amonného. Koncentrát se použije přímo k úplnému odsolení thymosinu frakce 5 gelovou filtrací. Výtěžek thymosinu frakce 5 po lyofilizaci odsoleného roztoku je 1,8 g.

Obsahy peptidů a nukleotidů se sledují během procesu diferenční spektrofotometrickou metodou v UV oblasti (Waddell W. J., J. of Laboratory Clin. Med. 48 , 311, 1956). Úbytek nukleotidů v roztoku během sorpce na iontoměnič lze rychle a velmi citlivě kontrolovat barevnou reakcí s difenylaminem (Dische Z. se sp., Mikrochim. Acta 2, 13, 1937).

’ Regenerace iontoměniče: odsátý a vodou promytý měnič aniontů (Ostsorb DEAE) o výměnné kapacitě 1,1 mval/g a hmotnosti 1 500 g se míchá s objemem 2x po 1 500 ml 0,5 M roztoku hydroxidu sodného vždy po dobu 30 minut. Po každém míchání se suspenze odsaje na sintru G 3. Tímto postupem se odstraní nukleotidy a síranové ionty. Iontoměnič, převedený takto do OH“ cyklu, se promyje vodou a poté převede do octanového cyklu opakovaným rozmícháním 2x s 1 500 ml 5%'roztoku kyseliny octové, vždy po dobu 30 minut. Po odsátí je iontoměnič použitelný bez promývání vodou k další rafinaci surového thymosinu.

Claims (3)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob čištění surového thymosinu, získaného vysolením bržilkového extraktu síranem amonným, vyznačující se tím, že se na surový thymosin ve vodném roztoku o hodnotě pH 3,0 až 5,0 působí středně basickým měničem aniontů s vázaným aniontem kyseliny o disociační konstantě menší než disociační konstanta kyseliny fosforečné a větší než disociační konstanta složek thymosinu frakce 5, načež se efluent zahustí a získaný koncentrát odsolí gelovou filtrací a lyofilizuje.
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se roztok surového thymosinu upraví na hodnotu pH 3 až 5, s výhodou 4,5, kyselinou octovou.
3. 3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se měnič aniontů před sorpcí nukleotidů převede do octanového cyklu.