CS49992A3 - Process of recombinant proteins activation - Google Patents
Process of recombinant proteins activation Download PDFInfo
- Publication number
- CS49992A3 CS49992A3 CS92499A CS49992A CS49992A3 CS 49992 A3 CS49992 A3 CS 49992A3 CS 92499 A CS92499 A CS 92499A CS 49992 A CS49992 A CS 49992A CS 49992 A3 CS49992 A3 CS 49992A3
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- pro
- chain
- met
- arg
- glu
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 19
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 19
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 9
- 230000004913 activation Effects 0.000 title description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 39
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 37
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 15
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 15
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 13
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 13
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 12
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 7
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 claims description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 5
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 claims description 5
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 claims description 5
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- ADHNYKZHPOEULM-BQBZGAKWSA-N Met-Glu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O ADHNYKZHPOEULM-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 3
- 108010056582 methionylglutamic acid Proteins 0.000 claims description 3
- 230000007704 transition Effects 0.000 claims description 3
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 claims description 2
- 108010002231 IgA-specific serine endopeptidase Proteins 0.000 claims description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 claims 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 abstract description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 31
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 29
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 10
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical class [H]N([H])* 0.000 description 5
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 5
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 5
- KWTQSFXGGICVPE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.OC(=O)C(N)CCCN=C(N)N KWTQSFXGGICVPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 229940049906 glutamate Drugs 0.000 description 4
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 3
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000012454 non-polar solvent Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- -1 lysine amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000011537 solubilization buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 101150118523 LYS4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000005497 microtitration Methods 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 230000000541 pulsatile effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
- C07K1/08—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using activating agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Dental Preparations (AREA)
- Manufacture Of Macromolecular Shaped Articles (AREA)
Description
- 1 -
Způsob aktivace-rekombinantních bil h. «
O
—
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu aktivace rekombinantních bílkovin,zejména aktivace rekombinantních bílkovin z prokaryotickýchorganismů. - '
Dosavadní stav techniky Při expresi rekombinantních bílkovin v prokaryotickýchorganismech vznikají bílkoviny v produkční buňce často jakoalespň Částečně neaktivní, nesnadno rozpustné agregáty (re-fraktilní tělíska, inklusní tělíska, IB), které jsou mimotoještě znečištěny bílkovinami produkční buňky. Než je možnotakové bílkoviny použít například k léčebným nebo diagnos-tickým účelům, je nutno je převést na aktivní formy.
Způsoby renaturace rekombinantních bílkovin jsou obecněznámé a byly popsány například v evropském patentovém spisuč. 114 506 a 241 022, ve W0 86/00610 a 84/03711 a v US paten-tovém spisu č. 4 530 787..Při provádění těchto známých postupůse však dosahují často při aktivaci přírodních řetězců bílkovinnízké výtěžky. Vynález si proto klade za úkol navrhnout postup,při němž by bylo možno dosáhnout zvýšení výtěžků při renatura-ci rekombinantních bílkovin. Zásadní možnost může spočívat na-příklad ve změně podmínek při renaturaci. Této možnosti všaknebylo při vypracování způsobu podle vynálezu použito.
Podstata vynálezu
Podstata vynálezu spočívá v překvapujícím zjištění, že se výtěžek bílkoviny při její renaturaci zvýší v případě, že se na její N- a/nebo C-terminální zakončení naváže ještě dal- ší pomocný řetězec. - 2 -
Podstatou vynálezu je tedy způsob aktivace rekombinant-ních bílkovin, zvláště rekombinantních bílkovin z prokaryo-tických organismů, které se nacházejí alespoň z části v ne-aktivní formě, postup spočívá v tom, že se aktivuje solubi-lisačním a/nebo renaturačním způsobem bílkovina, která obsa-huje na svém N- a/nebo C-terminálním zakončení ještě pomocnýřetězec o 2 až 50 aminokyselinách, přičemž relativní hydro-fobnost těchto pomocných řetězců, vypočtené jako součet uve-dené relativní hydrofobnosti v tabulce 1 pro jednotlivé amino-kyseliny má zápornou hodnotu.
Pod pojmem "relativní hydrofobnost" se ve smyslu vynálezurozumí údaje, tak jak byly vysvětleny v publikacích T. E.Creightonh(1983), Protěins, Structure and MOlecular Prin-ciples, W. H. Freeman ,a Company, New York, str. 142, tabulka4,4, G. von Heijne a C. Blomberg ¢1979), Eur. J. 8iochem. 95,175 - 181 a Y. Nozaki a C. Tanford (1971), 3. Biol. Chem. 246, 2211 - 2217. Stanovení hodnot pro relativní hydrofob-nost aminokyseliny se provádí například podle Nozakiho aTanforda zjištění rovnovážného stavu při dělení těchto amino-kyselin mezi nepolární rozpouštědla, například směs ethanolua dioxanu a mezi vodu. Relativní hydrofobnost je hodnota proenergii a uvádí se v kcal/mol. Kladná hodnota pro relativníhydrofobnost znamená, že se látka přednostně rozpouští v ne-polárních rozpouštědlech, což znamená, že jde o nepolárníaminokyselinu. V případě, že relativní hydrofobnost má hod-notu, která je ?<nižší než 0, jde o polární aminokyselinu,která se přednostně rozpouští ve vodě při srovnání s nepo-lárními rozpouštědly. V případě takových aminokyselin se připřechodu například z ethanolu do vody uvolní energie. V následující tabulce jsou shrnuty hodnoty pro relativníhydrofobnost jednotlivých aminokyselin. 3
Tabulka 1 aminokyselina relativní hydrofobnost (kcal/moi)
Gly 0 Leu 1,8 Ile . *2,5 Val 1,5 Ala 0,5 Phe 2,5 Cys -2,8 Met 1,3 Thr 0,4 Ser -0,3 Trp 3,4 Tyr 2,3 Gin -0,3 Lys -4,2 Asn -0,2 Glu -9,9 His 0,5 Asp -7,4 Arg -11,2 Pro -3,3 Z tabulky je zřejmé, že aminokyseliny cystein, prolin azvláště glutamát, aspartát, arginin a lysin jsou silně nega-tivně relativně hydrofobní.
Neočekávaně bylo zjištěno, že připojením pomocného řetězce s délkou 2 až 50 aminokyselin k řetězci bílkoviny je možnopodstatně zlepšit aktivaci rekombinantní bílkoviny v případě,že tento pomocný řetězec má ve svém součtu negativní hodnotupro relativní hydrofobnost. Výhodná délka pomocného řetězceje 2 až 20 a zvláště 5 až 20 aminokyselin. 4 Dále je výhodné, aby pro tyto pomocné řetězce-měl kvocient relativní hydrofobnosti a počtu aminokyselin hodnotu -2,0 kcal/mol nebo nižší, zvláště -2,5 kcal/mol nebo nižší, nejvýhodnější hodnota je -2,8 kcal/mol nebo nižší.
Navázání pomocného řetězce na rekombinantní bílkovinuje možno uskutečnit postupem, běžným v oboru molekulárníbiologie. Postupuje se s výhodou tak, že se na jedno nebona obě zakončení kódového řetězce DNA pro rekombinantníbílkovinu, k jejíž expresi má dojít naváže oligonukleoti-dový řetězec, který je kódem7 pro svrchu popsaný pomocnýřetězec s celkovou zápornou hodnotou pro relativní hydro-fobnost. K tomuto účelu se například z genu, k jehož expre-si má dojít izolují fragmenty DNA, které obsahují oblast,která je kódem pro začátek nebo pro konec odpovídajícíhogenu. Oo těchto fragmentů ONA je pak možno například připoužití jiných míst štěpení restrikčními enzymy přidatssyn-tetické oligonukleotidy, obsahující kódovou oblast pro po-mocné řetězce. Další možnost spočívá v tom^ nahradit přírodní fragmenty ONA v genu úplně oligonukleotidovými řetězci.Tímto způsobem je možno získat modifikované řetězce DNA,které kromě nutné informace pro rekombinantní bílkovinyobsahují ještě informaci pro přídatné pomocné řetězce.
Jako řetězce DNA, které jsou kódem pro pomocné řetěz-ce na N-terminálním zakončení, se s výhodou užijí takovéřetězce ONA, jejichž kodony jsou upraveny tak, aby odpoví-daly kodonům, obvyklým v organismu, v němž má dojít k ex-presi, jak bylo vysvětleno v publikaci E. L. Uinnacker,
Gene und Klone, Verlag Chemie, 1985, 224 - 241.
Pro Escherichia coli jako organismus, v němž má dojítk expresi, se z tohoto důvodu pro následnující aminokyseli-ny s výhodou užijí uvedené kodony: 5
Threonin ACAProlin CCALeucin CTALysin AAAAlanin GCC kyselina glutamová GAA. DNA, modifikovaná způsobem, který je kódem pro rekombi-nantní bílkovinu s připojeným pomocným řetězcem se uloží po-mocí transformace do produkční buňky, s výhodou do prokaryo-tické buňky a zvláště do buňky E. coli. PaW«se takto trans-formované buňky pěstují ve vhodném prostředí, získané buňkyse rozruší a rekombinantní bílkovina v alespoň částečně in-aktivním stavu se izoluje, obvykle se taková bílkovina na-chází v buňce ve formě inklusních tělísek. Nakonec se pro-vede solubilisace a renaturace takové bílkoviny, s výhodou -při pH, při němž může bílkovina zaujmout nativní formu. -Tyto stupně je možno provádět pomocí známých postupů, takjak byly uvedeny například ve svrchu uvedených publikacíchpři popisu známého stavu techniky. Aktivace bílkoviny seprovádí s výhodou například renaturací pomocí pulsů, takjak byl tento postup popsán například v evropském patento-vém spisu č. 241 022. Zlepšení, kterého je možno dosáhnoutzpůsobem podle vynálezu oproti známým postupům spočívá ze-jména v přítomnosti pomocných řetězců, předběžně navázanýchna N- a/nebo C-terminální zakončení rekombinantní bílkoviny.Pomocné řetězce se s výhodou připojují na N-terminální zakon-čení bílkoviny, která má být aktivována. Navázání pomocnéhořetězce na C-terminální zakončení však také vede k positiv-ním výsledkům. Z pomocných řetězců jsou výhodné takové řetězce, kteréobsahují alespoň dvě aminokyseliny ze skupiny glutamát, as-partát, lysin, arginin a prolin, přičemž lysinové a glutamá-tové zbytky jsou zvláště výhodné a nejvýhodnější je glutamá-tový zbytek. Dále je zvláště výhodné použít pomocný řetězec, 6 v němž po sobě následují dva ze svrchu uvedených zbytkůaminokyselin, to oznámená zbytek glutamátu, aspartátu,lysinu a argininu s obdobným nábojem, s výhodou v řetěz-ci po sobě následují dva zbytky lysinu nebo glutamátovézbytky, nejvýhadnějsi je použít dvou po sobě následujícíchglutamátových. zbytků.
Pro pozdější léčebné použití rekombinantních bílkovin,získaných způsobem podle vynálezu je výhodné, aby se místoštěpení nacházelo na přechodu mezi pomocným řetězcem a po-žadovanou bílkovinou. V případě, že se postupuje tímto způ-sobem, je možno získat přírodní řetězec aminokyselin poža-dované bílkoviny. Místem štěpení může být řetězec, rozpo-znávaný proteázou nebo chemickým reakčním činidlem pro ště-pení bílkovin, například bromkyanem, nejvýhodnější je místoštěpení pro proteázu. Zvláště výhodné je použít místo štěpenípro IgA-proteázu, tak jak to bylo popsáno ve WQ 91/11520.Přesné podmínky štěpení jsou v uvedeném spisu rovněž po-psány. Oále je výhodné také použití štěpného místa, kteréje štěpným místem pro faktor Xa.
Takové štěpné místo v řetězci bílkovin není při použitírekombinantní bílkoviny pro analytické účely nezbytné. Oále konkrétní příklady pomocných řetězců, které jsouvhodné pro zlepšení aktivace uvedených bílkovin budou dáleuvedeny pro N-terminální zakončení takové bílkoviny.
Met-Glu (řetězec 1)
Met-Thr-Pro-Leu-Pro-Arg-Pro-Pro (řetězec 2)
Met-Thr-Pro-Leu-His-His-Pro-Arg-Pro-Pro (řetězec 3)
Met-Thr-Pro-Leu-Lys-Lys-Pro-Arg-Pro-Pro (řetězec 4)
Met-Thr-Pro-Leu-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Pro-Pro (řetězec 5)
Met-Thr-Pro-Leu-Glu-Glu-Gly-Thr-Pro-Leu-Pro-Arg-Pro-Pro-(řetězec á) 7
Met-Thr-Pro-leu-Glu-Glu-Gln-Pro-Pro (řetězec 7)
Met-Lys-Ala-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-His-Pro-Arg-Pro-Pro' (řetězec 8)
Met-Thr-Pro-Leu-Glu-Glu-Gly-Ile-Glu-Gly-Arg (řetězec 9)
Met-Thr-Pro-Leu-Lys-Ala-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-His-Pro-Arg-Pro-Pro(řetězec 10).
Pomocné řetězce 5, 6, 7 a 9, které obsahují dva po soběnásledující glutamátové zbytky, poskytují nejvyšší výtěžkypři renaturaci bílkoviny a jsou proto nejvýhodnější.
Způsob podle vynálezu je vhodný zejména pro použitík á^ivaci rekombinantních bílkovin lidského původu a jejichderivátů, které byly vyprodukovány v prokaryotických orga-nismech, může jít například o aktivátory plasminogenu, in- ....terferony, interleukiny a o faktory, stimulující tvorbu ko-;lonií granulocytů. Zvláště výhodný je postup, při němž jebílkovinou, která má být aktivována faktor, stimulující tvor-bu kolonií granulocytů G-CSF, který obsahuje na začátku ře-..těžce své ONA řetězec ACACCA. Stejně výhodné jsou také deri-váty G-CSF, které jsou uvedeny v evropském patentovém spisu...č. 456 200.
Vektor pKK177-3-G-CSF 8g byl uložen 20. března 1990do veřejné sbírky Deutsche Sammlung fiir Mikroorganismen,Grisebachstr. 8, 0-3400 Gottingen pod číslem OSM 5867.
Vynález bude dále osvětlen v souvislosti s přiloženýmivýkresy.
Popis výkresů
Na obr. 1 je znázorněna závislost koncentrace při rena-turaci (koncentrace argininu 0,2 mol/1) pro konstrukce, je-jichž řetězec je analogický řetězci 0 z tabulky 2 (křivka 1),řetězci 3 (křivka 2), řetězci 5 (křivka 3) a řetězci 0 (křiv-ka 40. 8
Na obr. 2 je znázorněna závislost koncentrace při re- naturaci (koncentrace argininu 0,8 mol/1) pro konstrukce, které obsahují řetězce, analogické řetězci 0 z tabulky 2 (křivka 1), řetězci 3 (křivka 2), řetězci 5 (křivka 3) a řetězci 3 (křivka 4).
Na obr. 3 je znázorněna závislost výtěžku renaturacena koncentraci argininu, označení křivek je stejné jako naobr. 1 a 2.
Na obr. 4 jsou znázorněny výtěžky reaktivace v závislos-ti na době inkubace (koncentrace argininu 0,2 mol/1, označe-ní křivek je stejné jako na obr. 1 a 2).
Praktické provedení způsobu podle vynálezu bude osvět-leno následujícími příklady. Příklad 1
Konstrukce vektorů
Vektor pKK177-3 G-CSF Bg, OSM 5867 se rozštěpí parciálněenzymem^EcoBI a enzymem Apal a do vzniklého linearizovanéhofragmentu vektoru o velikosti přibližně 3450 párů baží seuloží oligonukleotid
EcoRI Apal
AATTCGGAGGAAAAATTA|ATG ........ IACACCACTGGGCC
I I
|Met ........ | G-CSF-řetězec bez ATG AATTCGGAGGAAAAATTA: řetězec 11 ACACCACTGGGCC: řetězec 12. 9 ... Vložený řetězec DNA zodpovídá genetickému kódu pro amino-kyseliny, uvedené v tabulce 2, to znamená například pro kon-strukci 3 se užije oligonukleotid s genetickým kódem.pro ře-tězec Met-Thr-Bro-Leu-Pro-Arg-Pro-Pro (řetězec 3). Plasmid/který vzniká navázáním oligonukleotidu do rozštěpeného vek-toru se užije k transformaci E. coli HB1O1. Aby bylo možnodosáhnout lepší regulovatelnosti tac-promotoru, transformujíse buňky navíc pomocí plasmidu pBPOlO, který se získá podleevropské patentové'přihlášky č. 91 111 155.7, jde o kompa-tibilní plasmid, který obsahuje gen lacl^. Tento gen je voboru jiá dlouho znám a je možno jej snadno získat. Jakokompatibilní plasmidy k plasmidu pBPOlO je možno užít plas-mid pACYC 177, OSM 3693P, v němž je uložen gen lacl^ nebood něj odvozené plasmidy, tak jak byly popsány v publikaciGene 85, 1909, 109 - 114 a v evropském patentovém spisu č. 373 365. Výsledné klony se podrobí selekci na prostředí,které obsahuje 50 mikrogramů/ml kanamycinu a 50 mikrogramů/mlampicilinu, identifikace se provádí pomocí analýzy restrikční-mi enzymy. Při rozštěpení enzymy EcoRX a RCORV se získají frag-menty oidélce 3,15 kb, přibližně 0,3 kb v závislosti na jednot- s livých konstrukcích a 4,35 kb. Příklad 2 a) Fermentace
Klony, které byly podle příkladu 1 identifikovány jakopozitivní se inkubují v 5 ml prostředí LB s kanamycinem aampicilinem, jak bylo uvedeno v příkladu 1, až do hustotyQD^g 0,5, pak se provádí indukce při použití IPTG v koncen-traci 5 mmol/1, načež se klony inkubují ještě 3 hodiny přiteplotě 37 °C. 10 00 takto indukované kultury se odebere apřipraví se extrakt celých buněk. Tento extrakt se podrobíanalýze na gelu SDS-Page. 10 V případě, že se prokáže, že došlo k expresi požadova-ného· produktu, opakuje se kultura v měřítku 1 litr a zevšech buněk se připraví preparát, obsahující inklusní tělís-ka 18. b) Příprava 10
Buňky se oddělí odstředěním, uvedou se do suspenze ve100 ml tris-pufru s obsahem hořčíku, který obsahuje 10 mmol/1tria o pH 8,0 s obsahem 1 mmol/1 chloridu hořečnatého a pakse buňky rozruší přidáním lysozymu 0,3 mg/ml.
Směs se inkubuje 15 uminut při .teplotě 37 °C a pak seužije tlaku 3,4 MPa. Pak se materiál Štěpí přidáním 2 mg DNA-ázy I 30 minut při teplotě 37 °C.
Pak se přidá 20 ml. chloridu sodného. 0,5 mol/1,. s obsa-hem 20 mmol/1 EDTA o pH 8,0 a 3 ml 20¾ Triton X 100 a směsse inkubuje 10 minut při teplotě místnosti.
Pak se suspenze odstředí 10 minut při 15000 ot/min ateplotě: 4 °C. Usazenina se uvede do suspenze ve 30 ml50 mmol/1 Tris o pH 8,0 s obsahem 50 mmol/1 EDTA a 0,5 %Triton X 100 a suspenze se zpracuje působením ultrazvuku.
Pak se suspenze odstředí, materiál se znovu uvede do susí-penze’á 'znovu žpračůjě ultrazvukem. Tento postup se ještědvakrát opakuje. Nakonec se materiál odstředí a získáná-íusazenina se užije jako inkluzní tělíska v příkladu 3. Příklad 3
Solubilizace/renaturace 11 a) Solubilizace
SolubilizaČní pufr: 6 mol/1 guanidinhydrochloridu, 0,1 mol/1 tris-pufru o pH 8,0,i mmol/1 EDTA, 100 mmol/1 OTE (dithioerythritol).
Oialyzační pufr 1: 6 mol/1 guanidinhydrochloridu, 3 mmol/1 EDTA o pH 3,0. 1 g inkluzních tělísek se přidá ke 30 ml solubilizač-ního pufru, směs se 5 minut homogenizuje pomocí ultrazvukua pak se 1 hodinu inkubuje při teplotě místnosti. Přidá sekyselina chlorovodíková do pH 3,0. Pak se nerozpustný ma- -teriál oddělí odstředěním. Výsledný materiál se pak dialyzuje proti dialyzačnímupufru 1 tak dlouho, až se OTE odstraní na hodnotu 1 mmol/1 'nebo nižší. b) Reaktivace pomocí pulsů
Renaturační pufr: 0,8 mol/1 argininhydrochloridu, 0,1 mol/1 tris-pufru a pH 8,0, 0,5 mmol/1 GSH, 0,5 mmol/1 GSSG, 1 mmol/1 EDTA, -12
Dialyzační pufr 2 10 mmol/1 tris-pufru o pH 8,0, 1 mmol/1 EOTA.
Reaktivace pomocí pulsů se provádí způsobem podleevropského patentového spisu č. 241 022. Užije se zařízení,které je znázorněno na obr. 5 uvedeného evropského patento-vého spisu. Bílkovina se přidává v intervalech 30 minut do reakční-ho objemu 100 ml renaturačniho pufru tak, aby se koncentra-ce bílkoviny v reakčním objemu v jjednom pulsu zvýšila o50 mikrogramů/ml. Celkem se provede 20 pulsů, konečná kon-centrace je 1 mg/ml reakčního objemu.
Po reaktivaci se z reakční směsi odstraní zákal od- m Írí středěním a materiál se dialyzuje proti dialyzačnímu pufru 2 až do snížení obsahu argininu na hodnotu 50 mmol/1 nebonižší. Zkoušky se provádějí s výhodod-jměřením vodivosti ma-teriálu. Dialýzu je možno ukončit, jakmile je vodivost dia-lyzačního pufru a reakční směsi stejná. Výtěžek reaktivacepro jednotlivé konstrukce, stanovený testem na účinnosttjeuveden v následující tabulce 2. tn ui I-K <+ CD 01 o r+ □ < ra< o □ N < OX o CD < CD □ 01 □ o h·1 N H* 1 X XJ O 0X X- c Γ+ o tn* X X 0) C_i* □ tn o c c < 3 01 OX c. N rt* OX ►- □ □ ·< 3 □ □ tn 01 «+ »1< a CD 1 rt· o tn N CO m O Ό o o CL 1 X- o tn CD -η Ό rx cr HS co X N H< 01 a. 1 c í+ to rj 3 H* □ 0X h-1 □ Ι-Λ σ o 3 CD r+ 3" t— 0 3 H- □ O < co* J- □ N cr «+ X V) c
(JI o A.
(JI
I w co -*J Cti m 4X t*J to 5 5 ϊ ϊ Π σ 7 7 7 7 hnn w w Á ΐ 3 s a h a h??????ff £ S1 | ř £ c c c c* <S έ t- 4- ř· 3 tn tni ± l
Ě R
01 lQ i $tn
I I I Ό ”9 5 *3 ? ?
9 tQ iQ i > 4j h K 5 9 ? 4> Íj 5 s ? í> Q hrj nj
00 CJQOCSOLHUSJtJlHOOOOI o o o o o to o 1 1 1 1 I t 1 1 i GJ >th XJ A* a w )-· M 00 ** Ol h-· o to Ό O co ** Η» CJ tn 00 ~J o to σ\ I 1 I I 1 1 I I 1
OJtAJNJWbJWMNJ***-·Ol A (O Ό >J (O ffi !*> U XJ *1 01 CD □ 3 CD 01 M <+ c £ et 2ΓX□. >-i □ 3'
O oH CT □
O tn rt- <1
O I— 01 <+ h— < 3 l-\ 01 J xj 3 O CD K- cl X- 3 3 • O O 3Γ X <4- X *< CL tn xj CD Ό. O x-> Π H> H- O O 3 cx *< 3 □ tn T abulka N)
I t-· X4 t 14 - Příklad 4
Stanovení účinnosti G-CSF Účinnost G-CSF se stanoví při použití buněčné liniemyší leukemie NFSóO, která je úplně závislá na přítomnostiG-CSF, jak bylo popsáno v publikacích Biochem. J. 253, 1988,213 - 218, Exp. Hematol. 17, 1989, 116 - 119 a Proč. Nati.Acad. Sci. USA 83, 1986, 5010. Aby bylo možno udržet zá-vislost buněk na uvedeném faktoru, obsahuje živné prostředípro udržovací kulturu stále 1000 jednotek/ml G-CSF. Užíváse prostředí RPMI s 10 % fetální telecího sera (BoehringerMannheim GmbH, objednací číslo 2099445). Při tomto testu se přímo měří proliferace buněk NFS60působením G-CSF vestavbou ^H-thymidinu. Zkouška se provádínásledujícím způsobem: 8uňký NFSóO, které se nacházejí v exponenciální fázirůstu (množství buněk maximálně 1 x 10^ buněk/ml) se pře-nesou na mikrotitrační plotny (1 x 10^ buněk/vyhloubení).a pěstování se provádí při klesající koncentraci G-CSF.Maximální dávka G-CSF ve vyhloubení 1 odpovídá koncentraciv udržovací kultuře 1000 jednotek/ml, specifická účinnost1 x 10θ jednoték/mg bílkoviny. Ředění se provádí vždy po±desetinásobcích.
Po přibližně 24 hodinách inkubace se přidá ^H-thymidin(0,1 ^uCi/vyhloubení). Pak se buňky inkubují ještě dalších16 hodin.
Pro vyhodnocení zkoušek se buňky namrazí na mikro-titrační plotně tak, že dojde k jejich rozrušení. Mate-riál se odsaje na skleněný filtr, promyje, suší a filtryse měří při použití scintilačního počítače. Vestavba ^H--thýmidinu.7je přímo úměrná proliferaci buněk NFS6Q, induko-vané G-CSF. - .15 Příklad 5
Stanovení výtěžku renaturace v závislosti na koncentracidenaturované bílkoviny při jednorázovém přidání Výchozí materiál: inklusní tělíska s obsahem konstrukcí č.0, 3, 5 a 8 z tabulky 2.
Solubilizace a první dialýza:
Materiál inklusních tělísek 10 se solubilizuje analo-gickým způsobem jako v příkladu 3, dialyzuje se k odstraně-ní redukčního činidla a pak se koncentrace bílkovin upravína 30 mg/ml (M,M, Bradford, Anal. Biochem. 72, 1976; 255).
Renaturace:
Reaktivace se provádí v 0,8 mol/1 nebo 0,2 mol/1 argi-ninhydrochloridu s 10 mmol/1 EDTA, 0,5 mmol/1 GSH a 0,5 mmol/1GSSG při teplotě 20 °C a pH 8,0. V renaturační směsi se koncentrace bílkoviny nastaví *:na rozmezí 0,3 až 3 mg/ml. Koncentrace guanidinhydrochloriduje ve všech vzorcích 0,55 mol/1.
Po inkubaci 3 hodiny při teplotě místnosti se reakcezastaví okyselením ná pH 4,5.
Poměr denaturované a renaturované bílkoviny se stanovípři použití HPLC.
Rozpouštědlo A: 0,12 % objemových kyseliny triíluoroctové,rozpouštědlo 8: 90 % objemových acetonitrilu, 0,1 % objemo- vých kyseliny trifluoroctové.
Gradient 8: 40 až 70 % v průběhu 30 minut.
Průtok: 1 ml/min, detekce při 280 nm.' 16 Výsledky uvedených zkoušek jsou graficky znázorněnyna obr. 1 a 2.- Příklad 6
Renaturace v závislosti.na koncentraci argininu Výchozím materiálem pro tuto zkoušku byly dialyzovanévzorky po solubilizaci, koncentrace bílkoviny 10 mg/ml,byly užity konstrukce 0, J, 5 a 8 z tabulky 2, získanézpůsobem podle příkladu 5.
Jednorázovým přidáním denaturované bílkoviny byla kon-centrace bílkoviny v renaturačním pufru nastavena na 1 mg/ml.Renaturační pufr obsahoval 0 až 0,3 mol/1 argininhydrochlori-du, 100 mmol/1 tris, 10 mmol/1 EDTA, 0,5 mmol/1 GSH a 0,5mmol/1 GSSG, teplota místnosti, pH. Θ.
Po inkubační době 3 hodiny byla reakce zastavena okyse-lením na pH 4,5. Následující vyhodnocení bylo prováděno po-mocí KPLC stejně jako v příkladu 5. Výsledky uvedených zkoušek jsou graficky znázorněny naobr. 3. Příklad 7
Kinetika reaktivace, bílkoviny v pufru, obsahujícím 0,2 mol/1 argininu Výchozí materiál: jako výchozí materiál byly užity solubi-lizáty, získané způsobem podle příkladu 6.
Reaktivace byla prováděna při teplotě místnosti a při pH 3 v pufru, který obsahoval 0,2 mol/1 argininhydrochloridu, 17 10 mmol/1 trisř 10 mmol/1 EOTA, 0,5 mmol/1 GSH a 0,5 mmol/1GSSG. Koncentrace bílkoviny v reakčním vzorku byla upravovánavždy jednorázovým přidáním na obsah bílkoviny 1 mg/ml, kon-centrace guanidinu byla ve vzorku upravována na množství té-to látky 0,55 mol/1. Po 5, 10, 15, 60 a 180 minutách bylyodebírány vzorky reakční směsi, reakce byla vždy zastavenaokyselením reakční. směsi na pH 4,5 a výsledek, i kinetika. re-aktivace byly stanoveny KPLC obdobným způsobem jako v pří-kladu 5. Výtěžek reaktivace v závislosti na inkubační době jegraficky znázorněn na obr. 4. Dále budou formou tabulky uvedeny podrobnější údajeo jednotlivých použitých řetězcích. - 18 -
Použité řetězce
Počet řetězců 12 Řetězec 1 (i) charakteristika řetězce: A) délka: dvě aminokyseliny8) typ: řetězec aminokyselin0) druh řetězce: lineární. (xi) Popis řetězce:
Met-Glu 1 Řetězec 2 (i) charakteristika řetězce: A) délkať osm aminokyselin8) typ: řetězec aminokyselin0) druh řetězce: lineární. (xi) popis řetězce:
Met-Thr-Pro-Leu-Pro-Arg-Pro-PDO1 5 Řetězec 3 (i) charakteristika řetězce: A) délka: 10 aminokyselin B) typ: řetězec aminokyselin0) druh řetězce: lineární. (xi) Popis řetězce:
Met-Thr-Pro-Leu-His-His-Pro-Arg-Pro-Pro1 5 10 19 Řetězec 4 (i) charakteristika řetězce: A) délkaf 10 aminokyselin3) typ: řetězec aminokyselin0) druh řetězce: lineární. (xi) Popis řetězce:
Met-Thr-Pro-Leu-Lys-Lys-Pro-Arg-Pro-Pro1 5 10 Řetězec 5 (i) charakteristika řetězce: A) délka: 11 aminokyselin8) typ: řetězec aminokyselinD) druh řetězce: lineární. (xi) Popis řetězce:
Met-Thr-Pro-Leu-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Pro-Pro1 5 10 Řetězec 6 (i) charakteristika řetězce: A) délka: 14 aminokyselin0) typ: řetězec aminokyselin0) druh řetězce: lineární.. (xi) Popis řetězce:
Met-Thr-Pro-Leu-Glu-Glu-Gly-Thr-Pro-Leu-Pro-Arg-Pro-Proi 5 ' no Řetězec 7 (i) charakteristika řetězce: A) délka: 9 aminokyselin3) typ: řetězec aminokyselinD) druh řetězce: lineární. .- 20 (xi) popis řetězce:
Met-Thr-Pro-Leu-Olu-Glu-Gln-Pro-Pro1 5 Řetězec 9 (i) charakteristika řetězce: A) délka: 13 aminokyselin B) typ: řetězec aminokyselinD) druh řetězce: lineární. (xi) popiš řetězce:
Met-Lys-Ala-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-His-Pro-Arg-Pro-Pro15 10 Řetězec 9: (i) charakteristika řetězce: A) délka: 11 aminokyselin B) typ: řetězec aminokyselinD) druh řetězce: lineární. (xi) popis řetězce:
Met-Thr-Pro-Leu-Glu-Glu-Gly-Ile-Glu-Gly-Arg'1 5 10 Řetězec 10 ________;__________________________________1_______________ (i) charakteristika řetězce: A) délka: 16 aminokyselin B) typ: řetězec aminokyselin0) druh řetězce: lineární. (xi) popis řetězce:
Met-Thr-Pro-Leu-Lys-Ala-Lys-Arg-Phe-Lys-Uys-His-Pro-Arg-Pro-Pro15 10 15 21 Řetězec 11: (i) charakteristika řetězce: A) délka: 18 párů baží 3) typ: řetězec nukleových kyselin C) řetězec: jednoduchý □) druh řetězce: lineární. (xi) popis řetězce:
AATTCGGAGG AAAAATTA 13 Řetězec 12 (i) charakteristika řetězce: A) délka: 13 párů baží Θ) typ: řetězeclnukleových kyselin C) řetězec: jednoduchý0) druh řetězce: lineární. (xi) popis řetězce:
ACACCACTGG GCC 13
Zastupuje:
advukátka
Claims (15)
- - 22 - PATENTOVÉ r 33 > o - O < C- ° - W 30* í_ > — φ; S < r- < Π CO N NJ -B-J c/l -J1. Způsob aktivace rekombinantních bílkovin, nacháze-jících se alespoň z části v neaktivní forrněf v y z n a č u -jící se tím, že se aktivuje solubilizačním a/neborenaturačním způsobem bílkoviny, která obsahuje ve svém N-a/nebo C-terminálním zakončení ještě pomocný řetězec o 2 až50 aminokyselinách, přičemž relativní hydrofobnost těchtopomocných řetězců, vypočtená jako součet uvedené relativníhydrofobnosti v tabulce 1 pro jednotlivé aminokyseliny, mázápornou hodnotu.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m , že pomocný řetězec má hodnotu relativní hydrofobnostivzhledem k počtu aminokyselin -2,0 kcal/mol nebo nižší.
- 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující setím, že pomocný řetězec má hodnotu poměru relativníhydrofobnosti vzhledem k počtu aminokyselin -25 kcal/molnebo nižší.
- 4. Způsob podle nároků laŽ3, vyznačující s e t::,í m , že pomocné řetězce jsou navázány na N-terminál-ní zakončení bílkoviny, která má být aktivována.
- 5. Způsob podle nároků laž3, vyznačujícíse tím, že pomocné řetězce jsou navázány na C-terminál-ní zakončení bílkoviny, která má být aktivována.
- 6. Způsob podle nároků 1 až 5, vyznačujícíse tím, že pomocné řetězce obsahují alespoň dvě amino-kyseliny, zvolené ze skupiny zbytku glukamátu, aspartátu,lysinu, argininu a prolinu. - 23
- 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se t í m , že pomocné řetězce obsahují alespoň dva glutamátovézbytky.
- 8. Způsob podle nároku 6 nebo 7,vyznačují-c í se tím, že pomocné řetězce obsahují dva bezpro-středně po sobě následující aminokyseliny stejného nábojeze skupiny, zahrnující zbytek glutamátu, aspartátu, lysinua argininu.
- 9. Způsob podle nároku 8, vyz-bačující- set í m , že pomocné řetězce obsahují dva bezprostředně po -sobě následující glutamátové zbytky.
- 10. Způsob podle nároků 1 až 9, vyznačujícíse tím, že se aktivují bílkoviny, obsahující štěpnémísto na přechodu mezi pomocným řetězcem a požadovanouvýslednou bílkovinou.
- 11. Způsob podlěcnářoku 10, vyznačující sect í m , že aktivovaná bílkovina obsahuje štěpné místo, roz-poznávané proteázou.
- 12. Způsob podle nároku 11, vyznačující setím, že aktivovaná bílkovina obsahuje štěpné místo, kte-ré je rozpoznáváno IgA-proteázou.
- 13. Způsob podle nároku 12, vyznačující setím, že štěpným místem je místo štěpení faktorem Xa.
- 14. Způsob podle nároků 1 až 13,vyznačujícíse t í m, že se aktivuje bílkovina, obsahující na svémN-terminálním zakončení některý z následujících pomocnýchřetězců, - 24 Met-Glu (řetězec 1) Met-Thr-Pro-Leu-Pro-Arg-Pro-Pro (řetězec 2) Met-Thr-Pro-Leu-His-Kis-Pro-Arg-Pro-Pro (řetězec 3) Met-Thr-Pra-Leu-Lýs-Lys-Pro-Arg-Pro-Pro (řetězec 4) Met-Thr-Pro-Leu-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Pro-Pro (řetězec 5) Met-Thr-Pro-Leu-Glu-Glu-Gly-Thr-Pro-Leu-Pro-Arg-Pro-Pro(řetězec 6$ Met-Thr-Pro-Leu-Glu-Glu-Gln-Pro-Pro (řetězec 7) Met-tys-Ala-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-His-Pro-Arg-Pro-Pro (řetězec 8) Met-Thr-Pro-Leu-Glu-Glu-Gly-Ile-Glu-Gly-Arg (řetězec 9) Met-Thr-Pro-Leu-Lys-Ala-Lys-Arg-Phe-Lys-Lys-His-Pro-Arg-Pro-Pro(řetězec 10). , . , v . I . L ,
- 15. Způsob podle nároků 1 až 14, vyznačujícíse tím, že se aktivuje bílkovina, která je faktorem,stimulujícím tvorbu kolonií granulocytú G-CSF nebo deriváttéto bílkoviny. . Zastupuje: JUDr. Zdenka K0F5CJ,ad v w!:;t
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4105480A DE4105480A1 (de) | 1991-02-21 | 1991-02-21 | Verbesserte aktivierung von rekombinanten proteinen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS49992A3 true CS49992A3 (en) | 1992-09-16 |
| CZ282744B6 CZ282744B6 (cs) | 1997-09-17 |
Family
ID=6425597
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5578710A (cs) |
| EP (1) | EP0500108B1 (cs) |
| JP (1) | JP2528232B2 (cs) |
| KR (1) | KR950014493B1 (cs) |
| AT (1) | ATE144284T1 (cs) |
| AU (1) | AU641081B2 (cs) |
| CA (1) | CA2061569C (cs) |
| CZ (1) | CZ282744B6 (cs) |
| DE (2) | DE4105480A1 (cs) |
| DK (1) | DK0500108T3 (cs) |
| ES (1) | ES2093122T3 (cs) |
| FI (1) | FI106029B (cs) |
| GR (1) | GR3021395T3 (cs) |
| HU (1) | HU214881B (cs) |
| IE (1) | IE920276A1 (cs) |
| IL (1) | IL101024A (cs) |
| MX (1) | MX9200709A (cs) |
| NO (1) | NO300329B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ241570A (cs) |
| ZA (1) | ZA921230B (cs) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5718893A (en) * | 1984-04-15 | 1998-02-17 | Foster; Preston F. | Use of G-CSF to reduce acute rejection |
| US5581476A (en) | 1993-01-28 | 1996-12-03 | Amgen Inc. | Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs |
| SE9301057L (sv) * | 1993-03-30 | 1994-10-01 | Pharmacia Ab | Beredning med kontrollerad frisättning |
| US5536495A (en) * | 1994-04-15 | 1996-07-16 | Foster; Preston F. | Use of G-CSF to reduce acute rejection |
| US20030053982A1 (en) | 1994-09-26 | 2003-03-20 | Kinstler Olaf B. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
| US5824784A (en) | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
| US6245740B1 (en) | 1998-12-23 | 2001-06-12 | Amgen Inc. | Polyol:oil suspensions for the sustained release of proteins |
| MXPA03002045A (es) | 2000-09-08 | 2003-07-24 | Amgen Inc | Composiciones analogas de factor estimulador de colonias de granulocitos y metodos para su elaboracion. |
| WO2002069232A2 (en) | 2001-02-19 | 2002-09-06 | Merck Patent Gmbh | Method for identification of t-cell epitopes and use for preparing molecules with reeduced immunogenicity |
| EP1425304B9 (en) | 2001-07-11 | 2010-09-08 | Maxygen, Inc. | G-csf conjugates |
| KR100508358B1 (ko) | 2002-03-20 | 2005-08-17 | 주식회사 바이오폴리메드 | 생체적합성 고분자가 시스테인 잔기에 화학양론적으로 결합된 ｇ-ｃｓｆ의 제조 방법 |
| US7666627B2 (en) * | 2002-08-08 | 2010-02-23 | Targetex Kft. | Folded recombinant catalytic fragments of multidomain serine proteases, preparation and uses thereof |
| US7785601B2 (en) | 2002-12-31 | 2010-08-31 | Sygnis Bioscience Gmbh & Co. Kg | Methods of treating neurological conditions with hematopoietic growth factors |
| US7695723B2 (en) | 2002-12-31 | 2010-04-13 | Sygnis Bioscience Gmbh & Co. Kg | Methods of treating neurological conditions with hematopoietic growth factors |
| US7220407B2 (en) | 2003-10-27 | 2007-05-22 | Amgen Inc. | G-CSF therapy as an adjunct to reperfusion therapy in the treatment of acute myocardial infarction |
| AU2005306894B2 (en) | 2004-11-05 | 2011-11-24 | Northwestern University | Use of SCF and G-CSF in the treatment of cerebral ischemia and neurological disorders |
| KR20080027291A (ko) | 2005-06-01 | 2008-03-26 | 맥시겐 홀딩스 엘티디 | 피이지화된 지-씨에스에프 폴리펩타이드 및 그 제조방법 |
| JP5452223B2 (ja) * | 2006-07-24 | 2014-03-26 | テトラロジック ファーマシューティカルズ コーポレーション | Ｉａｐ阻害剤 |
| US20090324609A1 (en) | 2007-08-09 | 2009-12-31 | Genzyme Corporation | Method of treating autoimmune disease with mesenchymal stem cells |
| WO2009046015A2 (en) | 2007-09-30 | 2009-04-09 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Combination therapies for treating type 1 diabetes |
| US8283372B2 (en) | 2009-07-02 | 2012-10-09 | Tetralogic Pharmaceuticals Corp. | 2-(1H-indol-3-ylmethyl)-pyrrolidine dimer as a SMAC mimetic |
| EP2542574B1 (en) | 2010-03-04 | 2017-08-09 | Pfenex Inc. | Method for producing soluble recombinant interferon protein without denaturing |
| CN102892780B (zh) * | 2010-03-17 | 2015-07-29 | 通益制药有限公司 | 获得生物活性的重组人g-csf的方法 |
| AU2011235210B2 (en) | 2010-04-01 | 2015-07-16 | Pfenex Inc. | Methods for G-CSF production in a Pseudomonas host cell |
| KR20150037959A (ko) * | 2012-08-02 | 2015-04-08 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 단량체 및 다량체 분자의 제조 방법 및 이의 용도 |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4532207A (en) * | 1982-03-19 | 1985-07-30 | G. D. Searle & Co. | Process for the preparation of polypeptides utilizing a charged amino acid polymer and exopeptidase |
| DK55685A (da) * | 1985-02-07 | 1986-08-08 | Nordisk Gentofte | Enzym eller enzymkompleks med proteolytisk aktivitet |
| US4530787A (en) * | 1984-03-28 | 1985-07-23 | Cetus Corporation | Controlled oxidation of microbially produced cysteine-containing proteins |
| US5082775A (en) * | 1984-05-11 | 1992-01-21 | Berlex Laboratories, Inc. | Efficient process for isolating insoluble heterologous protein using non-ionic detergents |
| US4948729A (en) * | 1985-03-25 | 1990-08-14 | Cetus Corporation | Production of soluble recombinant proteins |
| US4783415A (en) * | 1985-03-28 | 1988-11-08 | Meiji Seika Kabushiki Kaisha | Gene coding for signal peptides and utilization thereof |
| US5087564A (en) * | 1985-06-20 | 1992-02-11 | Monsanto Company | Release of recombinant peptides from polypeptides using V8 endopeptidase |
| DE3636903A1 (de) * | 1985-12-21 | 1987-07-02 | Hoechst Ag | Fusionsproteine mit eukaryotischem ballastanteil |
| JPH0618781B2 (ja) * | 1986-10-18 | 1994-03-16 | 中外製薬株式会社 | 感染症治療剤 |
| EP0305500B1 (en) * | 1987-03-20 | 1994-11-09 | Creative Biomolecules, Inc. | Process for the purification of recombinant polypeptides |
| US5013653A (en) * | 1987-03-20 | 1991-05-07 | Creative Biomolecules, Inc. | Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage |
| EP0371041A1 (en) * | 1987-06-24 | 1990-06-06 | Novo Nordisk A/S | A process for preparing a protein or polypeptide, a dna sequence coding for the polypeptide, a microorganism containing the dna sequence as well as the polypeptide and its use as a pharmaceutical preparation |
| DE3835350A1 (de) * | 1988-10-17 | 1990-04-19 | Boehringer Mannheim Gmbh | Aktivierung von gentechnologisch hergestellten, in prokaryonten exprimierten antikoerpern |
| ZA901719B (en) * | 1989-03-19 | 1991-01-30 | Akzo Nv | Hog cholera virus vaccine and diagnostics |
| US5191063A (en) * | 1989-05-02 | 1993-03-02 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Production of biologically active polypeptides by treatment with an exogenous peptide sequence |
| US5115102A (en) * | 1989-07-21 | 1992-05-19 | Monsanto Company | Variant proteins and polypeptides possessing enhanced affinity for immobilized-metal affinity matrices |
| JPH06500084A (ja) * | 1990-08-20 | 1994-01-06 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 生物学的に活性な化合物、その製造方法及びその利用 |
-
1991
- 1991-02-21 DE DE4105480A patent/DE4105480A1/de not_active Withdrawn
-
1992
- 1992-01-28 IE IE027692A patent/IE920276A1/en not_active IP Right Cessation
- 1992-02-10 NZ NZ241570A patent/NZ241570A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-02-14 AU AU10948/92A patent/AU641081B2/en not_active Ceased
- 1992-02-20 IL IL10102492A patent/IL101024A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-02-20 HU HU9200548A patent/HU214881B/hu not_active IP Right Cessation
- 1992-02-20 NO NO920671A patent/NO300329B1/no unknown
- 1992-02-20 AT AT92102864T patent/ATE144284T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-02-20 DK DK92102864.3T patent/DK0500108T3/da active
- 1992-02-20 CZ CS92499A patent/CZ282744B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-02-20 ES ES92102864T patent/ES2093122T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-20 CA CA002061569A patent/CA2061569C/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-02-20 EP EP92102864A patent/EP0500108B1/de not_active Revoked
- 1992-02-20 FI FI920742A patent/FI106029B/fi not_active IP Right Cessation
- 1992-02-20 MX MX9200709A patent/MX9200709A/es not_active IP Right Cessation
- 1992-02-20 ZA ZA921230A patent/ZA921230B/xx unknown
- 1992-02-20 JP JP4033257A patent/JP2528232B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-20 DE DE59207351T patent/DE59207351D1/de not_active Revoked
- 1992-02-21 KR KR1019920002697A patent/KR950014493B1/ko not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-10-21 US US08/139,054 patent/US5578710A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-10-17 GR GR960402469T patent/GR3021395T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0500108A2 (de) | 1992-08-26 |
| ZA921230B (en) | 1992-11-25 |
| JPH05244977A (ja) | 1993-09-24 |
| HU214881B (hu) | 1998-07-28 |
| DE59207351D1 (de) | 1996-11-21 |
| CA2061569A1 (en) | 1992-08-22 |
| KR920016464A (ko) | 1992-09-24 |
| IL101024A (en) | 1996-06-18 |
| AU641081B2 (en) | 1993-09-09 |
| MX9200709A (es) | 1992-09-01 |
| EP0500108A3 (en) | 1993-04-07 |
| FI920742L (fi) | 1992-08-22 |
| FI106029B (fi) | 2000-11-15 |
| DE4105480A1 (de) | 1992-08-27 |
| HU9200548D0 (en) | 1992-04-28 |
| NO920671D0 (no) | 1992-02-20 |
| US5578710A (en) | 1996-11-26 |
| IE920276A1 (en) | 1992-08-26 |
| DK0500108T3 (da) | 1997-03-24 |
| HUT68021A (en) | 1995-04-04 |
| EP0500108B1 (de) | 1996-10-16 |
| CA2061569C (en) | 2000-10-24 |
| ATE144284T1 (de) | 1996-11-15 |
| FI920742A0 (fi) | 1992-02-20 |
| NZ241570A (en) | 1994-09-27 |
| CZ282744B6 (cs) | 1997-09-17 |
| KR950014493B1 (ko) | 1995-12-02 |
| AU1094892A (en) | 1992-08-27 |
| ES2093122T3 (es) | 1996-12-16 |
| GR3021395T3 (en) | 1997-01-31 |
| NO920671L (no) | 1992-08-24 |
| JP2528232B2 (ja) | 1996-08-28 |
| IL101024A0 (en) | 1992-11-15 |
| NO300329B1 (no) | 1997-05-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CS49992A3 (en) | Process of recombinant proteins activation | |
| JP3438227B2 (ja) | Ｉｇｆ−１を活性なコンホメーションに再折り畳みする方法 | |
| AU672790B2 (en) | Variants of parathyroid hormone and its fragments | |
| Klemm | Primary structure of the CFAl fimbrial protein from human enterotoxigenic Escherichia coli strains | |
| Yasueda et al. | High-level direct expression of semi-synthetic human interleukin-6 in Escherichia coli and production of N-terminus met-free product | |
| BR9810650B1 (pt) | vetor para expressço de proteÍna heteràloga e mÉtodos para extrair proteÍna recombinante e para purificar insulina recombinante isolada. | |
| Kitai et al. | Extracellular production of human immunoglobulin G Fc region (hIgG-Fc) by Escherichia coli | |
| CN113045670B (zh) | 一种可溶性鸡α干扰素融合蛋白及其生产方法与应用 | |
| CA2159079C (en) | Methods and dna expression systems for over-expression of proteins in host cells | |
| CN1055952A (zh) | 用链霉菌制备外源蛋白的方法 | |
| CN105838694B (zh) | 一种融合标签蛋白 | |
| CN110511950B (zh) | Pab蛋白在构建具有类伴侣样蛋白作用的融合蛋白表达载体中的应用 | |
| CN110540601B (zh) | 重组PLB-hEGF融合蛋白及其应用 | |
| KR0161656B1 (ko) | 글루카곤의 생산방법 | |
| CN107936107B (zh) | 长牡蛎干扰素调节因子CgIRF-1基因重组蛋白、制备方法及应用 | |
| EP1981978A2 (en) | Affinity polypeptide for purification of recombinant proteins | |
| CN112851765B (zh) | 蛋白或肽与核酸共价连接的方法 | |
| KR20210079235A (ko) | Whep 도메인 융합에 의한 목적 단백질의 수용성 증진 방법 | |
| KR20090018315A (ko) | 대장균 유래 ｐｔｓＬ 프로모터를 함유하는 재조합벡터 및이를 이용한 외래 단백질의 제조방법 | |
| CN105154497A (zh) | 一种利用重组大肠杆菌制备鸡白介素2的方法 | |
| CN110511951B (zh) | Plb蛋白在构建具有类伴侣样蛋白作用的融合蛋白表达载体中的应用 | |
| JP2602067B2 (ja) | ヒラメ成長ホルモン、ヒラメ成長ホルモン構造遺伝子、ヒラメ成長ホルモン生産用組換えプラスミド、ヒラメプレ成長ホルモン、ヒラメプレ成長ホルモン構造遺伝子、ヒラメプレ成長構造遺伝子組換えプラスミド、ヒラメ成長ホルモン及びヒラメプレ成長ホルモンの製造方法 | |
| JP2555816B2 (ja) | ヒトインターロイキン−２蛋白質の製造法 | |
| JPS60502136A (ja) | 微生物によるインタ−ル−キン２の形質発現 | |
| TW206236B (cs) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20060220 |