JPH05244977A - 組換え蛋白質を活性化する方法 - Google Patents

組換え蛋白質を活性化する方法

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JPH05244977A JP4033257A JP3325792A JPH05244977A JP H05244977 A JPH05244977 A JP H05244977A JP 4033257 A JP4033257 A JP 4033257A JP 3325792 A JP3325792 A JP 3325792A JP H05244977 A JPH05244977 A JP H05244977A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 組換え蛋白質を活性化する新規方法を提供す
る。 【構成】 該方法は、少なくとも部分的に不活性の形で
存在する組換え蛋白質を活性化する方法において、通常
の可溶化及び／又は復元技術により、Ｎ及びＣ末端に２
〜５０アミノ酸の長さを有する付加的なヘルパー配列を
含有する蛋白質活性化し、その際このヘルパー配列の相
対疎水度が、第１表に示した、個々のアミノ酸の相対疎
水度の和として計算して、負の数値を有することよりな
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、組換え蛋白質を活性化
する方法、特に原核生物からの組換え蛋白質を活性化す
る方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】原核生物において組換え蛋白質が発現す
ると、蛋白質は宿主細胞内でしばしばすくなくとも部分
的に不活性の、難溶性の骨材（屈折力のある体、封入体
ＩＢ）を生じ、これらは更になお宿主細胞の蛋白質で不
純化されることもある。このような蛋白質は、例えば治
療又は診断目的のために使用することができるようにす
るには、これらはその活性形に変えねばならない。
【０００３】組換え蛋白質の復元方法は一般に公知であ
りかつ欧州特許公開第０１１４５０６号明細書、国際特
許出願第８６／００６１０号明細書、国際特許出願第８
４／０３７１１号明細書、米国特許第４５３０７８７号
明細書及び欧州特許公開第０２４１０２２号明細書に開
示された。しかしながら、これらの公知方法では、しば
しば自然蛋白質配列を活性化する際に低い収率が得られ
る。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の基礎
とした問題点は、組換え蛋白質の復元収率における改良
を達成することにある。このための１つの原理的可能性
は、該収率を復元条件の選択により改良することができ
る方法を見出すことであると見なされるであろう。しか
しながら、このことは本発明の対象ではない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明による課題の解決
手段は、蛋白質のＮ又は／及びＣ末端基に付加的なヘル
パー配列を結合させると、該蛋白質の復元収率が高めら
れるという驚異的観察を基礎とする。
【０００６】従って、本発明の対象は、少なくとも部分
的に不活性の形で存在する組換え蛋白質、特に原核生物
からの組換え蛋白質を活性化する方法であり、該方法
は、通常の可溶化及び／又は復元技術により、Ｎ及びＣ
末端に２〜５０アミノ酸の長さを有する付加的なヘルパ
ー配列を含有する蛋白質活性化し、その際このヘルパー
配列の相対疎水度が以下の第１表に示した、個々のアミ
ノ酸の相対疎水度の和として計算して、府の数値を有す
ることを特徴とする。
【０００７】本発明における用語“相対疎水度”は、刊
行文献“T.E. Creigthon (1983), Proteins, Structure
and Molecular Principles, W.H. Freeman and Compan
y, New York, p.142, 表4.4; G. von Heijne und C. Bl
omberg (1979) Eur. J. Biochem. 95. 175-181 及びY.
Nozaki und C. Tanford (1971), J. Biol. Chem. 246,
2211-2217”から由来する。この場合、アミノ酸の相対
疎水度の値の測定は、例えばNozaki/Tanfordによれば無
極性溶剤（例えばエタノール／ジオキサン）と水との間
の該アミノ酸の分布平衡を確認することにより行われ
た。該相対疎水度は、エネルギー量であり、ひいてはｋ
ｃａｌ／ｍｏｌで示される。相対疎水度の正の値は、無
極性溶剤に対するプリファレンスが存在しない、即ち無
極性アミノ酸ではないことを意味する。それに対して、
相対疎水度が０よりも小さい数値を有する場合には、無
極性溶剤に比して水に対するプリファレンスを示す極性
アミノ酸であることを示す。従って、この種のアミノ酸
の場合には、例えばエタノールから水に移行する際にエ
ネルギーが放出される。
【０００８】以下の第１表は、個々のアミノ酸の相対疎
水度に関する値のリストを示す。
【０００９】
【表２】
【００１０】この表から、アミノ酸、システイン、プロ
リン及び特にグルタメート、アスパラテート、アルギニ
ン及びリシンは強度の負の相対疎水度を有することは明
らかである。
【００１１】驚異的にも、ヘルパー配列の和が負の相対
疎水度を有する場合には、２〜５０のアミノ酸の長さを
有するヘルパー配列を蛋白質配列に結合させることによ
り組換え蛋白質の活性化を著しく改良することができる
ことが判明した。有利には、これらのヘルパー配列の長
さは２〜２０、特に有利には５〜２０アミノ酸である。
【００１２】更に、これらのヘルパー配列に関して、相
対疎水度とアミノ酸の数との商は−２．０ｋｃａｌ／ｍ
ｏｌ以下、特に有利には−２．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以
下、最も有利には−２．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下である
のが好ましい。
【００１３】ヘルパー配列の組換え蛋白質への結合は、
分子生物学の分野において通常の技術を用いて行うこと
ができる。この結合は有利には、実験すべき組換え蛋白
質を暗号化するＤＮＡ配列の一方又は両端部に、負の相
対疎水度を有する前記の蛋白質ヘルパー配列を暗号化す
るオリゴヌクレオチド配列を結合することにより実施す
る。この目的のためには、例えばＤＮＡ断片を、相応す
る遺伝子の開始部もしくは終端部を暗号化する範囲を含
有する実験すべき遺伝子から単離する。次いで、このＤ
ＮＡ断片に、例えば別の制限サイトを用いて、ヘルパー
配列を暗号化する範囲を含有する合成オリゴヌクレオチ
ドを導入することができる。もう１つの可能性は、遺伝
子からの自然ＤＮＡ断片を完全にオリゴヌクレオチド配
列と交換することよりなる。このようにして、組換え蛋
白質の情報に加えて結合したヘルパー配列ための情報を
含む、変更ＤＮＡ配列を得ることができる。Ｎを末端基
とするヘルパー配列を暗号化するＤＮＡ配列としては、
そのコドンの選択性が発現微生物に合わせられたＤＮＡ
配列を使用するのが有利である（E. L. Winnacker,Gene
und Klone, Verlag Chmie, 185, 224-241）。
【００１４】この場合、発現微生物としてのＥ，ｃｏｌ
iに関しては、以下のアミノ酸のために有利にコドンと
して使用される： トレオニン ＡＣＡ プロリン ＣＣＡ ロイシン ＣＴＡ リシン ＡＡＡ アラニン ＧＣＣ グルタミン酸 ＧＡＡ。
【００１５】このようにして変更した、結合されたヘル
パー配列を有する組換え蛋白質のために暗号化するＤＮ
Ａを、形質転換により宿主細胞、有利には原核生物細
胞、特に有利にはＥ．ｃｏｌｉ細胞内に導入する。引き
続き、形質転換した細胞を適当な培地内での形質転換し
た細胞の培養、該細胞の可溶化及び少なくとも部分的に
不活性の状態で生じた、特に細胞封入体の形で存在する
組換え蛋白質の単離を行う。引き続き、該蛋白質の可溶
化及び復元を、好ましくは、該蛋白質がその本来の立体
配座を取ることができるｐＨ値で行う。これらの操作段
階は、例えば該明細書の冒頭に挙げた公知技術水準から
も推察されるような、周知の技術に相応して実施するこ
とができる。有利には、蛋白質の活性化は、例えば欧州
特許公開第０２４１０２２号明細書から公知であるよう
な、パルス復元法を用いて行う。本発明によって達成さ
れる公知の操作技術の改良は、特に、組換え蛋白質のＮ
又は／及びＣ末端基に結合されたヘルパーの存在に起因
する。この場合、ヘルパー配列は有利には活性化すべき
蛋白質のＮ末端基に結合される。しかしながら、Ｃ末端
基へのヘルパー配列の結合もプラスの結果ををもたら
す。
【００１６】ヘルパー配列としては、グルタメート、ア
スパルテート、リシン、アルギニン及びプロリンからな
る群から選択される少なくとも２個のアミノ酸を含有す
るものが有利であり、この場合リシン及びグルタメート
基が特に有利でありかつグルタメート基が最も有利であ
る。更に、ヘルパー配列が同じ符号の電荷を有する前記
の電荷を有するアミノ酸（即ちグルタメート、アスパル
テート、リシン及びアルギニン）の２つの直接連続した
もの、有利には２つの直接連続したリシン又はグルタメ
ート基、特に有利には２つの直接連続したグルタメート
基を含有する場合が特に有利である。
【００１７】本発明による方法に基づき製造された組換
え蛋白質を後で治療において使用する際には、切断部位
をヘルパー配列と所望の蛋白質の間の移行部に有するの
が有利である。このことにより該蛋白質をその自然のア
ミノ酸配列で得ることができる。この切断部位は、プロ
テアーゼ又は化学的蛋白質分割試薬（例えばＢｒＣＮ）
によって認識される配列であってよい。この場合、プロ
テアーゼ切断部位が有利である。切断としては、国際特
許出願第９１／１１５２０号明細書に記載されているよ
うな、ＩｇＡプロテアーゼ切断部位が特に有利である。
正確な切断条件は、同様に国際特許出願第９１／１１５
２０号明細書に記載されている。更に、因子Ｘａのため
の切断部位である、切断部位も有利である。
【００１８】蛋白質配列中のこのような切断部位は、分
析において組換え蛋白質を使用する際には不必要であ
る。
【００１９】蛋白質活性化の改良のたえに適当であるヘ
ルパー配列に関する具体的な例は、以下に蛋白質のＮ末
端基に結合した配列である。
【００２０】
【化２】
【００２１】２個の連続したグルタメート基を有するヘ
ルパー配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５，６，７及び９は、最
高の復元収率を生じる、従って最も有利である。
【００２２】本発明による方法は、特に原核生物で製造
されたヒトの組換え蛋白質及びその誘導体、例えばプラ
スミノゲン活性化因子、インターフェロン、インターロ
イキン及び顆粒細胞−コロニー刺激因子の活性化のため
に適当である。活性化すべき蛋白質としては、開始ＤＮ
Ａ配列ＡＣＡＣＣＡを有する顆粒細胞コロニー因子（Ｇ
−ＣＳＦ）が特に有利である。同様に、欧州特許公開第
０４５６２００号明細書に開示されたＧ−ＣＳＦの誘導
体も同様に有利である。
【００２３】ベクターｐＫＫ１７７−３−Ｇ−ＣＳＦ
Ｂｇは、ドイツ微生物保存機関、グリースバッハシュト
ラーセ８，Ｄ−３４００ゲッチンゲン在で、番号ＤＳＭ
５５８６７で寄託された。
【００２４】
【実施例】更に、本発明を以下の実施例及び図面により
詳細に説明する。
【００２５】図１は、第２表の配列０に類似した配列
（曲線１）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（曲線２）、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：５（曲線３）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（曲
線３）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（曲線４）を含有する
構造に関する復元収率の濃度依存性（アルギニン濃度
０．２ｍｏｌ／ｌ）を示す。
【００２６】図２は、第２表の配列０に類似した配列
（曲線１）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（曲線２）、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：５（曲線３）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（曲
線３）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（曲線４）を含有する
構造に関する復元収率の濃度依存性（アルギニン濃度
０．８ｍｏｌ／ｌ）を示す。
【００２７】図３は、復元収率のアルギニン濃度に対す
る依存性（図１及び図２に類似した曲線図）を示す。
【００２８】図４は、復元収率のインクベーション時間
に対する依存性（アルギニン濃度０．２ｍｏｌ／ｌ、図
１及び図２に類似した曲線図）を示す。
【００２９】実施例１ ベクターの構成 ベクターｐＫＫ１７７−３ Ｇ−ＣＳＦ Ｂｇ（ＤＳＭ５
８６７）をＥｃｏＲＩ（部分）ＡｐａＩで消化しかつオ
リゴヌケレオチド：
【００３０】
【化３】
【００３１】を生じた線状化したベクター断片（約３４
５０ｂｐ）に挿入した。
【００３２】
【化４】
【００３３】間隙内にその都度挿入されたＤＮＡ配列
は、第２表に挙げたアミノ酸のための遺伝子コードに相
当する、即ち例えば構造（３）のためには、Ｍｅｔ−Ｔ
ｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：３）のための遺伝子コードを有するオリゴヌクレ
オチドを使用した。切断したベクターへのオリゴヌクレ
オチドの配位子により生じたプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ＨＢ１０１で形質転換した。ｔａｃ−プロモータの
良好な調節能力を保証するために、該細胞を付加的にｐ
ＢＰ０１０（製造、欧州特許出願第６１１１１１５５．
７号明細書参照）に対して適合性の、ｌａｃＩq遺伝子
を含有するプラスミドで形質転換した。該ｌａｃＩq遺
伝子は当業者に既に以前から周知でありかつ容易に得ら
れる。ｐＢＰ０１０の対して適合性プラスミドとして
は、、例えば、ｌａｃＩq遺伝子が挿入されたｐＡＣＹ
Ｃ１７７、又はそれから誘導されたプラスミドが適当で
ある（例えばGene 85 (1989), 109-114及び欧州特許公
開第０３７３３６５号明細書参照）。生じるクローンを
カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）／アンピリシン（５０
μｇ／ｍｌ）で選択しかつ制限分析を介して同定する。
ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶで切断すると、長さ約３．１
５ｋｂ（それおれの構造を有する）及び４．８５ｋｂの
断片が生じる。
【００３４】例２ ａ）発酵：例１に基づき陽性に同定されたクローンをＬ
Ｂ培地内の５ｍｌ培養でカナマイシン及びアンピリシン
（濃度：例１参照）でＯＤ550＝０．５まで取りかつＩ
ＰＴＧ５ｍｍｏｌ／ｌで誘導ししかつ３７℃で３時間イ
ンキュベートする。この誘導した１０ＯＤを収穫しかつ
それから全細胞エキストラクトを製造する。該全細胞エ
キストラクトをＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルで分析する。
【００３５】それから、所望の蛋白質が発現されること
が明らかであれば、該培養を１リットル規模で繰り返
し、該細胞を収穫しかつＩＢ調製を実施する。
【００３６】ｂ）ＩＢ調製：細胞を遠心分離により収穫
し、トリス−マグネシウム緩衝液（トリス１０ｍｍｏｌ
／ｌ，ｐＨ８．０，ＭｇＣｌ2）１００ｍｌ中に取りか
つリゾチーム（０．３ｍｇ／ｍｌ）で可溶化する。
【００３７】３７℃で１５分間インキュベートしかつフ
レンチ・プレス通路を通過させる（１２００ｐｓｉ）。
引き続き、ＤＮＡ分解酵素消化（ＤＮＡ分解酵素Ｉ２ｍ
ｇ）を３７℃で３０分間行う。
【００３８】ＮａＣｌ０．５ｍｏｌ／ｌ、ＥＤＴＡ２０
ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ８．０ ２０ｍｌ及び２０％トリト
ンＸ１００ ３ｍｌを室温でインキュベートする。
【００３９】該懸濁液を１５，０００ｒｐｍ及び４℃で
１０分間遠心分離する。該ペレットをトリス５０ｍｍｏ
ｌ／ｌ，ｐＨ８．０，ＥＤＴＡ５０ｍｍｏｌ／ｌ及び
０．５％トリトンＸ１００ ３０ｍｌ中に取りかつ超音
波で処理する。再び遠心分離し、再懸濁させかつ超音波
で処理する。この手順をなお２回繰り返す。引き続き、
遠心分離しかつそうして得られたペレットをＩＢｓとし
て例３で使用する。
【００４０】例３ 可溶化／復元 ａ）可溶化 可溶化緩衝液：グアニジン塩酸塩６ｍｏｌ／ｌ、トリス
緩衝液ｐＨ８．０ ６ｍｏｌ／ｌ、ＥＤＴＡ１ｍｍｏｌ
／ｌ、ＤＴＥ１００ｍｍｏｌ／ｌ（ジチオエリトリット
ール）。
【００４１】透析緩衝液１：グアニジン塩酸塩６ｍｏｌ
／ｌ、ＥＤＴＡ，ｐＨ３．０で３ｍｍｏｌ／ｌ。
【００４２】封入体１ｇを、可溶化緩衝液３０ｍｌに加
え、超音波で５分間均質化しかつ室温で１時間インキュ
ベートする。ＨＣｌを、ｐＨ値３．０が達成されるまで
加える。引き続き、不溶性物質を遠心分離する。
【００４３】透析緩衝液１に対して、ＤＴＥが完全に
（≦ＤＴＥ１ｍｍｏｌ／ｌ）除去されるまで透析する。
【００４４】ｂ）パルス再活性化： 復元緩衝液：アルギニン塩酸塩０．８ｍｏｌ／ｌ、トリ
ス緩衝液，ｐＨ８．０ ０．１ｍｏｌ／、ＧＳＨ０．５
ｍｍｏｌ／ｌ、ＧＳＳＧ０．５ｍｍｏｌ／ｌ、ＥＤＴＡ
１ｍｍｏｌ／ｌ。
【００４５】透析緩衝液２：トリス緩衝液，ｐＨ８．０
１０ｍｏｌ／ｌ、ＥＤＴＡ１ｍｍｏｌ／ｌ。
【００４６】パルス再活性化は、欧州特許出願第０２４
１０２２号明細書に記載されている。欧州特許出願第０
２４１０２２号明細書の第５図に記載の装置を使用す
る。
【００４７】このために、反応バッチ内の蛋白質濃度が
１パルス当たり５０μｇ／ｍｌだけ上昇するように、３
０分間の時間間隔で蛋白質を反応バッチ（復元緩衝液１
００ｍｌ）加える。計２０回パルスする（最終濃度：５
０μｇ／ｍｌ反応バッチ）。
【００４８】該再活性化後に、反応バッチから混濁物を
遠心分離しかつ全ての反応バッチを、アルギニンが除去
されるまで（≦５０ｍｍｏｌ／ｌ）、透析緩衝液２に対
して透析する。（該試験は、有利には伝導度測定により
行う。透析は、透析緩衝液と反応バッチの伝導度が一致
した場合に終了することができる。）活性度試験を用い
て測定した個々の構造のための再活性化収率は、第２表
に示す。
【００４９】
【表３】
【００５０】例４ Ｇ−ＣＳＦの活性度の測定 Ｇ−ＣＳＦの活性度は、Biochem. J. 253 (1988) 213-2
18, Exp. Hematol. 17(1989) 116-119, Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 83 (1986) 5010に記載されているよう
な、完全にＧ−ＣＳＦ依存性である、ネズミの白血病系
ＮＦＳ６０で試験する。細胞の因子依存性が維持される
ように、該維持培養の培地（ＲＰＭＩ培地、１０％子牛
の胎児の血清を有するBoehringer Mannheim GmbH, Bes
t. No.2099445）は永久的にＧ−ＣＳＦ１０００Ｕ／ｍ
ｌを含有する。
【００５１】この試験で直接3Ｈ−チミジンの導入によ
りＮＦＳ６０細胞のＧ−ＣＳＦ刺激増殖が測定される。
該試験は以下のように実施する：指数増殖期段階にある
ＮＦＳ６０細胞（細胞密度最大１×１０5細胞／ｍｌ）
を、マイクロ滴定量プレートに移し（１×１０4細胞／
ホール）かつ低下するＧ−ＣＳＦ濃度で培養する。ホー
ル１内の最大用量は、維持培養内の濃度に相当する（１
０００Ｕ／ｍｌ，比活性度１×１０8Ｕ／ｍｇ蛋白
質）。希釈は１０段階で行う。
【００５２】約２４時間のインキュベーション後に、3
Ｈ−チミジン（０．１μＣｉ／ホール）を加える。更
に、細胞をなお付加的に１６時間インキュベートする。
【００５３】試験の評価のためには、該細胞をマイクロ
滴定量プレート内で、溶菌されるように凍結させる。該
細胞リゼイトを、ガラス繊維フィルタに吸引し、洗浄
し、乾燥しかつシンチレーション計数管で測定する。3
Ｈ−チミジンの導入は、ＮＦＳ６０細胞のＧ−ＣＳＦ誘
導増殖に比例する。
【００５４】例５ １回の添加で変性蛋白質の濃度の依存した復元収率の測
定 出発物質；第２表の構造Ｎｏ．０，３，５及び８の封入
体。
【００５５】可溶化及び１回目の透析：ＩＢ材料を例３
に類似して可溶化し、還元剤を除去するために透析し、
引き続き３０ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度に調整した（M.M.
Bradford, Anal. Biochem. 72(1976), 255）。
【００５６】復元：再活性化は、アルギニン塩酸塩０．
８ｍｏｌ／ｌ又は０．２ｍｏｌ／ｌ、ＥＤＴＡ１０ｍｏ
ｌ／ｌ、ＧＳＨｍｍｏｌ／ｌ及びＧＳＳＧ０．５ｍｍｏ
ｌ／ｌ中で２０℃及びｐＨ８．０で行った。
【００５７】それぞれの復元バッチ内で、蛋白質濃度を
０．３〜３ｍｇ／ｍｌに調整した。グアニジン塩酸塩の
濃度は、全てのバッチ内で０．５５ｍｏｌ／ｌであっ
た。
【００５８】室温で３時間インキュベートした後に、反
応を酸性化（ｐＨ４．５）により停止させた。
【００５９】変性した蛋白質と復元した蛋白質の比を、
ＨＰＬＣにより確認した。
【００６０】展開緩衝液Ａ：０．１２％トリフルオル酢
酸（ｖ／ｖ） 展開緩衝液Ｂ：９０％アセトニトリル（ｖ／ｖ），０．
１％ トリフルオル酢酸（ｖ／ｖ） Ｂの勾配：４０〜７０％、３０分間で 流量：１ｍｌ／ｍｉｎ、２８０ｎｍで検出 結果は図１及び図２に示されている。
【００６１】例６ アルギニン濃度に依存した復元率 出発物質としては、例５に類似して製造した構造Ｎｏ．
０，３，５及び８（第２表）の透析した可溶化物（蛋白
質濃度１０ｍｇ／ｍｌ）を用いた。
【００６２】復元した蛋白質を１回添加することによ
り、復元緩衝液（アルギニン塩酸塩０〜０．８ｍｏｌ／
ｌ、トリス１００ｍｍｏｌ／ｌ、ＥＤＴＡ１０ｍｍｏｌ
／ｌ、ＧＳＨ０．５ｍｍｏｌ／ｌ、ＧＳＳＧ０．５ｍｍ
ｏｌ／ｌ、ｐＨ８で室温）内で１ｍｇ／ｍｌに調整し
た。
【００６３】３時間のインキュベート時間後に、反応酸
性化（ｐＨ４．５）により停止させた。引き続いての評
価は、例５に類自したＨＰＬＣにより行った。
【００６４】結果は図３に示す。
【００６５】例７ ０．２ｍｏｌ／ｌアルギニン緩衝液中での再活性化の動
力学的解析 出発物質：例６からの可溶化物を使用した。
【００６６】該再活性化は、アルギニン塩酸塩０．２ｍ
ｏｌ／ｌ、トリス１００ｍｏｌ／ｌ、ＥＤＴＡ１０ｍｍ
ｏｌ／ｌ、ＥＤＴＡ１０ｍｍｏｌ／ｌ、ＧＳＨ０．５ｍ
ｍｏｌ／ｌ、ＧＳＳＧ０．５ｍｍｏｌ／ｌ中で室温でｐ
Ｈ８で行った。該反応バッチ中の蛋白質濃度を、１回の
添加により１ｍｇ／ｍｌにかつグアニジン濃度を０．５
５ｍｏｌ／ｌに調整した。５，１０，１５，６０及び１
８０分後に、試料を取り出し、反応をそれぞれ酸性化
（ｐＨ４．５）により停止しかつ引き続きＨＰＬＣによ
り再活性化動力学的解析を行った（例５参照）。
【００６７】図４は、インキュベーション時間に依存し
た再活性化収率を示す。
【００６８】配 列 リ ス ト （ｉｉｉ）配列番号：１２ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に関する情報 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：２アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：に関する情報 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：８アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：に関する情報 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１０アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：に関する情報 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１０アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５：に関する情報 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１１アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６：に関する情報 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１４アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６： Met Thr Pro Leu Glu Glu Gly Thr Pro Leu Pro Arg Pro Pro １ 5 10 （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７：に関する情報 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：９アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８：に関する情報 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１３アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８： Met Lys Ala Lys Arg Phe Lys Lys His Pro Arg Pro Pro １ 5 10 （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９：に関する情報 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１１アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０：に関する情報 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１６アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０： Met Thr Pro Lue Lys Ala Lys Arg Phe Lys Lys His Pro Arg Pro Pro １ 5 10 15 （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１：に関する情報 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 (2)SEQ ＩＤ ＮＯ：１２：に関する情報 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状
【図面の簡単な説明】
【図１】第２表の配列０に類似した配列（曲線１）、Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（曲線２）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５
（曲線３）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（曲線３）及びＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：８（曲線４）を含有する構造に関する復
元収率の濃度依存性（アルギニン濃度０．２ｍｏｌ／
ｌ）を示す。
【図２】第２表の配列０に類似した配列（曲線１）、Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（曲線２）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５
（曲線３）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（曲線３）及びＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：８（曲線４）を含有する構造に関する復
元収率の濃度依存性（アルギニン濃度０．８ｍｏｌ／
ｌ）を示す。
【図３】復元収率のアルギニン濃度に対する依存性（図
１及び図２に類似した曲線図）を示す。
【図４】復元収率のインクベーション時間に対する依存
性（アルギニン濃度０．２ｍｏｌ／ｌ、図１及び図２に
類似した曲線図）を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 カローラ ドニー ドイツ連邦共和国 シュタルンベルク ヴ ァルトシュミットシュトラーセ 15 (72)発明者 ライナー ルードルフ ドイツ連邦共和国 ヴァイルハイム フェ ルバーガッセ 17

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも部分的に不活性の形で存在す
    る組換え蛋白質を活性化する方法において、通常の可溶
    化及び／又は復元技術により、Ｎ及びＣ末端に２〜５０
    アミノ酸の長さを有する付加的なヘルパー配列を含有す
    る蛋白質活性化し、その際このヘルパー配列の相対疎水
    度が、 【表１】 に示した、個々のアミノ酸の相対疎水度の和として計算
    して、負の数値を有することを特徴とする、組換え蛋白
    質を活性化する方法。
  2. 【請求項２】 ヘルパー配列が、アミノ酸の数に対する
    相対疎水度の比の値−２．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ又はそれ
    以下を有する請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 ヘルパー配列と所望の蛋白質との間の移
    行部に切断部位を有する蛋白質を活性化する請求項１又
    は２記載の方法。
  4. 【請求項４】 切断部位がＩｇＡ−プロテアーゼ切断部
    位である請求項１から３までのいずれか１項記載の方
    法。
  5. 【請求項５】 以下に示す配列： 【化１】 を有するＮ末端ヘルパー配列を含有する蛋白質を活性化
    する請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
  6. 【請求項６】 顆粒細胞刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）又はそ
    の誘導体である蛋白質を活性化する請求項１から５まで
    のいずれか１項記載の方法。
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