CZ128098A3 - Polymorfní formy látek, podporujících sekreci růstového hormonu a farmaceutický prostředek s jejich obsahem - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká polymorfních forem látek, podporujícííM? sekreci růstového hormonu· a použitelných pro výrobu prostředků k urychleni růstu živočichů a v různých kombinacích také k dalším účelům, například k léčení osteoporosy.· Dosavadní stav techniky

Růstový hormon, který je vylučován hypofýzou, podporuje růst všech tkání v organismu, které jsou ještě schopné růstu. Mimoto je známo, že růstový hormon má následující? základní účinky na metabolické pochody v organismu:

1) zvyšuje rychlost syntézy bílkovin v buňkách·,

2) snižuje rychlost využití uhlohydrátů v buňkách,

3) zvyšuje mobilizaci volných mastných kyselin a využití mastných kyselin pro získání energie.

V případě, že je růstového hormonu nedostatek, mohou vznikat různé poruchy, jednou z nejzávažnějších je trpaslictví.

K uvolnění růstového hormonu je zriáina^č^ěrá^řada^pOstupů. Je například možno nepřímo vyvolat uvolnění růstového hormonu chemickými látkami, jako je arginin, L-3,4-dihydroxyfeny.lalanin, L-DOPA, glukagon., vasopressin, nebo j.e možno,.vyvolat insulinem hypoglykemii, mimoto zvyšuje ufolnění růstového hormonu také spánek a tělesné cvičení. Tyto účinky jsou nepřímo vyvolány patrně přes hypothalamus buď snížením sekrece somatostatinu nebo zvýšením sekrece známého hormonu GRF, uvolňujícího růstový hormon nebo neznámého, hormonu s obdobným účinkem¹.

V případech, .kdy je žádoucí zvýšit hladinu růstového hormonu v organismu se až dosud tento problém obvykle řeší, podáváním exogenního růstového hormonu, podávání, GRF nebo jiných peptidových látek, stimulujících produkci a/nebo uvolnění, růstového hormonu. Ve všech případech ,j.e vzhledem kípeptidové povaze uvedených látek.nutno' podávat, tyto látky injekčním.způsobem. Počátečním zdrojem růstového hormonu byla extrakce hypofýz z mrtvých těl. Takto získaný produkt byl velmi drahý a mimoto bylo jeho použití spojeno s ryžikem přenosu různých chorob. V poslední době je k dispozici rekombinantní růstový hormon, s jehož použitím již není spojeno riziko přenosu chorob. Jde však stále o velmi nákladný výrobek, který je nutno podávat injekcně nebo do nosu ve formě spreje. Mimoto byly vyvinuty další látky, které podporují uvolňování endogenního růstového hormonu.

Zvláště běží o některé spirosloučeniny, popsané v US patentovém spisu č. 5 536 716, v PCT patentové přihlášce WO 94/13696 a v publikaci Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 92, 7001 až 7005, červenec 1995 jako nepeptidové látky, podporující uvolnění růstového hormonu. Uvedené sloučeniny mají schopnost stimulovat uvolnění přírodního endogenního růstového hormonu a je tedy možno je využít k léčení stavů, při nichž je zapotřebí stimulovat produkci nebo sekreci růstového hormonu, například u lidí s nedostatkem přírodního růstového hormonů nebo’u hospodářských zvfřat~pěst ováných—— na žír nebo pro produkci vlny, kde stimulace produkce růstového hormonu vede k získání větších a produktivnějších hospodářských zvířat.

Z výhodných sloučenin, popsaných v uvedených' publikacích je možno uvést například spiro/3H-indol-3,4 -piperidin/—1 *-yl)karbonyl/-2-(fenylmethyloxy)ethyl/-2-amino-2-methy1propanamidmethansulfonát vzorce ; ·

US patentový spis Č. 5 536 716 a PCT patentová přihláška WO 94/13696 popisují způsob výroby uvedené látky (příklady 18, 19 a 55). Zvláště v příkladu 55 se uvádí, že sloučenina má po překrystalování ze směsi ethylacetátu, ethanolu a vody teplotu tání 166 až 168 °C. Tato látka byla později identifikována jako jedna z polymorfních forem, označovaná forma II. V Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 92, 7001 až 7005, červenec 1995 se uvádí, že tato látka, izolovaná ve formě monohydrátu má teplotu tání 168 až 170 °C, avšak uvádí se pouze velmi obecný postup pro výrobu této látky a vůbec se neuvádí, jakým způsobem bylo dosaženo Její krystalizace.

Při výrobě vhodných lékových forem mohou být důležité morfologické formy účinných látek vzhledem k tomu, že v případě, že morfolog3x’ka~forma není^sťala v průběRiTkTinTCkých“ ~ zkoušek a zkoušek na stálost, není možno srovnávat použité látky z různých šarží. V případě výroby farmaceuticky účinné látky pro další použití je důležité identifikovat její .. c,morfologickou. formu v. každé lékové formě rak, aby bylo mož- . no ověřit, že v každé lékové formě je přítomna stejná forma a stejné množství účinné látky. Z těchto důvodů je nejprve nutno zjistit, zda se účinná látka vyskytuje v jediné formě nebo v několika· morfologických formách. Mimoto mohou mít • · »*

- 4 - · J některé morfologické formy vyšší termodynamickou nebo hygroskopickou stálost a mohou být vhodnější pro použití ve farmaceutických prostředcích než jiné formy. Pod pojmem polymorfní forma chemické sloučeniny se rozumí tatáž chemická látka v různých krystalických uspořádáních.

« , Podstata vynálezu ji .......

: . -....... |

Podstatu vynálezu tvoří polymorfní formy N-/1-(R)-/ (1,2-dihydro-l-methansulfonylspiro/3H-indol-3,4 -piperidin/ -1'-yl)karbonyl/-2-(fenylmethyloxy)ethyl/-2-amino-2 -methylpropariamidmethansul.fonátu, způsob výroby těchto polymorfních forem a farmaceutický prostředek s obsahem těchto látek.

Farmaceutické prostředky obsahují svrchu uvedenou látku jako svou účinnou složku a jsou použitelné v případě různých onemocnění. Polymorfní formy podle vynálezu podporují vylučování růstového hormonu a je tedy možno je použít u domácích zvířat, chovaných na žír k podpoře růstu a pro účinnější chov. U člověka je možno uvedené formy použít v případech příliš nízké sekrece růstového hormonu a k léčení chorobných stavů, které mohou být zlepšeny anabolickým působením růstového hormonu.

----— ---------------------Pol-ymorfní—formy-pod-l-e-v-y-nálezu~maj.í-.v.e_sro_vnání„s______„ ...........

jinými známými formami téže sloučeniny tu výhodu, že mají * vyšší thermodynamickou stálost a jsou tedy vhodnější pro použití ve farmaceutických prostředcích.

N-/1(R)-/(1,2-dihydro-l-methansulfonylspiro/-3H-indol-3,4'-piperídin/-l-yl)karbony1/-2-( fenylmethyloxy)ethyl/-2-amino-2-methylpropanamidmethansulfonát je možno vyjádřit vzorcem • 0

Jde o látku, podporující sekreci a uvolnění růstového hormonu u člověka i u jiných živočichů. Tuto vlastnost je možno využít k podpoře růstu hospodářských zvířat, chovaných na žír a u člověka k léčení stavů, u nichž dochází ke snížení sekrece růstového hormonu a také ke zlepšení stavů, u nichž je možno využít anabolických účinků růstového hormonu.

Polymorfní formy, které budou dále označovány jako, forma I, forma II, forma III, forma IV, forma V, forma VI, forma VII, forma VIII, forma IX a forma X mají výhodnější vlastnosti ve srovnání s ostatními krystalickými formami uvedené látky a jsou tedy vhodnější pro použití ve farmaceutických prostředcích.. Výhodnou krystalickou formou pro farmaceutické použitíje-forma I vzhledem ke své thermodynamické stálost i a také k tomu, ’ žé~rí ění”' hygros kop ic kaV~D al·^ ~ ší výhodnou krystalickou formou pro farmaceutické využití je forma IV, která je zvláště vhodná pro použití při výrobě lisovaných tablet. Forma IV má vyšší sypnou hmotnost než ostatní formy.

Podstatu vynálezu tvoří také způsob výroby formy I

N-/l(R)-/(1,2-dihydro-l-methansulfonylspiro/-3H-indol-3,4'• · • · ·

-piperidin/-l'-yl)karbonyl/-2-(fenylmethyloxy)ethy1/-2-amino-2-methylpropanamidsulfonátu, tento postup spočívá vtom, že se na roztok volného N-/1-(R)-/(1,2-dihydro-l-methansulfonylspiro/-3H-indol-3,4'-piperidin/-l -yl)karbonyl-2-(fenylmethyloxy)ethyl7-2-amino-2-methylpropanamid v- e thy láce tátu, obsahujícím přibližně S % objemových ethanolu působí přibližně 1,1 ekvivalentem kyseliny methansulfonové· s-teplotou přibližně 50-°C, směs se zahřeje přibližně., na 55 °C a pak sé zchladí na přibližně 45 °C.

Popřípadě je pak ještě možno teplotu zvýšit přibližně, na 51 °C a na této teplotě směs udržovat po dobu 2 až 24 hodin.

Součást podstaty vynálezu tvoří také další postup pro výrobu svrchu uvedené formy I, který spočívá v tom, že se k roztoku volného N-/1(R)-/(1,2-dihydro-l-methansulfonylspiro/-3H-indol-3,4'-piperidin/-1'-yl)karbony1/-2-( feny lmethyloxy)ethyl/-2-amino-2-methylpropanamidu v ethylacetátu s obsahem přibližně 8 % objemových,ethanolu při teplotě 50 až 55 °C střídavě přidává, přibližně 1,1 ekvivalentu kyseliny methansulfonové a forma I N-/1(R)-/(1,2-dihydro-l-methansulfbnylspiro/.A.

_„.^3H.-indo.l=3.,j4L=p.ipe.r4din/j₌yljRarjDo.nyJ./ý^2^Cfenylmethyloxy) ethyl/-2-amino-2-methylpropanamidmethansulfonátu, přičemž pořadí přidávání není kritické, načež se směs zahřívá na přibližně 55 °C po dobu přibližně až'15'hodin, pak se zchladí na přibližně 25' až 30 °C a ¹ při této teplotě se nechá stát 2 až 3 hodiny.

Součást'podstaty vynálezu tvoří také další možný postup :pro /výrobu svrchu uvedené formy I, .který spočívá ;v toni,-.

• ι·* • ·· že se míchá roztok formy II N-/l-(R)-/(l,.2-dihydro-l-methansulfonylspir-/3-indol-3,4'-piperidiny-l -yl)karbonyl/-2-(fenylmethyloxy)ethyl/-2-amino-2-methyIpropanamidrněthansulfonátu v isopropanolu při teplotě přibližně 25 °C po dobu 2 až 24 hodin.

Součást podstaty vynálezu tvoří také způsob výroby formy II N-/1-(R)-/(1,2-dihydro-l-methansulfonylspiro/-3H-indol-3,4'-piperidin/-1'-yl)karbony1/-2-(fenylmethyloxy)ethyl/-2-amino-2-methylpropanamidmethansulfonátu, který spočívá v tom, že se na roztok volného N-/l(R)-/(l,2-dihydro-l-methansulfonylspiro/-3H-indol-3,4'-piperidin/^l'-yl)karbonyI/-2-(fenylmethyloxy)ethyl/-2-amino-2-methylpropanamidu v ethylacetátu, obsahujícím přibližně 8 % objemových ethanolu puso-_f bí přibližně 1,1 ekvivalentem kyseliny methansulfonové při teplotě přibližně 50 °C, pak se roztok zahřeje na přibližně 55 °C, načež se zchladí na teplotu místnosti.

Součást podstaty vynálezu tvoří dále způsob výroby formy IV N-/l-(R)-/(l,2-dihydro-l-methansulfonylspiro/-3H-indol-3,4'-piperidin-/1'-y1)karbony1/-2-(fenylmethyloxy)ethyl/-2-amino-2-methylpropanamidmethansulfonátu, který spočívá v tom, že se rozpustí N-/l(R)-/(l,2-dihydro-l-methansulfonylspiro/--------^3H--indo.L^3,4Apip.eT.i.dinZjzlAylJ_karbpnylZ^2_zU^ylin^yloxý2-„_^ -ethyl/-2-amino-2-methylpropanamidmethansulfonát v některé z morfologických forem v roztoku ve směsi ethanolu a vody, s výhodou v objemovém poměru 25 : 75, rozpouštědlo se z roztoku odpaří, s výhodou při teplotě 40 °C, pevný podíl se umele na jemný prášek a · · · · 4 • 4 ' »4 44 • 4 · 4 • 4 '4;

relativní vlhí možný způ• · ·

4

Φ · • 4 · •••4 ·

- 8 získaný pevný prášek se nechá stát při kosti přibližně 75 %,

Součást podstaty vynálezu tvoří také d i sob výroby formy IV N-/l-(R)-/(l_ř2-dihydro-l-methansulfonylspiro/-3H-indol-3,4'-piperidin/-l'-yl)karbony1/-2-(fenylmethyloxy)ethyl/-2-amino-2-methylpropanamidmethansulfonátu, který spočívá v tom, že se nechá překrystalovat roztok N-/1(R)-/(1,2-dihydro-l-methansulfonylspiro/-3H-indol-3,4 -piperidin/-l'-yl)karbonyl/-2-(fenylmethyloxy)ethyl/-2-amino-2-methylpropanamidmethansulfonát s libovolným morfologickým složením ze směsi ethylacetátu, ethanolu a vody, . s výhodou v objemovém poměru 24,8 : 1,6 : 1,95.

Součást podstaty vynálezu tvoří také další postup pro výrobu formy IV.N-/l(R)-/(l,2-dihydro-l-methansulfonylspiro/-3H-indol-3,4'-piperidin/l'-yl)-karbony1/-2-(fenylmethyloxy)ethyl/-2-amino-2-methylpropanámidmethansulfonátu, který spočívá v tom, že se forma I této látky vystaví působení relativní vlhkosti vyšší než 75 %, s výhodou působení realtivní vlhkosti přibližně 88 % při teplotě místnosti po dostatečně dlouhou dobu.

Podstatu vynálezu tvoří také ještě další způsob výroby formy IV N-/1(R)-/(1,2-dihydro-l-methansulfonylspiro/-3Hindol -3y4“-pí pe rí-d-in-/—1— -yD-karbony-l·/--2-- (-f eny-lme.thyl.oxy) - _ ethyl/-2-amino-2-methylpropanamidmethansulfonátu, který spočívá v tom, že se tato forma izoluje ze suspenze formy I této látky ve směsi isopropylacetátu a ethanolu v objemovém poměru 90 : 10 s.obsahem přibližně 2,8 % hmotnostních vody při teplotě přibližně 25 °C.

Součást podstaty vynálezu tvoří také způsob výroby formy V N-/1(R)-/(1,2-dihydro-l-methansulfonylspíro/-3H* ·

-indol-3,4'-plperidin/-l'-yl)karbonyl/-2-(fenylmethyloxy)ethyl/-2-amino-2-methylpropanamidmethansulfonátu, který spo čivá v tom, že se vystaví forma IV této látky relativní vlhkosti nižší než 30 % při. teplotě místnosti.

¹ -Součást podstaty vynálezu tvoří také způsob výroby . formy VI,N-/1(R)-/(1,2-dihydro-l-methansulfonylspiro/-3H-indol-3,4'-piperidin/-l'-yl)karbonyl/-2-(fenylmethyloxy)ethyl/-2-amino-2-methylpropanamidmethansulfonátu, který spočívá v tom, že se suší forma V této látky v nepřítomnosti vody přibližně při teplotě místnosti, například pod dusíkem, vysušeným molekulovým sítem při teplotě přibližně 25 °C.

v

Součást podstaty vynálezu tvoří také způsob výroby formy VII N-/l(R)-/(1,2-dihydro-l-methansulfonylspiro/-3H-indol-3,4'-piperidin/-l'-yl)karbony1/-2-( fenylmethyloxy)ethyl/-r2-amino-:2-methylpropanamidmethansulfonátu, který spočívá v tom, že se tato látka izoluje ze suspenze formy I nebo formy IV uvedené látky ve směsi isopropylacetátu a ethanolu v poměru 90 : 10 (objemový průměr) s obsahem přibližně 1,5 % hmotnostních vody.

Součást podstaty vynálezu tvoří také způsob výroby formy VIII N-/1(R)-/(1,2-dihydro-l-methansulfonylspiro/-3H-indol-3,4'-piperidin/-l^J’-yl)karbonyl/-2-(fenylmethyloxy)-ethyl/-2-amino-2-methylpropanamidmethansulfonátu, při němž se dehydratuje forma VII této látky v atmosféře bezvodéhó inertního plynu, například v atmosféře bezvodého dusíku po dostatečně dlouhou dobu.

Součást podstaty vynálezu tvoří rovněž způsob výroby formy IX N-/l(R)-/(l,2-dihydro-l-methansulforiylspiro/-3H-indol-3,4'-piperidin-/l^<-yl)karbonyl/-2-(fenylmethyloxy)»··· ··

-10ethyl/-2-amino-2-methylpropanamidmethansulfonátu, který spočívá v tom, že se připraví roztok této látky ve vodě s jakýmkoliv morfologickým složením, načež se izoluje pevná látka, která se vytvoří řízeným odpařováním roztoku při relativní vlhkosti 20 % přibližně při teplotě místnosti.

Součást podstaty vynálezu tvoří také způsob výroby formy X N-/l(R)-/(l,2-dihydro-l-methansulfonylspiro/-3H-indol-3,4'-pipeiridn/-1'-yl)karbonyl/-2-(fenylmethyloxy)ethyl/-2-amino-2-methylpropanamidmethansulfonátu, který spočívá v tom,' že se suší forma IX uvedené látky při teplotě místnosti a vlhkosti okolí po dostatečně dlouhou dobu.

Součást podstaty vynálezu tvoří také další možný způsob výroby formy X N-/l(R)-/(l,2-dihydro-l-methansulfonylspiro/-3H-indol-3,4^<’-piperidin/-l-yl)karbonyl/-2-( f enylme thy losy )ethyl/-2-amino-2-methylpropanamidmethansulfonátu, při němž se vystaví forma I této látky působením 100% relativní vlhkosti na dobu přibližně 1 až 4 dny.

Součást podstaty vynálezu tvoří také způsob výroby morfologicky homogenního N-/l(R)-/(l,2-dihydro-l-methansulfonylspiro/-3H-indol-3,4-piperidin-/1'-yl)karbony1/-2-(fenylmethyloxy)ethyl/-2-amino-2-methylpropanamidmethansulfonátu kterýmkoliv ze svrchu uvedených způsobů.

Všechny svrchu uvedené nové polymorfní formy N-/1(R)-/(1,2-dihydro-l-methansulfonylspiro/-3H-indol-3,4^>-piperidin/-l'-yl)karbonyl/-2-(fenylmethyloxy)ethyl/-2-amino-2-niethylpropanamidméthansulfonátu jsou látky, zvyšující sekreci růstového hormonu, které je možno využít u hospodářských zvířet, chovaných na žír k podpoře jejich růstu a tím k dosažení vyšší efektivnosti produkce masa. U člověka je tyto látky možno • « • »·♦ • to • to ··

to

použít v případě stavů, při nichž je snížena sekrece růstového hormonu a také v případě stavů, u nichž je možno využít anabolického účinku růstového hormonu. Součást podstaty vynálezu tvoří také farmaceutický prostředek, který obsahuje svrchu uvedené polymorfní formy jako svou účinnou složku.

Údaje, získané v komoře pro diferenciální kalorimetrii DSC

Křivka pro formu I N-/l(R)-/(l,2-dihydro-l-methansulfonylspiro/-3H-indol-3,4'-piperidin/-l'-yl)karbonyl/-2-(fenylmethyloxy)ethyl/-2-amino-2-methylpropanamidmethansulfonátu při zvyšování teploty o 10 °C/min v otevřené nádobce pod dusíkem probíhá v průběhu tání jako jediná endothermní křivka s nejvyšší teplotou přibližně 180 °C a extrapolovanou teplotou při teplotě tání přibližně 170 °C, teplo, spojené s touto křivkou je přibližně 53 J/g.

Křivka·pro formu II N-/l(R)-/(l,2-dihydro-l-methansulfonylspiro/-3H-indol-3,4^,-piperidin/-l'-yl)karbonyl/-2-(fenylmethyloxy)-ethyl/-2-amino-2-methylpropanamidmethansulfonátu při zvyšování teploty o 10 °C/min v otevřené nádobce pod dusíkem probíhá v průběhu tání jako jediná endothermní křivka při nejvyšší teplotě přibližně 174 °C a extrapolované teplotě při teplotě tání přibližně 165 °C, teplo, spojené s touto křivkou je přibližně 37 J/g.

Křivka pro formu IV N-/1(R)-/(1,2-dihydro-l-methansulfonylspiro/-3H-indol-3,4 -piperidin/-1'-yl)karbony1/-2-(fenylmethyloxy)ethyl/-2-amino-2-methylpropanamidmethansulfonátu při zvyšování teploty o 10.°C/mih v otevřené ná. dobce pod dusíkem probíhá jako endothermní křivka, spojená se ztrátou vody při teplotě přibližně 45 °C a pak jako endothermní kčivka s nejvyšší teplotou přibližně 134 °C a

	•	♦
•	* ·	«	• · · ·
• « ·	9 «	• · · · ·
• ·« · ··	··	·« · ♦·

extrapolovanou teplotou pří teplotě tání přibližně 129 C vzhledem k tání formy VI, teplo, spojené s touto křivkou je přibližně 23 J/g.

Dále jsou uvedeny shrnuté údaje pro DSC, při nichž byl vzorek zahříván při zvyšování teploty o 10 °C/min pod dusíkem, uvedena je extrapolovaná teplota při počátku tání dané formy.

Forma I

Forma II

Forma VI

170 °C (endothermní křivka)

165 °C (endothermní křivka)

129 °C (endothermní křivka).

Forma I N-/l(R)-/(l,2-dihydro-l-methansulfonylspiro /3H-indol-3,4' -piperidin/-l '-yl)karbony 1/-2-( feny lmethyloxy)ethyl/-2-amino-2-methylpropanamidmethansulfonátu je bežvodá látka s teplotou tání 169 °C a s rozpustností v isopropanolu 4,6 mg/ml.

Forma II N-/l(R)-/(l,2-dihydro-l-methansulfonylspiro /3H-indol-3,4'-piperidin-/l'-yl)karbonyl-2-(fenylmethyloxy)ethyl/-2-amino-2-methylpropanamidmethansulfonátu je bezvodá látka, která má teplotu tání 158 °C a rozpustnost v isopropanolu 12,3 mg/ml.

Forma III N-/l(R)-/(l,2-dihydro-l-methansulfonylspiro/3H-indol-3,4'-piperidin/-l'-yl)karbonyl/-2-(fenylmethyloxy)ethyl/-2-amino-2-methylpropanamidmethansulfonátu je hydrát, charakterizovaný endothermní křivkou se ztrátou vody při prvním teplotním vrcholu 46 °C, · následovaným endothermní křivkou s táním a malým rozkladem při extrapolované teplotě počátku tání 123 °C.

- 13 /3H-inci ethyl/charakt prvním kou. prc ní 129

F.·· obsahuje

F /3H-incl'· ethyl/-: pický h;, děné for

Fc/3H-indc óxy)ethy vodá lát

Fc /3H-indc ethyl/-2 s~ ~ŠTřol·: vrcholu klad při podobně

Fc řo-/3H-i oxy)-eth vodá lát

IV N-/1(R)—/(1,2-dihydro-l-methansulfonylspiro,4 —piperidin/1'-γ1)karbony1-/2-(fenylmethyloxy)ino-2-methylpropanamidmethansulfonátu Je hydrát, .ováný endothermní křivkou se ztrátou vody při .otním vrcholu 45 °C s následnou endothermní křiví a rozklad s extrapolovanou teplotou počátku tá□ravděpodobně v důsledku tání a rozkladu formy VI).

a IV uvedené látky je hygroskopický hydrát, který ,5 mol vody na mol uvedené látky.

.V N-/1(R)-/(1,2-dihydro-l-methansulfonylspiror i,4'-piperidin/-l'-yl)karbonyl/-2-(fenylmethyloxy):iino-2-methylpropanamidmethansulfonátu je hygroskoát, obsahující jeden mol vody na 1 mol svrchu uveV.

a VI N-/1(R)-/(1,2-dihydro-l-methansulfonylspiro3,4 -piperidin/-l -yl)karbonyl/-2-(fenylmethyl-2-amino-2-methylpropanamidmethansulfonátu je bezs teplotou tání 129 °C.

a VII N-/l(R)-/(1,2-dihydro-l-methansulfonylspiro3,4'-piperidin/l'-yl)karbony1/-2-(fenylmethyloxy)mino-2-methylpropanamidmethansulfonátu je hydrát '^-ěndoťRermní~kriAřkou 'šé¹·'žťráYotFvody pri~teplotním’ °C a následnou endothermní křivkou pro tání a roz.ítrapolované teplotě počátku tání 144 °C (pravděíůsledku tání a rozkladu formy VIII).

a VIII N-/1(R)-/(1,2-dihydro-l-methansulfonylšpi?l-3,4'-piperidin/l'-yl)karbohyl/-2-(fenylmethy1/-2-amino-2-methylpropanamidmethansulfonát je bezs teplotou tání 144 °C.

• ♦

Forma X N-/1(R)-/(1,2-dihydro-l-methansulfonylspiro-/3H-indol-3,4'-piperidin/-1'-yl)karbonyl/-2-(fenylmethylř? oxy)ethyl/-2-amino-2-methylpropanamidmethansulfonátu je v v ^{: 1,1} charakterizována širokou endothermní křivkou pří ztrátě vody při teplotním vrcholu 49 °C.

Difrakce v rtg-záření, XRPD Difrakce v rtg-záření je široce využívána k osvětelní molekulové struktury, krystalické formy a polymorfia různých látek. Zkoušky byly prováděny při použití přístroje Philips APD3720, jde o automatické zařízení, při němž bylo užito záření Kalfa mědi. Měření bylo prováděno od 2 do 40° (2 theta), vzorek byl udržován na teplotě místnosti.

Pro formu I byly získány následující hlavní hodnoty ohybu 6,5, 14,7, 16,9, 17,1, 17,9, 19,5, 21,1, 21,7 a 22,0° (2 theta).

Pro formu II byly získány následující hlavní hodnoty Ohybu 4,8, 11,8, 17,5, 19,4, 21,6, 21,9, 22,5 a 22,7° (2 theta).

Pro formu III byly získány následující hlavní hodnoty Ohybu 13,8, 14,1, 18,0, 18,8, 19,5, 20,1, 20,6, 21,8 a 25,7° (2 theta).

Pro formu IV byly získány následující hlavní hodnoty ohybu 16,0, 16,2, 18,3, 20,1, 21,0 a 24,2° (2-theta).

,Pro formu V byly , získány následující hlavní hodnoty ., ohybu 14,8, 17,1, 17,6, 19,0, 19,1, 19,4, 20,6, 21,5 a 21,8° (2 theta).

..Pro formu VI byly získánynásledující hlavní hodnoty ohybu 9,8', 14,0, 14,8, 17,1, 17,6, 19,0, 19,5, 20,6 a 21,6° (2 theta).

- 15 Pro formu VII byly získány následující hlavní hodnoty Ohybu 9,1. 11,3, 17,1, 17,4, 20,0, 22,1 a 24,5° (2 theta).

Pro formu VIII byly získány následující hlavní hodnoty ohybu 11,5, 11,6, 18,1, 19,6, 22,5, 24,7 a 24,8° (2 theta).

Pro formu IX, byly získány následující hlavní hodnoty ohybu 8,0, 12,1, 15,3, 15,8, 19,6, 19,7, 21,1, 22,3 a 23,7° (2 theta).

Pro formu X byly získány následující hlavní hodnoty ohybu 15,5, 15,8, 18,0, 18,4, 18,6, 19,4, 20,7, 20,8, 23,9 a 24,8° (2 theta).

Svrchu uvedené hodnoty prokazují, že všechny uvedené formy I až X jsou odlišné krystalické formy.

Mikroskopické sledování .

Polymorfní formy byly sledovány při zvětšení lOOx v běžném i v polarizovaném světle. Forma I a forma II tvoří jehličkovité částice a obě tyto formy jsou v polarizovaném světle dvojlomné.

Hygroskopičnost

Celkový obsah těkavého podílu (při stanovení analýzou TGA) pro pevné vzorky forem I, II, III a IV po vystavení různým hodnotám řízené vlhkosti je shrnut v následující tabulce. Bylo prokázáno, že forma I obsahuje 0,79 % hmotnostních vody, forma II obsahuje 0,56 % hmotnostních vody, forma III obsahuje 4,5 až 5,0 % hmotnostních vody a forma IV obsahuje 9,5 až 10,0 % hmotnostních vody.

- 16 Hygroskopičnost byla sledována uložením pevných látek v uzavřeném prostoru se stálou relativní vlhkostí. Při srovnání bezvodých forem I a II při teplotě místnosti bylo zjištěno, že forma II je hygroskopická a přijímá velké množství vody od relativní vlhkosti 65 %. Příjem vody ve větším množství není možno prokázat pro formu I s výjimkou případů, kdy byla skladována při relativní vlhkosti vyšší než 76 %. Zís·> · . kané výsledky jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2.

í 4'

Tabulka 1

Příjem vlhkostí při teplotě místnosti v průběhu 48 hodin

% RH	forma I % změny	forma II % změny
0	-0,0.2	+ 0,08
11	-0,05	+ 0,02
33	-	+ 0,33
47	+0,21	+0,39
65	+0,37	>io,oa
76	+0,12	>io,oa
1.0.0. m	>12,0	>io,oa,b

a vzorek se mění na gumovitou polotuhou látku b přeměna na formu IV působením vlhkosti okolí.

Údaje prokazují, že forma I uvedené látky je v podstatě bezvodá.

* * W WtfW»

4 4 4 · 9 4 4 • 4 4 4 4 4 Φφ 4 <

4 4 «« 4 4 4 4 4?

4444 44 4» »4 4·44

- 17 Tabulka 2

Příjem vlhkosti pří teplotě místnosti v průběhu 96 hodin % RH forma I , % změny

7	+0,4
22	+0,3
47	+0,5
68	+0,6
88	+12,9
100	+23,9

materiál.se roztěká.

RH = relativní .vlhkost.

Hydratované formy III a IV N-/1(R)-/(1,2-dihydro-l-methansulfonylspíro-/3H-indol-3,4'-piperidin/-! -yl)karbonyl/-2-(fenylmethyloxy)-ethyl/-2-amino-2-methylpropanamidu byly rovněž vyhodnoceny uložením při stálé relativní vlhkosti na dobu 48 hodin při teplotě místnosti. U formy III bylo možno pozorovat příjem vody po 48 hodinách při relativ... ....-------------------n-í vlhkosti· 33 %,-U-formy-IV-nedošlo. k.. pří jmu:., vyššího., množ-...

ství vody až do relativní vlhkosti 100 %, došlo však ke ztrátě hydratační vody při uložení při relativní vlhkosti 11 % nebo nižší. Získané výsledky Jsou shrnuty v následující tabulce 3, • « · · · · • · .♦·

- 18 -
T a b u 1	k a 3
Příjem vlhkosti při teplotě místnosti v	průběhu 48 hodin.
% RH	forma III % změny	forma IV % změny
0 .	-	1 -7,8 ’
11	-0,15	-4,9
33	+2,23	+0,3
47	+3,99	+0,7
66	-	+1,4
76	+3,76	+ 1,5
100	-	+5,3
Rozpustnost
Rozpustnost formy I v destilované vodě při teplotě místnosti je vyšší než 100 mg/ml. Rozpustnost formy II ve vodě při teplotě místnosti v roztoku, pufrovaném na pH 4 až 9 je rovněž vyšší než 100 mg/ml. Dále je uvedena rozpustnost formy I ve směsi ethanolu a vody.
ethanol/voda, %	rozpustnost, mg/ml
25/75		> 100
50/50		> 100
75/25		> 90
100% ethanol		> 90

• ·· · ··

- 19 Tepelná stálost

Stálost uvedených forem v pevném stavu byla sledována uložením ve skleněných lahvičkách se šroubovacím víčkem ve tmě. Vzorky byly analyzovány pomocí HPLC, původní látka byla analyzována kvantitativně. Byl použit následující postup:

sloupec; Beckman Ultrasphere ODS (250 x 4,5 mm, 5/u) mobilní fáze: 0,1% TEA, pH 4,0, H₃PO₄:acetonitril (65:35) rychlost průtoku: 1,0 ml/min detekce při: 228 nm doba průtoku: 14 minut teplota sloupce: teplota místnosti objem materiálu: 20/Ul roztoku N-/1(R)-/(1,2-dihydro-l-methansulfonylspiro-/3H-indol-3,4^,-piperidin/-l'’-yl)karbonyl/-2-(fenylmethyloxy)ethyl/-2- ς

-amino-2-methylpropanamidmethansulfonátu s obsahem 50 ^ug/ml.

Výsledky pro formu I a II jsou dále uvedeny v % hmotnostních počátečního množství.

Forma I - % počátečního množství

.....°C '6 ~ťýďnu ' ¹ '' 17 týdnu

	40	100,1	98,7
	60	100,7	101,3
	80	100,7	99,4

Forma II - % počátečního množství po týdnech

°C	1	2	4	8	12	24
40	99,7	100,7	99,5	-	íoo;i	100‘, 1
60	99,4	99,6	100,3	100,0	101,0	100,8
-80	—99-2—	—i-ee-r3-	-99v-2—	—99v8-	100,4	--

Získané výsledky prokazují, že čisté pevné formy I

- 20 a II mají dobrou tepelnou stálost.

Způsob výroby účinné látky je možno vyjádřit následujícím reakčním schématem:

SC.HEM/A .1

Pd/C, H₂.

DIEA thioánisol'

1b

*« • · · 4

- 21 Schéma I - pokrač.

x-yCO₂H NHBOC

DCC HOBT SO₂Me iPrOAc:H₂Ú

1) MsOH, EtOH

2)běžné zpracování

NHBOC

ÍPrOAciHzO

l

SO₂Me

• · • ♦· · • · Λ. · . ď,.¹ ·♦*'·· • * · · · · · * ·*· tr ·, • · · · · · * ♦ ·Γ · ' ···· ·♦ ·· ·· ·« ··

- 22 - ' 3 A

Jak je zřejmé ze schématu I, zpracovává se CBZ-spiro' Ai indolin před hydrogenací aktivním uhlím Darco (20 % hmotnostních). Hydrogenace se provádí v ethanolu při 65 °C.za energického míchání při použití 10% Pd/C.

Roztok sloučeniny lb v isopropylacetátu a vodě se nechá reagovat s běžně dodávaným N-BOC-O-benzyl-D-serinem v přítomnosti dicyklohexylkarbodiimidu DCC- a 1-hydroxybenzotriazolu HOBt. Po odfiltrování dicyklohexylmočoviny DCU jako vedlejšího produktu se dvoufázový filtrát rozdělí a organická vrstva se postupně promývá 1M vodným hydroxidem sodným, 0,5M vodnou kyselinou chlorovodíkovou a nakonec nasyceným vodným “ o 'l roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Zlepšených výsledků této vazby je možno dosáhnout tak, že se na roztok volné aminokyseliny ve směsi isopropylacetátu a vody působí DCC, HOBT a pak se přidá při teplotě místnosti aminokyselina a reakce se nechá probíhat 3 až. 5 hodin. Pak se směs zahustí ve vakuu a rozpouštědlo se vymění, místo isopropylacetátu se užije-ethanol. Změna rozpouštědla se obvykle provádí přidáním nového rozpouštědla v množství, rovném trojnásobku objemu směsi, a , :

pak odpařením směsi na původní objem.

Ze sloučeniny vzorce 11 se odstraní skupina BOC působením tří ekvivalentů kyseliny methansulfonové MsOH v ethanolu při teplotě 35 až 40 °C. Pak se roztok dělí mezi iso. __p.ro.py.lac.e.tát™a_lM..„v.o.dný_roz.tok-hy-dEOxi.du_so.dného.,„.Čímž.„se„zí.s-_.-_x.ká sloučenina vzorce 12.

Tato látka se nechá reagovat s kyselinou N-BOC-alfa-aminoisomáselnou, reakce dobře probíhá ve dvoufázovém systému rozpouštědel, například ve směsi isopropylacetátu a vody 1 : 1 v přítomnosti 1,1 ekvivalentu DCC a HOBt. DCU se odfiltruje, vrstvy se oddělí a organická vrstva se postupně promývá 1M hydroxidem sodným, 0,5 M vodnou kyselinou chlorovodíkovou a nasyceným vodným hydrogenuhličitanem sodným, čímž se získá sloučenina vzorce 14.

«v w- .li * * * · Φ Φ * Φ Φ ! ·. φ ' ' • · » Φ Φ · Φ · Φ |? φ * _e »»*···» ··· φ< Φ φ φ· Φ · Φ Φ Φ φ ' ·

ΦΦΦΦ ·Φ ·· ·· ·· ΦΦ ί

- 23 - ......’Τ

Rozpouštědlo se nahradí ethanolem tak, aby bylo mož- ' J d no odštěpit skupinu Boc kyselinou methansulfonovou. Odstra- .. ’ není ochranné skupiny ze sloučeniny 14 je obtížnější než její odstranění ze sloučeniny vzorce 11, je nutno použít koncentrovaného roztoku kyseliny methansulfonové v ethanolu a teploty 35 až 40 °C. Pak se reakční směs extrahuje ethylacetátem s obsahem hydroxidu sodného a izoluje se volný. amin.vzorce 15.. Organická vrstva se dobře.'.promyje/1 Ni.....

hydroxidem sodným k zajištění úplného odstranění kyseliny methansulfonové.

Ethylacetátový roztok volné baze vzorce 15 v ethylacetátu se zahustí ve vakuu a pak se azeotropně vysuší až na hodnotu KF nižší než 500 mg/ml tak, že se přidají dva objemy směsi ethylacetátu a ethanolu 90 : 10 a pak dva objemy ethylacetátu. Výsledný bezvodý, mírně zakalený roztok volné' baze vzorce.16, v ethylacetátu se zpracovává působením 25 % hmotnostních aktivního uhlí Darco G-60 při teplotě místnosti na dobu 10 hodin. Pak se aktivní uhlí odfiltruje, čímž se získá volná baze vzorce 15.

Tvorba soli vzorce 16 s kyselinou methansulfonovou ze sloučeniny vzorce 15 se provádí v ethylacetátu působením 1,1 ekvivalentu MsOH při teplotě 50 °C. Volná baze vzorce 15 se zpracuje působením 8 % objemových ethanolu a jednoho ekv i v alentu vody a směs se zahřívá na 55 °C až do úplného r o z_^_ .

puštění. Zchlazením na teplotu místnosti a mícháním výsledné suspenze 4 hodiny se získá krystalická látka vzorce 16, jde o krystalickou formu II, jejíž rozpustnost v isopropylacetátu je 12 g/ml.

Přeměna formy II na formu I se uskuteční tak, že se sůl vytvoří ve směsi ethylacetátu a ethanolu jako svrchu, avšak místo zchlazení počátečního roztoku soli z teploty

• · ·«

θθ na teplotu místnosti se roztok zchladí jen na'45 °C.

Při této teplotě se počnou tvořit krystalky a suspenze v průběhu času zhoustne. Pak se teplota zvýší na 51 °C a při této teplotě se suspenze nechá stát přes noc. Tímto způsobem dojde k úplné přeměně na formu I sloučeniny vzorce 16.

φ φ φ φ φφ · ·

S výhodou se přeměna formy II na formu I provádí tak, že se k roztoku, volné baze ve směsi ethylacetátu a ethanolu při teplotě 50 až 55 °C přidají očkovací krystalky formy Ϊ a pak se směs nechá stát. Je možno postupovat tak, že se volná baze vzorce 15 uvede do styku s 1,1 ekvivalentem kyseliny methansulfonové v 8% ethanolu v ethylacetátu při teplotě 50 až 55 °C. Směs se pak naočkuje přibližně 2 % hmotnostními formy I methansulfonátu vzorce 16 a pak se nechá stát přes noc při teplotě 55 °C. Pak se směs zchladí na teplotu . .

místnosti a nechá se stát přibližně 2 až 3 hodiny. Produkt se oddělí filtrací při teplotě místnosti pod dusíkem, vysuší se při 35 °C've vakuu a prosévá sítem za vzniku methasulfonátu vzorce 16.

Sůl kyseliny methansulfonové vzorce 16 může také být vytvořena tak, že se střídavě postupně přidává-1,1 ekvivalentu MsOH a očkovacích krystalků formy I k roztoku volné baze ve směsi ethylacetátu a ethanolu při teplotě přibližně 50 °C, přičemž pořadí přidávání MsOH a očkovacích krystalků není kritické.

Využitelnost polymorfních sloučenin podle vynálezu jako látek, zvyšujících sekreci růstového hormonu je možno prokázat známými postupy, například podle publikace Smith a další, Science, 260, 1640 až 1643, 1993, zejména podle obr, 2 a příslušného textu v této publikaci. Při tomto postupu byly všechny polymorfní formy podle vynálezu účinné jako látky, zvyšující sekreci růstového hormonu. Je tedy možno považovat za prokázané, že polymorfní formy podle vynálezu zvyšují, sekreci přírodního, růstového, hormonu. . ...

• W · · * · ·

0 • 0 00 · ♦0·0

0 · 0 00 ♦

0 0 00

0· 00

Polymorfní látky podle vynálezu je možno využít in vitro jako velmi dobrý nástroj pro porozumění regulace sekrece růstového hormonu na úrovni hypofýzy. V těchto případech je nutno vyhodnotit velké množství faktorů, o nichž je známo, nebo které pravděpodobně mohou ovlivnit sekreci růstového hormonu, jako jsou věk, pohlaví, výživa, koncentrace glukosy, aminokyselin a mastných kyselin, důležitý je také stav výživy, například hladovění. Mimoto je možno využít uvedené látky k vyhodnocení možné modifikace uvolnění růstového hormonu jinými hormony. Bylo již například prokázáno, že somatostatin brání uvolnění růstového hormonu. Z dalších hormonů, jejichž vliv na uvolnění růstového hormonu je důležitý a je ještě nutné jej úplně objasnit, je možno uvést pohlavní hormony, jako testosteron, estradiol a progesteron, hormony nadledvin, jako kortisol a další kortikoidy, epinefrin a norepinefrin, hormony slinivky břišní, a dalších částí zažívací soustavy, jako insulin, glukagon, gastrin a sekretin, některé vasoaktivní peptidy, jako bombesin, neurokininy a hormony štítné žlázy, jako thyroxin a trijodthyronin. Polymorfní sloučeniny podle vynálezu je také možno použít ke sledování negativních nebo positivních zpětných vazeb hormonů hypofýzy, například růstového hormonu a peptidů typu endorphinu na hypofýzu k modifikaci uvolnění růstového hormonu. Zvláštní zájem vědeckých pracovníků se soustředí na použití uvedených látek k osvětlení subcellulárního mechanismu, kterým je ovlivněno uvolnění růstového hormonu.

Polymorfní látky podle vynálezu je možno podávat in vivoživočichům včetně člověka k uvolnění růstového hormonu. Je například možno tyto látky podávat hospodářským zvířatům, jako vepřům, Skotu, ovcím a podobně 1c urychlení rychlosti růstu a ke zvýšení jejich konečné hmotnosti, pro .zlepšené využití krmivá a ke zvýšení produkce mléka. Mimoto ♦ · >; · • · .- · ·

• · · «· · • · · · · · ·

je možno uvedené látky použít in vivo jako diagnostický prostředek k přímému stanovení, zda je hypofýza schopna uvolňovat růstový hormon. Je například možné podávat uvedené látky in vivo a před i po podání odebírat vzorky sera a v těchto vzorcích stanovit koncentraci růstového hormonu. Srovnáním množství růstového hormonu v těchto vzorcích je pak možno získat přímý obraz schopnosti hypofýzy uvolňovat růstový hormon.

Jak již bylo uvedeno, tvoří součást podstaty vynálezu také farmaceutický prostředek, obsahující jako svou účinnou složku alespoň jednu polymorfní látku podle vynálezuspolu s farmaceutickým nosičem nebo ředidlem. Farmaceutický prostředek může případně obsahovat ještě další účinnou látku, například anabolickou látku, antibiotikum nebo látku pro léčení osteoporosy nebo také.kortikosteroid ke snížení katabolických vedlejších účinků.nebo jiné farmaceuticky účinné látky, zvyšující účinnost a snižující vedlejší účinky.

Z růstových a anabólických látek je možno uvést: TRH, diethylstilbestrol, estřogeny, beta-agonisty, theofyllin, anabolické steroidy, enkefaliny, prostaglandiny řady E, sloučeniny z US Č. 3 239 345, jako zeranol, sloučeniny z US č. 4 036. 979, jako sulbenox nebo také peptidy, popsané v US Č. 4 411 890.

Další možnou kombinací je kombinace sloučenin podle vynálezu s jinými látkami, zvyšujícími sekreci růstového . hormonu, . jako jsou GHRP-6 a GHRP-1popsané .v US 4 411 890 a ve zveřejněných přihláškách WO .89/07110, WO 89/07111 a B-HT92O a také hexarelin a GHRP-2 podle WO 93/04081, mimoto je možno použít hormon, napomáhající uvolnění růstového hormonu, označovaný GHRH nebo také GRF a jeho analogy nebo vlastní růstový hormon a jeho analogy a také somatomediny včetně

Ο v

• » ' 4 • V*·*9 • 4.Λ4 4 ···»,-. f • ·'.4 *9··

- 27 -’ t :Ή

IGF-1 a IGF-2 nebo alfa-adrenergní agonisty, jako clonidin nebo serotonin a také 5HTID agonisty, jako sumitriptan nebo látky, inhibující somatostatin nebo jeho uvolnění, jako jsou fysostigmin a pyridostigmin. Zvláště výhodné je použití sloučenin podle vynálezu v kombinaci s faktorem, uvolňujícím růstový hormon nebo jeho analogy, IGF-1 nebo IGF-2. Například je možno použít sloučeniny podle vynálezu spolu s IGF-1 pro léčení nebo prevenci obezity. Mimoto je například možno použít sloučeniny podle vynálezu spolu s kyselinou retinovou ke zlepšení stavu svalstva a pokožky v průběhu stárnutí.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu je možno připravit tak, že se polymorfní látky podle vynálezu zpracují s farmaceutickým nosičem nebo ředidlem.

Je známo, že možné použití růstového hormonu je velmi všestranné. Podávánísloučenin podle vynálezu může mít stejné účinky jako podávání vlastního endogenního růstového hormonu. Je tedy možno shrnout použití uvedených látek tak, že je možno je využít například ke stimulaci uvolnění růstového hormonu u starších osob, léčení nedostatku růstového hormonu u dospělých, k prevenci katabolických vedlejších účinků glukokortikoidů, k léčení osteoporosy, ke stimulaci imunitního systému, k urychlení hojení ran nebo hojení kostních- zlomenin, k léčení retardace růstu, k léčení akutního nebo chroni.ckého_.selhání„nebo„.nedo.s.tatečnos.ti.. l.e.dv.in.,. k. léčení malého_____________ vzrůstu, včetně dětí s nesotatkem růstového hormonu, léčení malého vzrůstu spojeného s chronickými chorobami, léčení obezity a opoždění růstu, spojeného s obezitou, léčení zpoždění růstu, spojeného se syndromem Prader-Willi a s Turnérovým syndromem, urychlení rekonvalescence a zkrácení doby hospi-. talizace u nemocných s popáleninami nebo závažnými chirurgickými zákroky, například na zažívací soustavě, léčení opoždění růstu plodů uvnitř dělohy a kostní dysplasií, léčení neúřopathií, k náhradě růstového hormonu u stresovaných . .

φ · ·· • «φ · φ

Φ Φ Φ ;

Φ· ·· « Φ·Φ • φ

nemocných, léčení osteochondrodysplasií, Noonanova syndromu, schizofrenie, deprese, Alzheimerovy choroby, zpomaleného i;>

i;>

léčení ran a psychosociální deprivacé, léčení plicní disfunkce včetně závislosti na umělém dýchání, snížení katabolické odpovědí po chirurgických zákrocích, léčení malt absorpčních syndromů, ke snížení tachexie a ztráty bílkovin při chronických onemocnění, například při rakovině nebo AIDS, k urychlení přírůstku na váže a vytváření bílkovin u nemocných s parenterální výživou, při léčení hyperinsulinemie včetně nesidioblastosy, k pomocnému léčení při pokusech o vyvolání ovulace a k prevenci a léčení, žaludečních a dva náctníkových vředů-, ke stimulaci vývoje brzlíku a k prevenci snižování funkce brzlíku s věkem, k pomocnému léčení nemocných s chronickou hemodialýzou, léčení nemocných s nedostatečností imunitního systému a k podpoře tvorby protilátek po očkování, ke..zvýšení počtu lymfocytů u Člověka a zvláště ke zvýšení , poměru· buněk T₄/T_g u nemocných s poklesem tohoto poměru například po traumatech, jako jsou uzavřené poranění hlavy nebo po infekcích, například bakteriálních nebo virových, zejména při infekci HIV, ke zlepšení síly svalů, pohyblivosti, k udržení dobrého stavu pokožky, metabolické homeostasy nebo ledvinové homeostasy u starších osob, ke stimulaci osteoblastů, růstu chrupavky a ke stimulaci imunitního systému u různých živočichů, včetně poruch při jejich stárnutí. Dále je možno tyto látky použít ke stimulaci

- - růstu -viny-Uovcív-ke-zvýšení—využití—krmivav-urych-leni- růs— tu, zvýšení produkce mléka a zlepšení kvality karkasu u hospodářských zvířat. Mimoto je ještě možno tyto látky použít k léčení onemocnění a stavů, které je možno upravit anabolickým účinkem růstového hormonu.

Zvláště užitečné mohou být sloučeniny podle vynálezu při léčení stavů ze skupiny osteoporosa, katabolická onemocnění, nedostatečnost imunitního systému-včetně onemocnění se sníženým poměrem, buněk Τ^/Τθ, zlomeniny kyčli, • e

- 29 poruchy kostního a svalového systému u starých lidí, snížená koncentrace růstového hormonu u dospělých nebo u dětí, obezita, kachexie a ztráta bílkovin v důsledku chronického onemocnění, například AIDS nebo zhoubných nádorů, a také k léčení nemocných, zotavujících se po rozsáhlých chirurgických zákrocích, poraněních nebo popáleninách.

Mimoto je možno nové sloučeniny podle vynálezu využít při léčení chorob, vyvolaných faktorem pro uvolnění kortikotropinu nebo u chorob, jejichž vznik je tímto faktorem usnadněn, při léčení poruch, souvisejících se stresem a úzkostnými stavy, včetně deprese a bolestí hlavy, k léčení poruch tlustého střeva, při poklesu imunity, u infekce HIV, při Alzheimerově nemoci, nemocech zažívací soustavy, anorexia nervosa, při hemorhagickém stresu, v případě abstinenčních příznaků po vysazení drog.nebo alkoholu, v případě-návyků na určité látky a při neplodnosti.,..

Je známo, že k léčení svrchu uvedených onemocnění a chorobných stavů se v současné době používá celá řada známých látek. Již svrchu bylo uvedeno, že v případě kombinace takových látek, z nichž některé již byly uvedeny, spolu s novými polymorfními látkami podle vynálezu je možno dosáhnout dalších a často synergních účinků při dosahování zvýšené rychlosti růstu, anabolických nebo jiných žádoucích ------účinků—těchto—látek-.—V—těch-to-komb-i-nacích-mohou-bý-t-známé— účinné látky a nové sloučeniny podle vynálezu přítomny nezávisle v množství jedné setiny až několikanásobku dávek, v nichž jsou tyto látky účinné v případě, že jsou použity jednotlivě.

Možnost kombinovaného léčení za účelem inhibice resorpce kostní tkáně, k prevenci osteoporosy a k urychlení hojení kostních zlomenin je možno ilustrovat na kombinaci ^bifosfonátů a sloučenin .podle vynálezu,, podporujících * 999

9 9 9 ;;*.%·‘ ··· · ·!-'>

e « · · · · ·· ·''·.

···· ·· ·* ·» ·· ·®

- 30 -'i •ΐ sekreci růstového hormonu. Použití bifosfonátů k uvedenému účelu je souhrnně popsáno například v publikaci Hamdy N.A.T.,*

Role of Bisphosphonates in Metabolic Bone Diseases, Trends in Endocrinol. Metab., 4, 19 až 25, 1993..Bisfosfonáty, vhodné pro toto použití zahrnují například alendronát, tiludronát, . dimethyl-APD, risedronát, etidronát, YM-175, clodronát, pa-, midronát, a BM-210995. V závislosti^:na účinnosti uvedených látek se denní dávka bisfosfonátů při perorálním podání pohybuje v rozmezí 0,1 mg až 5 g a denní dávka látek, podporujících sekreci růstového hormonu podle vynálezu se pohybuje v . rozmezí.0,01 mg až 20 mg/kg tělesné hmotnosti, tyto dávky je možno nemocným podávat k účinnému léčení osteoporosy.

V případě alendronátu se denní dávka 0,1 mg aŽ 50 mg při perorálním podání může pro efektivní léčení osteoporosy kombinovat s dávkou 0,01 mg až 20 mg/kg tělesné hmotnosti sloučenin podle. vynálezu ,, zvyšujících sekreci růstového hormonu. Při léčení osteoporosy a dalších poruch, kostního systému je také možno použít sloučeniny podle vynálezu v kombinaci s kalcitoninem, estrogeny, raloxifenem a látkami pro doplnění vápníku, například citronanem vápenatým.

Anabolické účinky, zvláště při léčení geriatrických nemocných mužského pohlaví je možno zajistit kombinací sloučenin podle vynálezu s anabolickými steroidy, například s oxymetholonem, methyltestosteronem, fluoxymesteronem a stanozololem.

; ..Sloučeniny podle, vynálezu mohou být-podávány perorálně., . parenterálňě,. jako.nitrosvalově,. intraperitoneálně,.nitrožllně, podkožní injekcí nebo ve formě implantátu, dále do nosu, pochvy, konečníku, pod jazyk nebo také místně. K tomuto účelu se sloučeniny podle vynálezu zpracovávají na lékové formy, vhodné pro Jednotlivé.způsoby podání.

Pevné lékové formy pro perorální podání zahrnují kapsle, tablety, pilulky, prášky a granuláty. V těchto pevných lékových formách še účinná látka mísí s nejméně jedním inertním farmaceuticky přijatelným nosičem, jako je sacharosa, laktosa nebo škrob. Tyto lékové formy mohou rovněž obsahovat, tak jak je to ve farmaceutických prostředcích běžné, ještě další látky kromě ..inertních ředidel, například kluzné látky, jako stearan hořečnatý. V případě kapslí, tablet a pilulek mohou lékové formy obsahovat také pufry. Mimoto je možno tablety a pilulky opatřit enterosolventním povlakem.

Kapalné lékové, formy pro perorální podání zahrnují farmaceuticky přijatelné emulze, roztoky, suspenze, sirupy, elixíry, tyto formy obsahují běžná inertní ředidla, například vodu. Mimoto mohou obsahovat další pomocné látky, jako smáčedla, emulgátory, .suspenzní činidla, sladidla, látky pro úpravu, chutí, a. parfémy..

Prostředky pro parenterální podání zahrnují sterilní vodné nebo nevodné roztoky, suspenze nebo emulze. Jako příklad nevodných rozpouštědel nebo nosných prostředí je možno uvést propylenglykol, polyethylenglykol, rostlinné oleje, jako olivový nebo kukuřičný olej, želatinu a organické estery, vhodné pro injekční podání, například ethyloleát. Tyto lékové ..formy mohou rovněž obsahovat pomocné látky, jako kon” zervační činí dTa, smáčedla; emulgátory a dispergační činidla. ~ Prostředky mohou být sterilizovány například filtrací přes filtr, zadržující bakterie, přidáním sterilizáčního činidla, ozářením prostředku nebo jeho zahříváním. Prostředky rovněž mohou být dodávány jako sterilní pevné látky, určené k rozpuštění ve sterilní vody nebo jiném sterilním prostředí pro injekční podání těsně před použitím.

Prostředky pro rektální nebo vaginální podání jsou s výhodou' čípky, obsahující kromě účinné látky pomocné látky, jako kakaové máslo nebo jiný základ pro výrobu čípků.

• Μ* • · · * · ο ♦ • · ·· ·> ·· ,ί

Prostředky pro podání nosní sliznicí nebo pod jazyk je rovněžm možno připravit při použití běžných pomocných látek.

Sloučeniny podle vynálezu se podávají člověku i jiným živočichům v dávkách, které zajistí optimální účinnost. Je zřejmé, že se dávka v každém jednotlivém případě může měnit ,,λ nejen v závislosti na zvolené účinné látce nebo lékové formě, nýbrž také na způsobu podání, na povaze léčeného onemocnění, •i na věku a celkovém stavu nemocného, na výživě a na dalších faktorech, které může vyhodnotit každý odborník. Výslednou denní dávku musí v jednotlivých případech vždy určit ošetřující lékař.

Dávkování účinné složky ve farmaceutickém prostředku podle vynálezu se může měnit, množství účinné složky v prostředku však musí být takové, aby bylo možno připravit vhodnou lékovou formu. Zvolená dávka závisí na požadovaném léčebném účinku, na způsobu podání a na celkové době podávání prostředku. K účinnému uvolnění růstového hormonu u člověka a jiných živočichů, například u savců se obvykle podávají denní dávky v rozmezí 0,0001' až 10 mg/kg tělesné hmotnosti, s výhodou 0,001 až 2.5 mg/kg a zvláště 0,01 až 10 mg/kg denně.

V následujících příkladech budou osvětleny různé způsoby pro přípravu polymorfních forem podle vynálezu. Příkla..... - dy -jsou určeny—k-i-lustraci -těchto-postupů·, -v-žádném směru -------------- však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu .

Přiklad 1

N-[1(R)-[(1,2-dihydro-l-metansulfonylspiro[3H-indol-3,4' piperidin]-1'-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2metylpropanamid

Část A: 1,2-dihydro-l-metansulfonylspiro[3H-indol-3,4'piperidin]hydrochlorid

Do roztoku 1,20 g (5,8 mmol) l'-metyl-l,2-dihydrospiro[3H-indol3,4'-piperidinu], jehož příprava je popsána H.Ongem a spol.v J.

.Med. Chem., 23, 981-98'6 (1983))' ve 20 ml bezvodého dichlormetanu se při teplotě 0°C přidá 0,90 ml (6,4 mmol) trietylaminu a 0,49 ml (6,35 mmol) metansulfoňylchloridu. Reakční směs se 30 minut míchá , vlije se do 15 ml nasyceného vodného roztoku uhličitanu sodného a dvakrát še extrahuje:. 10 ml dichlormetanu. Sloučené organické extrakty se promyjí 20 ml. nasyceného .roztoku chloridu sodného, suší se nad bezvodým uhličitanem draselným, filtruje se a rozpouštědlo se odstraní-za sníženého tlaku..Vznikne 1,44 g bledě žlutého oleje metansulfonamidu jako derivátu, který se bez dalšího čištění použije v následující syntéze.

Do roztoku surového produktu ve 20 ml bezvodého

1,2-dichloretanu se při teplotě 0°C přidá 1,0 ml (9,3 mmol)

1-chloretylchloroformátu. Reakční směs se 30 minut míchá při teplotě místnosti, ,a následně 1 hodinu při teplotě refluxu. Směs se zahustí přibližně na jednu třetinu objemu, a následně se zředí 20. .ml bezvodého metanolu.. Po 1,5 hodině zahřívání při teplotě refluxu se reakční směs zchladí na teplotu místnosti a zahustí se na přibližně jednu polovinu objemu. Sraženina se oddělí filtrací a promyje se malým množstvím studeného metanolu. Vznikne 1,0 g

-.bílé, pevné·, látky : jako piperidinhydrochloridu. ..Filtrát .se zahustí:

φφφφ φ φ

- 34 .....· - - i a přidá se malé množství nejprve metanolu, a následně eteru.

Sraženina se znovu oddělí filtrací, promyje se studeným metanolem .

a suší se za vzniku dalších 0,49 g požadovaného produktu. Celkem

-7“ vznikne 1,49 g výseldné sloučeniny s výtěžkem 70%.

^XH NMR (CDC1₃, 200MHz) 5 7-43-7.20 (m, 3H) , 7.10 (dd, IH) , 3.98 (bs, 2H), 3.55-3.40 (bd, 2H), 3.35-3.10 (m, 2H) , 2.99 (s, 3H), 2.15 (t, 2H), 2.00 (t, 2H).

Část B: .' N-[1 (R) - [ (1., 2-dihydro-l-metansulfonylspiro [3H-indol- .

3,4'-piperidin]-1'-yl)karbonyl]-1'-(fenylmetyloxy)- etyl]- 2-[(1,1-dimetyletoxy)karbonyl)amino-2-metylpropanamid

Do 0.35 g (1.15 mmol) (2R)-2-[{l,l-dimetyletoxy)karbonyl]-amino-3-[2-(fenylmetyloxy)etyl]-1-propanové kyseliny v 13 ml dichlormetanu se přidá 0,325 g (1,07 mmol) 1,2-dihydro-l-metansulfonylspiro [3H-indol-3,.4 '-piperidin].hydrochloridu, 0.18 ml (1.63 mmol) N-metylmorfolinu, O..159,g (1.18 mmol) 1-hydroxybenztriazolu (HOBT) a reakční směs se 15 minut míchá. Po přidání 0,31 g (1,62 mol) EDC se směs míchá další 1 hodinu a přidá se 60 μΐ N-metylmorfolinu. Reakční směs se míchá 45 minut, vlije se do 5 ml vody. Organický podíl se oddělí, promyje se 5 ml 0,5N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové a 5 ml nasyceného vodného roztoku uhličitanu sodného. Sloučené organické podíly se suší nad bézvodým'síraněmHóřěčiráťým~á''ž^Hušbi“sě~Tarvzniku 0, 627 g 'žluté pěny výsledného produktu, který se použije bez dalšího Čištěni v následujícím postupu.

Do 0,627 g (1,07 mmol) shora uvedeného produktu v 5 ml dichlormetanu se přidá 1,0 ml kyseliny trifluoroctové a reakční směs se při teplotě místnosti 75 minut míchá. Přidá se další 1,00 ml kyseliny trifluoroctové, reakční směs se 10 minut míchá, a pak se zahustí a zředí 5,0 ml dichlormetanu.. Po opatrném převedení na

- 35 zásadité pH vlitím do 10 ml 10% vodného roztoku uhličitanu sodného se organický podíl oddělí a vodný podíl se dále extrahuje dvakrát 15 ml dichlormetanu. Sloučené organické podíly se promyjí 5 ml vody, suší se nad uhličitanem draselným, filtruji se a zahustí za vzniku 0,486 g aminu jako světle žluté pěny, která se použije pro následující syntézu bez dalšího čištěni.

Do 0,486 g (1,01 mmol) aminu a 10 ml dichlormetanu se přidá 0,26 g (1,28 mmol) 2-[(1,1-dimetyletoxy)karbonyl]amino-2-metyl-propanové kyseliny,0.173 g - {1.28 mmol) 1-hydroxybenztriazolu (HOBT) a 0.245 g (1.28 mol) EDC a vytvořená reakční směs se míchá přes noc při teplotě místnosti. Reakční směs se .vlije do 5.0 ml vody a organický podíl se oddělí. Vodný podíl se dále extrahuje 5 ml·dichlormetanu. Sloučené organické podíly se promyjí 5,0 ml 0,5 N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové, 5 ml nasyceného vodného roztoku uhličitanu sodného, suší se nad bezvodým síranem .horečnatým. a., zahustí za vzniku 0,751 g surového produktu jako žluté pěny... Roztok tohoto produktu v dichlormetanu se po absorbci na 25 g silikagelu čistí chromatografií při eluci nejprve směsí hexanů, acetonu a dichlormetanu v poměru 70:25:5, a následně směsí hexanů, acetonu a dichlormetanu v poměru 65:30:5. Vznikne 0,63 g bílé pevné látky výsledné sloučeniny.

^XH NMR (CDC1₃, 400MHZ) Sloučeninaje směsi rotamerů v poměru 3:2. 57.40-7.10 (m,6H), 7.06 (d,l/3H), 7.02 (t,l/3H), 6.90 (t, 1/3H), 6.55 (d,l/3H), 5.15 (m, IH), ^4.95 (bs71H),^4.63 (bd,l/3H), 4.57-4.40 (m, 2 2/3 H), 4.10 (bd,l/3H), 4.00 (bd, 1/3H), 3.82 (t,lH), 3.78-3.62 (m, 2H), 3.60-3.50 (m,lH), 3.04 (q,lH), 2.87(s,lH), 2.86 (s, 2H), 2.80-2.60 (m,lH), 1.90 (bs,lH),

2.85-2.75 (m,lH), 1.82-1.60 (m, 3H), 1.55-1.45 (m,lH), 1.45 (s,4H), 1.42 (s, 2H), 1.39 (s, 9H).

• · ·· • · ··· V’J ♦ · · · ·· · · ··· · Í · •-Λ • » o »*·· · · · _r. · W ··«··♦ ·· ·· ·· ·· RJ

- 36 - . I js

Část C: N-[1 (R) - [ (1, 2-dihydro-l-meta'nsulfonylspiro [3H-indol-.. J

3,4'-piperidin]-1'-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)-| etyl] -2-amino-2-metylpropanamidhydrochlorid 'J

Do 0,637 g (0,101 mmol) meziproduktu části B v 5 ml dichlormetanu se přidá 2,5 ml kyseliny triíluoroctové a reakční směs se 30 minut míchá při teplotě místnosti. Směs se zahustí na olej, zpracuje se v 10 ml etylacetátu a promyje se 8 ml 10% vodného roztoku uhličitanu sodného. Vodný podíl se dále extrahuje 5 ml etylacetátu. Sloučené organické podíly se promyji lOml vody, suší * .*J· . se nad síranem horečnatým, filtruji se a zahustí za vzniku 0,512 g volných baží jako bílé-pěny.

Do roztoku 0,512 g volných baží v 5 ml etylacetátu se při teplotě 0°C přidá 0,2 ml nasyceného roztoku kyseliny chlorovodíkové v etylacetátu a 1,5 hodiny se míchá. Bílá sraženina se oddělí filtrací pod dusíkem, promyje se eterem a suší se za vzniku .0,50, g”výsledné sloučeniny jako bílé pevné látky.

NMR (400MHz, CD₃OD) : Sloučenina je směsí rotamerů v poměru 3:2.

87.40-7.28 (m, 4H), 7.25-7.17 (m, 2H), 7.08 (t,l/3H),

7.00 (t,l/3H), 6.80 (d,l/3H), 5.16 (ddd, IH), 4.60-4.42 (m,3H),

4.05 (t, IH), 3.90 (bs, 2H), 3.83-3.70 (m, 2H), 3.30-3.15 (m,lH),

2.97 (s,lH),· 2.95 (s, 2H), 2.90-2.78 (m,IH), 1.96 (t,l/3H),

1.85-li65 (m, 4H), 1.63 (s, -2H), 1.60 (s, 4H).

Příklad 2

N-[1(R)-[(1,2-dihydro-l-metansulfonylspiro[3H-indol-3,4'piperidin]-1'-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2metylpropanamid « · gry «·»···· · « — 0/ ” ···· ·· *· ·· ·· «I

Část A: alylester kyseliny (2R) - [ [ [-2-(1,1-dimetyletoxy)karbonyl]amino]-2,2-dimetyl-l-oxoetyl]amino-2(fenylmetoxy)etyl]-1-propanové

Výsledná sloučenina se připraví z (2R)-2-[(l,l-dimetyletoxy)karbonyl]amino-3-(fenylmetyloxy)etyl-propanové kyseliny a alyl alkoholu vazebnou reakci v metylenchloridu za přítomnosti EDCa DMAP.

NMR (400MHz, CDC1₃) 87.25 (s, 5H), 5.8 (m,lH), 5.2 (dd, 2H), 5.0 (bs,lH), 4.7 (m, IH), 4.6 (m, 2H), 4.4 (dd, 2H), 3.9 (dd,IH), ,3.6 (dd,lH), 1.45 (d, 6H), 1.39 (s, 9H).

Část B: (2R)-[[[-2-(1,1-dimetyletoxy)karbonyl]amino]-2,2dimetyl-l-oxoetyl]amino-2-(fenylmetyloxy)-etyl)-1-propanová kyselina

Do míchaného roztoku 6,7 g (15,9 mmol) surového meziproduktu části A, 1,8 g (0,1 ekv.) tetrakis (trifenylfosfin)paladia a 1,25 g (0,3 ekv.) trifenylfósfinu se přidá 35 ml 0,5M roztoku 2-etylhexanoátu draselného v etylacetátu. Reakční směs se.1 hodinu míchá při teplotě místnosti v atmosféře dusíku, a pak. se zředí 100 ml eteru a vlije se do ledové vody. Organický podíl se oddělí a vodný podíl se okyselí přidáním 20% roztoku kyseliny citrónové. Po extrakci etylacetátem se extrakty promyji nasyceným .roztokem chloridu sodného, suší se nad síranem hořečnatým, fi^třúji''š¥~a’oďpař'uji'ža'vzniku'výsleďné sloučeniny jako pevné látky.

^LH NMR (400Hz, CD₃OD) 8 7.3 (s, 5H) , 4.7 (m, IH) , 4.5 (s, 2H) , 4.0 (m,lH), 3.6 (m, IH), 1.4 (d, 6H), 1.3 (s, 9H).

Část C: N-[1(R)-((1,2-dihydro-l-metansulfonylspiro[3H-indol3,4'-piperidin]-1'-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]2-[(1,1-dimetyl-etoxy)karbonyl]amino-2-metylpropanamid «

1-metansulfonylspiroé.

• * * · ·· · « ' · • · · · · * * • · ·· ·· · ·

1.44

3.78 mmol)

- 38 Do reakčního roztoku 1.0 g (3.44 mmol) [indolin-3,4'-piperidin]hydrochloridu, (2R)-[ [-2-(1,1-dimetyletoxy)karbonyl)amino]-2,2-dimetyl-l-oxoetyl]-amino-2-(fenylmetyloxy)etyl)-1-propanové kyseliny, 0.58 ml (5.20 mmol) N-metylmorfolinu a 0.58 g (3.78 mmol) 1-hydroxybenztriazolu (HOBT) v 50 ml dichlormetanu se přidá 1.03 g (5.20 mmol) EDC a reakční směs se 16 hodin míchá při teplotě místnosti. Směs se zředí 50 ml dichlormetanu a promyje se 50 ml vodného roztoku uhličitanu sodného, suší se -nad bezvodým síranem...horečnatým, filtruje se a zahustí. Vytvořený zbytek se po absorbci na 50 silikagelu čistí rychlou chromatografii za vzniku 2,148 g bezbarvé pěny výsledné sloučeniny s výtěžkem 90%.

^lH NMR (400MHz, CDC1₃) Sloučenina je směsí rotamerů v poměru 3:2. 6 7.40-7.10 (m, 6H), 7.06 (d,l/3H), 7.02 {t, 1/3H) , ’ 6.90 (t,l/3H)', 6.55 (d,l/3H), 5.15(m,lH), 4.95(bs,lH), 4.63 (bd,l/3H), 4.57-4.40 (m,2 2/3 H), 4.10 (bd,l/3H), 4.00 (bd,l/3H),

3.82 (t,lH.)., 3.78-3.62 (m,2H), 3.60-3.50 (m,lH), 3.04 (q,lH), 2.87 (S,1H), 2.86 (s,2H), 2.80-2.60 (m,!H), 1.90 (bs,lH),

2.85-2.75 (m, 1 H), 1.82-1.60 (m,3H), 1.55-1.45 (m,lH),

1.45 (s,4H), 1.42 (s,2H), 1.39 (s,9H).

Část D:' N-[l'(R) - [ (1,2-dihydro-l-metansulfonylspiro [3H-indol-- - -3.,4/--.piperidin]-lí.cy.l).karbonyl 1=2-,( fenylmetyloxy) etyl]-2-amino-2-metylpropanamidhydrochlorid

Do roztoku 2,148 g (3,41 mmol) meziproduktu části C v 10 ml dichlormetanu se přidá 5 ml kyseliny trifluoroctové. Směs se 1 hodinu míchá, zahustí se a převede na bazické pH přidáním 100 ml 5% vodného roztoku uhličitanu sodného a třikrát se extrahuje 50 ml dichlormetanu. Sloučené organické extrakty se promyjí 50 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, suší se nad bezvodým .V

• ·Μ ·· ··· ·· · · ····· • φ · · · · « φ • · ·· ·· ·· uhličitanem draselným, filtruje se a zahusti za vzniku bezbarvé pěny, Do roztoku této pěny ve 25 ml etylacetátu se při teplotě 0°C přidají 4 ml 1M roztoku kyseliny chlorovodíkové v etylacetátu. Sraženina se oddělí filtrací, promyje se nejprve etylacetátem a následně směsí etylacetátu a eteru v poměru 1:1 za vzniku 1,79 g bezbarvé pevné látky výsledné sloučeniny s výtěžkem 93%.

^XH NMR (400MHz, CD₃OD). Sloučenina je směsi rotamerů v poměru 3:2.

7.40-7.78 (m, 4H) , ¹7.25-7.17 (m, 2H)·, 7.08 (t,l/3H),

7,00 (t,l/3H), 6.80 (d,l/3H), 5.16 (ddd,lH), 4.60-4.42 (m, 3H) , 4.05 (t, IH), 3.90 (bs, 2H), 3.83-3.70 (m, 2H), 3.30-3.15 (m,lH), 2.97 (S,1H), 2.95 (s, 2H), 2.90-2.78 (m,lH), 1.96 (t,l/3H),

1.85-1.65 (m, 4H), 1.63 (s, 2H), 1.60 (s, 4H).

Příklad 3 ,N- [1 (R) - [ ( 1,2-dihydro-l-metansulfonylspiro[3H-indol-3,4 -piperidin]-1'-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-jnetylpropanamidmesylát

Výsledná sloučenina se připraví působením kyseliny metansulfonové na volné baze výsledné sloučeniny části D příkladu 5. Po krystalizaci ze směsi etylacetátu a etanolu a vody vznikne produkt' o^- teplotě tání 1-66-1-68 ^eC-.· Jde. o polymorfní...formu II, . .

která se určovala difrakcí RTG záření na práškovém materiálu s hlavními ohyby při 4.7, 11.6, 17.4, 19.2 a 21.6°(2 theta), Dále se určovala diferenciální kalorimetrii při stoupání teploty o 10°C/ min v otevřené nádobě pod dusíkem. Bylo možno pozorovat jedinou endotermni křivku s vrcholem při teplotě okolo 174°C a extrapolovaný počátek teploty tání okolo 165°C se spotřebou tepla přibližně 37 J/g.

·♦·· ·9

Příklad 4

N-benzylkarbamát kyseliny isonipekotové (3)

Výchozí sloučeniny:

....... ison-i-pekoto-vá...kyselina- (2) T.C.I. Benzylchloroformát (Schweitzerhall) Uhličitan draselný

^sj

4.02 kg (31.1 mol)

6.91 kg (40.5 mol)

10.1 kg (72.9 mol)

Voda

40.2 1

Ve 100 1 nádobě se.· čtyřmi: hrdly, mechanickým míchadlem a v atmosféře dusíku rozpustí ve 40,2 1 vody kyselina isonipekotová (2) a uhličitan draselný a roztok se zchladí na teplotu 10^OhC. Během přidávání benzylchlorformátu se teplota reakční směsi udržuje v rozmezí 9 až 14°C. Po ukončení adice se reakční směs ohřeje na teplotu 22 °C a 58 hodin se nechá stát. Adice se ukončí po 4 hodinách při pH bylo 9,0. Po 58 hodinách stání nedošlo ke změně- pH. ·-· ··· ................ .. . - .......

Reakční směs se přenese do extrakčního zařízení o objemu 200 1, promyje se třikrát 13 kg (15 1) isopropylacetátu (IPCA) a jedenkrát 12 1 etylacetátu. Vodný podíl se extrahuje 8 1 toluenu. Podle HPLC analýzy se po promytí obsah benzylalkoholu sníží z 3,8% na 1,4%.

Analytická HPLC: 25cm sloupec Dupont Zorbax RXC8, rychlost průtoku 1,5 ml/min, detekce při 254 nm; isokratická eluční směs obsahující 35% metylkyanidu MeCN a 65% 0,1% vodného roztoku •··9 99

kyseliny trihydrogenfosforečné; doba retence: (3) =6,9 minut, benzylalkohol = 3,3 minut, toluen = 17,3 minut.

Vodný podíl se okyselí na pH 1,8 přidáním 37% vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové, což vyvolá vývoj oxidu uhličitého, který je snadné udržet pod kontrolou. Přidávání kyseliny chlorovodíkové trvalo méně než 1 hodinu a vyžaduje 10 1 koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Vodný podíl se třikrát extrahuje 6, 61 toluenu, extrakty se suší s 2 kg síranu (sulfáte) sodného a filtrují-se přes vrstvu Solka-floc™·. Sloučené filtráty mají hmotnost 17,8 kg. Odpařováním dosucha vážených podílů filtrátu vznikne 7,89 kg surového karbamátu (3) s výtěžkem 97%. Filtráty se .po filtraci přes zabudovaný filtr s velikosti otvorů 10μ umístí do 100 1 nádoby. Extrakty se při teplotě menši než......

25°C zahustí při tlaku 1000 Pa na objem 18 1. Výsledná koncentrace karbamátu 3 je 440 g/1. Koncentrace toluenového filtrátu slouží k azeotropnímu odstranění posledních stop vody (konečný KF. = 170 mg/ml).. Výsledný produkt je z 99,1% čistý, obsahuje 0,9% plochý pod křivkou benzylalkoholu jako jedinou, přítomnou nečistotu.

Příklad 5

coci chlorid-N-benzylkarbamát isonipekotové kyseliny (4)

- 42	__	··.··.·: iš	”, · ’··· · 1 • · · .. ·· ··
Výchozí sloučeniny:
N-Benzylkarbamát
isonipekotové kyseliny (3)		7.89 kg	(30.0 mol)
v toluenu (molekulová hmotnost =	263.30)	v 17.9 1
Oxalylchlorid (molek. hmotnost =	126.93)	3.94 kg	(31.0 mol)
N,N-Dimetylformamid
(molekulová hmotnost = 73.10)		10 ml

Toluen

1

..-ii

Do roztoku výsledného benzylkarbamátu (3) předchozího příkladu v toluenu se přidá 5 ml Ν,Ν-dimetylformamidu a 10 1 toluenu. Během 20 minut se přidá oxalylchlorid a reakční směs se nechá 16 hodin stát při teplotě. 18’C v pomalém proudu dusíku. Následná H-P-LG analýza prokáže 1,3% nezpracované kyseliny karboxylové (3). Reakční směs se. ohřeje na 26’C, přidá se 5 ml N,N-dimet.ylformamidu a směs se nechám 2,5 hodiny stát. Reakce 1,0 ml podílu reakční směsi se ukončí přidáním 5,0 ml terc.butylaminu a analyzuje se.po odpařování pomocí HPLC.

Analytická HPLC: 25cm sloupec Dupont Zorbax RXC8, teplota.50°C, rychlost průtoku 1 ml/min, detekce při 220 nm; isokratická eluční směs obsahující. 42% metylkyanidu (MeCN) a 58% 0,1% vodného roztoku kyseliny trihydrogenfosforečné.

Tímto postupem se prokáže přetrvávání méně než 0,05% kyseliny (3) (vzorec A) a více než 3% plochy pod křivkou sloučeniny vzorce B (ví.ce.než—l-mol%-~(C0CT) ₂ )

CONH-t-Bu A

O^NH-t-Bu cr NH-t-eu * *

K odstranění 5 1 rozpouštědla se reakční směs zahustí při tlaku 1000 Pa a teplotě 20-25°C.

Typický HPLC výsledek roztoku koncentrovaného toluenu po ukončení reakce terč, butylaminem :

sloučenina doba retence % plochy pod křivkou

	kyselina karboxylová(3)	2,1	<0,5%
	benzylchlorid	7,3	<0,5%
·' *i,l	Cbz-t-butylkarboxamid A	11,0	>99%
	toluen	12,1	NA
	diterc.butyloxamid B	12,7	<0,5%

Příklad 6

CHO

Piperidin-4-karboxaldehyd-l-benzylkarbamát (5)

...Výchozí sloučeniny _________ _

N-Benzylkarbamát

isonipekotové kyseliny	(4)	3,38 kg (12,0 mol
v toluenu (molekulová hmotnost = 281.74)	v 5,54 kg
DIEA (KF = 18 mg/1)		1,55 kg (15,0 mol
10% Pd/C (KF < 20 mg/g)		101 g
thioanisol
(molekulová hmotnost =	124.21, d = 1.058)	0,56 g

• · · ···· ··

Do roztoku sloučeniny (4) v toluenu se přidá DIEA a thioanisol a v této směsi se uvede do suspenze katalyzátor. Reakční směs se ihned umístí do autoklávu o objemu 19 1 a hydrogenuje se při teplotě'20°C a tlaku vodíku 2800 kPa. Během 18 hodin se reakcí zpracuje 70% teoretického množství vodíku. Podíl směsi/ ve kterém je reakce přidáním terc.butylaminu ukončena, se sleduje analytickou HPLC, která prokáže 14,2% plochy pod křivkou přítomnosti kyselého chloridu (2). Podmínky pro HPLC odpovídají shora uvedeným podmínkám. Doba retence: (5) =8,1 minut.

Do hydrogenačniho zařízení se přidá obdobná suspenze

101 g katalyzátoru a 0,54 g thioanisolu ve 1375 ml toluenu. Po 23 hodinách hydrogenace se provede HPLC analýza podílu, ve kterém byla reakce ukončena přidáním terc.butylaminu. Podle HPLC zůstává 1,8% plochy pod křivkou kyselého chloridu. (2). Reakční směs se probublává dusíkem a katalyzátor a sraženina DIEA · HC1 se odstraní filtrací .přes Solka-.floc™. Filtrační koláč se promyj'e 10 1 toluenu.. Filtráty se: přes'zabudovaný filtr s velikostí otvorů 10μ přemístí do extrakčního zařízení o objemu 50 1 a dvakrát se promyjí-7,2 I 1M vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové a dvakrát 7,2 1 vody. Reakční směs se při 1000 Pa a teplotě 25-30°C i

Zahustí na zbytek o objemu 51.

Sloučenina Doba retence(min) % plochy pod křivkou karboxylová kyselina (3) 2.1<2 dimer (21) 6.6<1 aldehyd (5) 8.1>95

Podle HPLC je výtěžek aldehydu (3) 94%.

Příklad 7

CBZ-Spiroindolin (9)

Výchozí sloučeniny:

Piperidin-4-karboxaldehyd-l-benzyl kařbamát (5) v toluenu

Fenylhydrazin

Trifluoroctová: kyselina (TFA)

Hydroborát. sodný (NaBH₄)

Toluen

Metylkyanid

Metanol

1,71 kg (6.89 mol) v 21.4 kg

900 ml, 981 g (9.15 mol).

2.20.1, 3.26 kg (28.6 mol)

300 g. (7.93 mol)

34.4 kg

7.0 1

7.0 1

Roztok surového aldehydu- (5) předchozí části se přes filtr s vélikostí„otvorů 10μ přemístí do reakční nádoby o objemu 100 1, -vybavené.měděnou.manžetou pokrytou teflonem pro ^chlazení nebo ohřívání a mechanickým míchadlem. Po přidání 34,4 kg toluenu a 7 1 metylkyanidu se vytvořený reakční roztok zchladí na teplotu 0^áC. Po částech se přidá fenylhydrazin a během nepřetržitého probublávání dusíkem se teplota reakční směsi udržuje v rozmezí -1 až 3°C.

Fenylhydrazin se přidává tak dlouho, dokud TLC a HPLC neukazuje úplné spotřebovávání aldehydu (5) a malý přebytek (<5%) fenylhydrazinu.

- 46 Podmínky TLC: oxid křemičitý, E. Měrek Kieselgel G60 F254 0.25 mm; dietyleter/pentan (4/1); vyvíjecí směs: 0.5% sulfát cernatý, 14% molybdenan amonný v 10% vodném roztoku kyseliny sirové s následným zahříváním; Rf: aldehyd (5) = 0.52, fenylhydrazon (7) = 0.61, fenylhydrazin (6) = 0.21. HPLC podmínky: 25 cm sloupec Dupont Zorbax RXC8 při teplotě 30°C, rychlost průtoku 1.0 ml/min,

detekce při 254 nm; přehled gradientů koncentraci eluČní směsi:
Čas (min)	acetnitril : voda
0	57	: 43
10	65	: 35
15	75	: 25
18	75	: 25

doba retence: fenylhydrazin (6) =4.5 minut, toluen -7.2 minut, fenylhydrazon (7) =11.4 minut.

Reakční směs se nechá 30 minut stát při teplotě 0-2°C a při zachováni teploty v rozmezí 2 až 7^eC se přidá kyselina trifluoroctová. Reakční směs se ohřeje během 30 minut na teplotu 50°C, která se udržuje 17 hodin. Probublávání dusíkem reakční směsí se zastaví a udržuje se pouze pomalý proud dusíku. Barva během první hodiny při teplotě 5°C postupně tmavla na tmavě zelenou. Vytvoří se relativně malé množství bílé krystalické sraženiny(trifluoracetát amonný). Po 17 hodinách prokáže HPLC, _ή . jejíž podmínky odpovídají shora uvedeným, že reakční směs obsahuje 91,6 % plochy pod křivkou indoleninu a 1,5%

A nezpracovaného fenylhydrazonu. Stáním směsi po delší časový úsek se nezvýší výtěžek indoleninu (8).

Po zchlazení reakční směsi na 12’C se přidá 7,0 1 metanolu. Po částech menších než 20 g se přidá hydroborátu sodného tak, aby se teplota udržela pod·15“C. Tato adice probíhá 30 minut. V jejím průběhu se objeví mírný vývoj vodíku, který se snadno kontroluje. Během adice nedošlo k pěnění. Ke konci adice se barva rychle změní ze zelené na hnědou, a pak na jasně oranžovou. Oddělí se malé množství (<200 ml) těžší fáze (pravděpodobně vodný roztok soli). HPLC analýzou (podmínky shora uvedené) se prokáže spotřebováni veškerého množství indoleninu (8) (90,4 % plochy pod křivkou CBZ-indolinu (9)); doba retence: indolenin (8) =7.5 minut, indolin (9) = 8.2 minut.

TLC: etyleter jako rozpouštědlo, skvrna barviva obsahujícího sulfát čeřitý a molybdean amonný nebo skvrna 1% anisaldehydu; Rf: indolenin (8) = 0.18, CBZ-indolin (9) =0.33.

Ke konci reakce dojde ke změně reakční směsi ze zelené na oranžovou. Množství hydroborátu sodného, které je potřeba k ukončení reakce, je významně závislé na teplotě a na již přidaném množství. Množství a kvalita produktu není v konečném důsledku tímto ovlivněna.

Reakční směs se zchladí na 30 minut na teplotu 5°C, přidá se 8 1

I

3% vodného roztoku hydroxidu amonného, čímž se přivede pH vodného podílu na pH 7,4. Směs se míchá, a pak se nechá usadit. Teplota se zvýší na 15°C a oddělí se žlutě zakalený spodní vodný podíl. Organický podíl se promyje jedenkrát 413% vodného roztoku hydroxidu amonného, dvakrát 4 1 vody a dvakrát 4 1 nasyceného roztoku chloridu sodného. Po promytí vzniklo 53,5 kg organického podílu s výtěžkem 94%.

Promytý toluenový roztok se sloučí s promytými organickými pďdílydvou dalších-obdobně'vedených reakcí. ·Celkové množství aldehydu použité ve třech reakcích je 5,06 kg (20,5 mol). Celková hmotnost CBZ-indolinu (9) určená ze sloučených organických podílů je 5,91 kg (18.3 mol) s výtěžkem 90%. Sloučené organické podíly se suší s 5 kg sulfátu sodného, 30 minut se na ně působí 250 g aktivního uhlí zn. Darco G60 a filtrují se přes Solka-floc™’. Filtráty se zahustí ve vakuu při tlaku 1000 Pa a teplotě menši než 25°C téměř dosucha. Výměna rozpouštědla se ♦ · «·· · ♦· ·♦ · · provedše pomalým vlitím do 30 1 isopropylacetátu a zahuštěním na objem 14 1 při tlaku 2000 Pa a teplotě 50 až 60°C. Směs se zahřívá k teplotě refluxu za vzniku Čirého homogenního temně oranžového roztoku. Po výměně rozpouštědla tento roztok podle ^XH NMR obsahuje přibližně 6 mol% zbytkového toluenu.

Roztok se zchladí na 68°C a naočkuje se 4 g krystalického CBZ-indolinu (9). Roztok se nechá postupně během 6 hodin zchladit na teplotu 26 ^eC a· 9 hodin se nechá stát při teplotě 20-26^oC. Suspenze se přes 1 hodinu chladí na teplotu 2°C a 1 hodinu se nechá stát při teplotě 2°C. Produkt se oddělí filtraci a filtrační koláč se dvakrát promyje 2 1 isopropylacetátu o teplotě 5°C a dvakrát 2 1 MTBE o teplotě 5°C. Produkt se suší ve vakuové peci při teplotě 30°C a v atmosféře dusíku za vzniku 4,37 kg výsledné sloučeniny (9) jako světle žlutohnědé krystalické pevné látky s výtěžkem 74%.

Podle HPLC jde o produkt s čistotou 99,5 % plochy pod křivkou. Promývací podíly a 11 1 matečné kapaliny obsahují dalších 1,15 kg (19%) produktu (9) a přibližně 3% fenylhydrazidu kyseliny Cbz-isopekotové (doba retence =4,8 minut).

Příklad 8

CBZ-Spiroindolin-itietansulfonamid (1)

• ♦··

- 49 Výchozí sloučeniny:

CBZ-Spiroindolin (9)

Metansulfonylchlorid

Trietylamin (KF = 151)

Tetrahydrofuran (KF = 41)

1,69 kg (5,23 mol)

599 g (5.23 mol)

635 g (6.27 mol)

1

Nádoba o objemu 22 1 se naplní pevným CBZ-spiroindolinem (9), a pak se do této nádoby přes filtr o velikosti otvorů 10μ přidá 11,5 1 tetrahydrofuranu a trietylamin. Vytvoří se homogenní roztok, který se zchladí na teplotu 0°C. Kapací nálevka o objemu 1 1 se naplní metansulfonylchloridem a 500 ml tetrahydrofuranu. Tento roztok se přidává do reakční směsi při zachování její tepTotý*ý^Mrozmezí 0 až 4°C. Adice, která probíhá exotermicky, trvá. 5 hodin. Během přidávání se vytvoří bílá sraženina, pravděpodobně trietylamoniumhydrochlorid. Podle HPLC 'analýzy je reakce ukončena po ukončeni adice a není přítomen žádný

	CBZ-spiroindolin (9).	Podmínky HPLC: 25 cm sloupec Dupont Zorbax
	RXC 8, rychlost průtoku 1.5 ml/min, detekce při 254 nm; přehled
	gradientů koncentrací	eiuční směsi:
	Čas (min)	0,1% vodný roztok
		kyseliny trihydrogen-
		fosforečné : metylkyanid
	0	70 : 30
	10 .	70 : 30
	12	20 : 80
	25	20 : 80

doba retence: (9) =7,6 minut, (1) = 13,6 minut.

Po ukončení adice se reakční směs ohřeje na teplotu 18 °C a nechá se 16 hodin stát. Srovnáním vzhledu reakční směsi a výsledku HPLC po ukončení adice a po 16 hodinách stání se došlo k závěru, že nedošlo k žádným změnám. Reakční směs se během 1 hodiny pomalu přemísti do energicky míchaného roztoku 30 1 vody a 200 ml 37% vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové umístěného v 50 1 nádobě. Teplota nádoby se zvýší z 22°C na 28^ŮC. Produkt se oddělí jako bledě žlutohnědá pryžovitá pevná látka, která se změní na granulami pevnou látku. Vodná suspenze se zchladila na 22^eC a 1 hodinu se nechá stát. Suspenze se filtruje a filtrační koláč se dvakrát promyje 4 1 směsi metanolu a vody v poměru 50:50. Podle HPLC analýzy je přítomno v matečné kapalině méně než 0,1% CBZ-spiroindolin-metansulfonamidu (1).

Filtrační koláč se promyje 4 1 směsi metanolu a vody v poměru 50:50, která obsahuje 50 ml 28% vodného roztoku hydroxidu amonného. Filtrační koláč se promyje dvakrát 4 1 směsi metanolu a vody v poměru 50:50 a pevná látka se suší ve vakuové peci v atmosféře dusíku a při teplotě 50^eC. Vznikne 2,03 kg špinavě bílého prášku výsledné sloučeniny (1) s výtěžkem 97%. Podle HPLC analýzy obsahuje pevná látka 93,7% plochy pod křivkou výsledné sloučeniny (1).

Příklad 9

Alternativní postup izolace meziproduktu CBZ-Spiroindoleninu (8) • · · · * *· ·· ··

12.37 g (0.050 mol)

5.41 g (0.050 mol)

11.56 ml, 17.10 g (0.150 mol)

500 ml magnetickým michadlem •V ^;-4>

- 51 Výchozí sloučeniny:

Piperidin-4-karboxaldehyd-l-benzyl kařbamát (5)

Fenylhydrazin

Trifiuoroctová kyselina (TFA)

Metylenchlorid

V reakční nádobě o objemu 1 1, vybavené pokrytým teflonem, se rozpustí CBZ-aldehyd (5) v dichlormetanu. Vytvořený roztok se zchladí na teplotu 0°C. Kalibrovanou injekční stříkačkou se během 5 minut přidá fenylhydrazin a během nepřetržitého probublávání dusíkem se teplota reakční směsi udržuje v rozmezí -1 až 3°C.

Podle TLC a HPLC dojde k plnému spotřebování aldehydu (5) a vznikne malý přebytek (<2%) fenylhydrazinu.

Podmínky TLC: oxid křemičitý, E. Měrek Kieselgel G60 F254 0.25 mm; dietyleter/pentan (4/1); vyvijecí směs: 0.5% sulfát cernatý, 14% molybdenan amonný v 10% vodném roztoku kyseliny sírové s následným zahříváním; Rf: aldehyd (5) =0.52, fenylhydrazon (7) = 0.61, fenylhydrazin (6) = 0.21.

HPLC podmínky: 25 cm sloupec Dupont Zorbax RXC8 při teplotě 30°C, rychlost průtoku 1.0 ml/min, detekce při 254 nm; přehled gradientů koncentrací eluční směsi:

Čas (min)	acetnitril	: voda
0	57	: 43
10	65	: 35
15	75	: 25
18	75	: 25
doba retence: fenylhydrazin	(6) = 4.5	minut, toluen =7.2 minut,

fenylhydrazon (7) =11,4 minut.

* 9 4«*«« v*_ww

4 · 4 · 4 « Λ ··* « >

· φ 4 Φ ·φφ ···· ΦΦ ·· *4 ·4 φφ

- 52 Reakční směs se nechá 10 minut stát při teplotě 0-2’C a při zachování teploty v rozmezí 2 až 7^eC se přidá kanylou kyselina trifluoroctová. Reakční směs se ohřeje během 30 minut na teplotu 35 °C, která se udržuje 17 hodin. Probublávání dusíku reakční směsí se zastaví a udržuje se pouze pomalý proud dusíku. Během první hodiny při teplotě 35’C barva postupně tmavla na růžovou, a pak tmavě zelenou. Vytvořilo se relativně malé množství bílé krystalické sraženiny (trifluoracetát amonný). Po 17 hodinách prokáže HPLC, jejíž podmínky odpovídají shora uvedeným, že reakční směs obsahuje 93% plochy pod křivkou indoleninu (8) a méně než 0,5% nezpracovaného fenylhydrazonu. Stání směsi-po delší časový úsek nezvýší výtěžek indoleninu (8).

Po zchlazení reakční směsi na 10*C se za stálého důkladného míchání přidá směs obsahující 60 ml 28-30% roztoku hydroxidu amonného, 90 ml vody a 150 g drceného ledu. Barva směsi se změní na lososově červenou. Organický podíl se oddělí a dvakrát se promyje 400 ml vody, a pak 100 ml nasyceného vodného roztoku chloridu sodného. Organický podíl se suší nad síranem horečnatým a filtruje se přes vrstvu 5 g oxidu křemičitého. Po odpaření filtrátu vznikne 15,84 g bledě oranžového oleje indoleninu (8) s výtěžkem 99%.

Příklad 10

• * ··· •

Příprava CBZ-spiroindolin-metansulfonamidu (1) bez izolace meziproduktu CBZ-spiroindolinu (9)

Část 1: CBZ-Spiroindolin (9)

Výchozí sloučeniny:

Piperidin-4-karboxaldehyd-l-benzyl karbamát (5)	49.5 g	(0.20 mol
	Fenylhydrazin (Aldrich)	23.7 g	(0.22	mol
	Trifluoroctová kyselina (TFA)	75.4 g	(0.66	mol
-Λ·	Toluen (KF < 250 mg/1)	654 ml
	Metylkyanid (MeCN) (KF < 250 mg/1)	13.3 ml
	Hydroborát sodný	11.3 g	(0.30	mol
	Toluen	20 ml
	Metanol	50 ml

Za použití 654 ml toluenu a 13,3 ml metylkyanidu se připraví roztok metylkyanidu s koncentrací 2% objemová. Do nádoby se třemi hrdly o objemu 21a vybavené mechanickým míchadlem se přidá 617 ml shora uvedeného roztoku, který se zbaví plynu probubláváním jemným proudem dusíku po dobu 5 minut. Během probublávání se přidá fenylhydrazin a kyselina trifluoroctová. Ve zbylé části shora uvedeného roztoku (50 ml) se rozpustí CBZ-aldehyd (5) a tento roztok se v přidávácí nálevce zbaví plynu probubláváním dusíkem. Roztok v nádobě se zahřeje ná teplotu 35°C a roztok aldehydu.se během 2 hodin pomalu přidá do směsi fenylhydrazinu a kyseliny trifluoroctové. Reakční směs se nechá stát 16 hodin při teplotě 35°C.

HPLC podmínky: 25 cm sloupec Dupont Zorbax RXC8 při teplotě 50°C, rychlost průtoku 1 ml/min, detekce při 220 nm; isokratická eluční směs 55% metylkyanidu a 45% 0,1% vodného roztoku kyseliny • ···

trihydrogenfosforečné. Přehled výsledků HPLC po 16 hodinách stáni:
sloučenina	Doba retence (min)	% plochy pod křivkou
Fenylhydrazin (6)	1.6	0.1-0.5
dimer (21)	4.1	<0.1
aldehyd (5)	4.7	<0.1
spiroindolin (9)	5.0	NA
toluen	6.3	NA
spiroindolenin (8)	6.9	97
fenylhydrazon (7)	10.3	<0.2
ostatní přiměsy (každá	<0.2%)	celkem 2-3

Reakční směs se zchladí na teplotu -10 C a přidá se metanol. Po malých (1 ml) částech se během 30 minut přidá suspenze borhydridu sodného ve nezvýšila nad -2^eC.

Sloučenina fenylhydrazin (6)

CBZ-spiroindolin (9)

CBZ-spiroindolenin (8) ostatní nečistoty (každá <3%) ml toluenu tak, aby teplota se % plochy pod křivkou

0.1-1

85-90 <0.1 celkem 10-15

Před přidáním 200 ml 6% vodného roztoku amoniaku se teplota reakční směsi během 1 hodiny zvýší na 10°C. Reakční směs se míchá 10 minut, nechá se 10 minut ustát a spodní vodná fáze se oddělí. Do organické fáze se přidá 20 ml acetnitrilu a 20 ml metanolu a roztok se promyje 150 ml 15% roztoku chloridu sodného. Organický podíl obsahuje podle analýzy 92% CBZ-spiroindolinu (9).

• *

- 55 (0.184 mol)

21.1 g (0.184 mol)

29.7 g, 40.1 ml (0.230 mol)

150 ml

Část 2: CBZ-Spiroindolin-metansulfonamid

Výchozí sloučeniny:

CBZ-Spiroindolin (9) (molekulová hmotnost = 322.51)

Metansulfonylchlorid DIEA (KF =150 mg/1)

Tetrahydrofuran (THF) (KF = 41 mg/1)

V nádobě se třemi hrdly o objemu 1 1 se při teplotě

60-70’C a tlaku 24,9-33,2 kPa se surový roztok CBZ-spiroindolinu (9) ze shora uvedené části 1 zahustí na 250 g zbytek. Přidá se tetrahydrofuran a DIEA za vzniku homogenního roztoku, který se zchladí na teplotu 0^eC. Kapací nálevka o objemu 125 ml se naplní metansulfonylchloridem a 50 ml tetrahydrofuranu. Tento roztok se přidá do reakční směsi při zachování její teploty v rozmezí 0 až 4°C a reakční směs se nechá 2 hodiny stát při teplotě 5-8^eC. Adice probíhá mírně exotermicky. Během přidávání se vytvoří bílá sraženina, pravděpodobně DIEA hydrochloridu. Podmínky HPLC jsou shora uvedeny. Podle HPLC analýzy je reakce ukončena 1 hodinu po ukončení adice, kdy není přítomen žádný CBZ-spiroindolin (9) a

výtěžek vztažený na sloučeninu (9) je 94%. Doba retence: (1) =
•v - -	,7,8 miň. Typický HPLC výsledek reakční směsi po 2 hodinách stání
	Sloučenina	% plochy pod křivkou
	CBZ-spiroindolin (9)	<0.1
	CBZ-sulfonamid (1)	90-92
	ostatní nečistoty (každá	<2%) celkem 8-10

Reakční směs se ohřeje na 20^eC a přidá se 200 ml 1M vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové. Směs se ohřeje na 50’C a • ·♦* « ♦· • « «··· ·♦

vodná fáze se oddělí. Organický podíl se promyje postupně jedenkrát 100 ml vody, jedenkrát 100 ml 5% vodného roztoku uhličitanu sodného a jedenkrát 100 ml vody. Organický podíl se přenese do nádoby s třemi hrdly o objemu 1 1 vybavené mechanickým míchadlem a destilačním zařízením. Přibližně 400 ml směsi se destiluje při atmosférickém tlaku, dokud se neodebere 150 ml destilátu. Teplota hlavy destilační kolony dosáhne 107°C a teplota spodku destilační kolony je 110°C. Destilace se provádí za neustálého přidávání n-propanolu v takovém množství, aby ve spodku destilační kolony zůstávalo konstantní množství, přibližně 350 ml. Destilace se ukončí přidáním 525 ml n-propanolu s celkovým množstvím 800 ml odebraného destilátu.

Během výměny rozpouštědla se teplota hlavy a spodku destilační kolony zvýší ze 94 na 98°C . Toluen a n-propanol vytvoří azeotropickou látku o teplotě varu 97,2°C, skládající se z 47,5% toluenu a 52,5% n-propanolu. Reakční směs se nechá postupně ochladit na 20^eC během 3 hodin a nechá se 12 hodin stát. Matečná kapalina obsahuje 2% toluenu a 4 mg/ml sulfonamidu. Rozpustnost sulfonamidu v různých směsích toluenu a n-propanolu se určí užitím HPLC.

%toluenu v n-propanolu rozpustnost (1) v mg/ml

2.36

3.02 .

4.23

7.51

10.3

Krystalická suspenze se filtruje a promyje třikrát 100 ml n-propanolu. Po 16 hodinách sušeni ve vakuové peci při teplotě 50’C a v atmosféře dusíku vznikne 65,5 g sloučeniny (6) jako ·

• ···

Φ ·· • ·· . · 99

9 9 9 9 9 9 9 99

9999 99 99 9999 vztaženým na aldehyd (5) a š % plochy pod křivkou <0.1 >99 celkem <1 žlutohnědé látky s výtěžkem 82 čistotou 93,5% objemových.

Typický HPLC výsledek: sloučenina

CBZ-spiroindolin (9)

CBZ-sulfonamid (1) ostatní nečistoty (každá <0.2%)

Pro další čištění se vzorek 40,0 g v sulfonamidu krystalizovaného z n-propanolu při teplotě 60°C rozpustí ve 134 ml etylacetátu a na roztok se 1 hodinu působí 8,0 g aktivního uhlí zn. Darco G-60 při teplotě 60’C. Po přidáni 2,0 g Solkafloc^m se suspenze filtruje přes vrstvu 4,0 g Solkafloc™ a vrstva se při teplotě 60°C promyje 90 ml etylacetátu. Před přidáváním aktivního uhlí je roztok hnědý, filtrací, která probíhá bez zanášení filtru, se změní na zlatě žlutý filtrát. Filtrát se destiluje při atmosférickém tlaku v nádobě o objemu 500 ml a teplotě spodku destilační kolony 80-85°C za vzniku 100 g (100 ml) zbytku. Roztok se nechá během 3 hodin zchladit na teplotu 35°C. Během 1 hodiny se do roztoku za stálého dokonalého míchání přidá při teplotě 35°C 116 ml cyklohexanu. Reakční směs se zchladí během 1 hodiny na teplotu 20^eC a 12 hodin se nechá stát při teplotě 20°C. Při teplotě 35°C dojde ke krystalizaci velkého množství sulfonamidu a směs zhoustne. Přidáváním cyklohexanu při teplotě 20°C se míchání stane velmi obtížným. Po určité době stání se v supernatantu zjistí množství sloučeniny (1) 2,5 mg/g. Krystalická suspenze se filtruje a filtrační koláč se promyje 77 ml směsi cyklohexanu a etylacetátu v poměru 2:1 a dvakrát se promyje 77 ml cyklohexanu. Produkt se 16 hodin suší ve vakuové peci v atmosféře dusíku a při teplotě 50’c. Vznikne 34,2 g sloučeniny (1) (molekulová hmotnost = 400.3) jako bílé krystalické pevné látky o čistotě vyšší než • ··

V * · v v · v • · ♦ · · · » ·*·· ·· ·· ··

- 58 0,1% vodný roztok kyseliny trihydrogenfosforečné : metylkyanid : 30 : 30 : 80 : 80 • · · čas (min)

O

Doba retence: spiroindolin =7.6 minut, Cbz-spiroindolin-metansulfonamid =13.6 minut.

Směs se probublává dusíkem a katalyzátor se z ještě teplé reakční směsi odstraní filtrací přes Solka-floc^m. Katalyzátor se promyje 4 1 tetrahydrofuranu a 2 1 metanolu. Bledě žluté filtráty se zahustí při tlaku 1000 Pa a při teplotě menši než 25°C na hustý olej. Výměna rozpouštědla se ukončí pomalým vlitím do 15 1 etylacetátu a zahuštění dosucha. Vytvořený zbytek tuhne na tvrdý špinavě bílý materiál, do kterého se přidá 1,5 1 metanolu a směs se zahřívá na teplotu 70^eC za vzniku homogenního roztoku. Při teplotě roztoku 70°C se přidá 10,5 1 etylacetátu o teplotě 20°C. Teplota se sníží na 40C a směs zůstane homogenní.

V následujících experimentech se předpokládá, že vhodnějším výměnou rozpouštědla ve filtrátu je výměna ze směsi metanolu a tetrahydrofuranu na metanol, zahuštění na požadovaný objem, a následné přidáni-etylacetátu. Tento postup nevede k tuhnutí zbytku během zahuštění etylacetátového roztoku.

Do roztoku se přidá chlorovodík zředěný přibližně stejným objemem dusíku. Teplota se během 15 minut zvýši na 60°C za vzniku bílé sraženiny hydrochloridu. Zředěný roztok chlorovodíku pouze zamezuje nasávání směsi zpět a tento postup nejspíš není nutný.

Reakční směs se zchladí v ledové lázni a přidávání • ··· · · • 4 ··· 4 * ·Φ • ·: · · ♦ · · ··· · · • 4 · ♦ 4 04* ' ·· ·· ·· *· chlorovodíku pokračuje další 1 hodinu. Teplota se postupně sníží na 20 °C a suspenze se nechá 2 hodiny stát při snižování teploty na 10°C. Vytvořený krystalický produkt se oddělí filtrací a filtrační koláč se promyje 3 1 etylacetátu. Po sušení ve vakuové peci při teplotě 35^QC vznikne 1,18 kg výsledné sloučeniny (la) s výtěžkem 86% jako špinavě bílé krystalické pevné látky s čistotou podle HPLC vyšší než 99,5 % plochy pod křivkou. Podmínky HPLC: 25 cm sloupec Dupont Zorbax RXC 8, rychlost průtoku 1.5 ml/min, detekce při 230 nm; isokratická eluční směs 35% metylkyanidu, 65% 0,1% vodného roztoku octanu amonného. Doba retence: (la) =5,4 minut.

Příklad 12

Spiroindolin-metansulfonamid (ve formě volných baží) (1b)

Na přibližně 10 ml se. zahusti 250 ml část filtrátu Cbz-hydrogenolýzy , obsahující 4,67 g sloučeniny (lb) (volné báze). Vytvořený zbytek se rozpustí ve 20 ml etylacetátu a roztok se zahustí na přibližně 10 ml. Tento postup se ještě jednou opakuje, a pak se do zbytku přidá 10 ml etylacetátu. Když se začne vytvářet krystalická sraženina, přidá se najednou 20 ml MTBE. Dojde k další krystalizaci, ale supernatant i nadále obsahuje značné množství rozpuštěného produktu, ze kterého se ···· · 9 stáním sraženina nevytvoří. Za stálého energického míchání se do směsi po kapkách během 2 hodin přidá 70 ml směsi hexanů. Pomalé přidáváni hexanů je nutné k zabránění vyloučení aminu jako oleje.

Reakční směs se 1 hodinu nechá stát, a pak se filtruje. Filtrační koláč se promyje 20 ml směsi MTBE a hexanů v poměru 1:1, a pak 20 ml směsi hexanů. Produkt se suší v proudu dusíku za vzniku 3,86 g volných aminů sloučeniny (lb) jako špinavě bílých _a. krystalů s Čistotou vyšší než 99,5 % plochy pod křivkou a s výtěžkem 82¾. - ....

* Podmínky HPLC: 25 cm sloupec Dupont Zorbax RXC 8, rychlost průtoku 1.5 ml/min, detekce při 230 nm; isokratická eluční směs 35% metylkyanidu, 65% 0,1% vodného roztoku octanu amonného. Doba retence: (lb) =5,4 minut.

Přiklad 13A

Spiroindolin-metansulfonamid (ve formě volných bázi) (lb)

Výchozí sloučeniny:

CBZ-Spiroindolin-sulfonamid (1) 833.5 g (2.08 mol)

Paladium na aktivním uhlí (20% hmotnostních oxidu paladnatého na aktivním uhlí) 124.5 (15%) • · < · • · ·· • · * ·· » • · ·»··· • ♦ · · · · ·· · φ · οφ

Φ · ♦ 9 9 9 9φφφ ♦*···* · ·Φ »· « »

Tetrahydrofuran 6.5 1

Metanol 19·⁵ 1

Hydroxid amonný - koncentrovaný roztok60 ml

Vzhledem k omezeném vybavení se hydrogenace prováděla třikrát.

Uvedený postup syntézy odpovídá jednoduchému postupu. CBZ-spiroindolin-sulfonamid (1) se rozpustí v 6,5 1 tetrahydrofuranu (KF = 53 gg/gl), a pak ve 4 1 metanolu (KF = 18 gg/ml). Po přidání katalyzátoru se suspenze přenese do autoklávu o objemu 19 1. Zbývající část 2,5 1 metanolu se použij ék' promytí. Směs se 24 hodin zahřívá při tlaku 3500 Pa na teplotu 40°C . Množství přítomného katalyzátoru a reakční čas jsou funkcemi čistoty výchozí sloučeniny (1). Tento materiál vyžadoval více než 15% katalyzátoru a dlouhý reakční čas. Čistší dávky spiroindolinu vyžadovaly pouze 5% katalyzátoru a 4-6 hodin reakce.

Po dokončení reakce (přítomnost sloučeniny < 0,1 % plochy pod křivkou sloučeniny (1) podle -kapalinové ₊ , chromatografie) se směs filtruje přes SolkaFloc™ a filtrační koláč uhlíku se promyje 13 1 roztoku metanolu obsahujícího 60 ml 0,5% roztoku hydroxidu amonného. Sloučené filtráty (podle zkoušky 1587 g spiroindolinamin lb) se zahusti ve vakuu a vytvořená pevná látka se rozdělí do 40 1 směsi toluenu a tetrahydrofuranu v poměru 3:1 a 18 1 0,5 N roztoku hydroxidu sodného a ve vodném póďíTiFs'ě~o'5'j'ěví’l^:iuš'ta'~s'raž'e’n'in'a“.’''Podr±y-se“'lehce-oddě-l-í-~-'Vod-ná-suspenze se extrahuje 15 1 metylenchloridu. Vodný a organický podíl se pomalu oddělí. Před přidáním metylechloridu se do vodného podílu přidá tetrahydrofuran spolu s dostatečným množstvím chloridu sodného do nasycení podílu. K rozpuštění produktu však tímto postupem nedojde, a je nutné použít metylenchlorid.

Sloučené toluenové, tetrahydrofuranové a • ·· • · · · · · · ··♦ · · • ♦ · ···· » · I ··♦♦ ·· ♦· φ· ·· «t

- 62 metylenchloridové podíly se sloučí a zahustí v koncentrátoru vsázek. Vytvořený zbytek se propláchne se 7 1 metylkyanidu.

Nakonec se přidá 10 1 metylkyanidu a roztok se nechá přes noc ?· stát v atmosféře dusíku. \

Příklad 13B

Spiroindolin-metansulfo.namid (ve formě volných bází) (lb)

Výchozí sloučeniny:

CBZ-Spiroindolin-sulfonamid (1)	3 kg (7.49 mol)
aktivní uhlí zn. Darco G-60	600 g
Etylacetát	36 1
Absolutní etanol	189 1
ΤΌ % rOZťo’k~p’a'ladia”'na· -aktivním unl-í-—	---4'5Θ—g——!-—
Roztok amoniaku	500 ml
Solka-floc™	2.5 kg
Isopropylacetát	65 1

Směs lkg CBZ-spiroindolinu (1) a 200 g aktivního uhlí zn. Darco G-60 v 9 1 etylacetátu se za stálého míchání 8 hodin zahřívá v atmosféře dusíku na teplotu 60-65’C. Darco se odstraní filtraci při teplotě 60-65°C, pevná látka se promyje 3 1 horkého etylace• * ···· ♦· • · · · · · · · · « ♦ · · · ·· · ♦ * • · · ♦ · · • · · · ·« · * i tátu a filtrát a promývací podíly se sloučí. Kapalinovou chromatografií se potvrdí zanedbatelná ztráta vzhledem k použití aktivního uhlí zn Darco G-60. Etylacetátový roztok se ve vakuu odpaří dosucha za použití Buchiho přístroje o objemu 20 1, a pak se dvakrát propláchne 5 1 absolutního etanolu. Tetno materiál se uvede do suspenze v 8 1 absolutního etanolu, zahřívá se na 65-70°C a umístí se do autoklávu o objemu 20 1. Reakční směs se promyje 1 1 absolutního etanolu. Do autoklávu se následně přidá suspenze 75-g 10% paladia na aktivním uhlí (7,5% hmotnostních) v 750 ml absolutního etanolu, a následně se promyje dalšími 250 ml absolutního etanolu.

Reakční směs se za stálého energického míchání 3 hodiny hydrogenuje při tlaku vodíku 2800 Pa a teplotě 65^ÓC. rj.ida se dalších 75 g paladia na aktivním uhlí, reakční směs se další 2 hodiny hydrogenuje a přes noc se nechá stát v uzavřené nádobě.. Po přemístění reakční směsi, která má stále teplotu 60-65°C, do Buchiho zařízení o objemu 20 1 se vsázka ve vakuu zbaví plynu za odstranění kyseliny mravenčí metodou feeding and- bleeding tj . přidáváním a proplachováním celkem 18 1 absolutního etanolu.

Tento postup se ještě dvakrát opakuje a tři vsázky se sloučí ve sklem vyložené nádobě o objemu 36 1. Sloučené vsázky se znovu zbaví plynu dvojím opakováním přidáni vždy 10 1 absolutního etanolu a následné destilace ve vakuu. Do vsázky se přidá 0,5 kg í * - /-----------So.lkaflo.c^_a_smě.s_s.e_ promyje 10 1 etanolu. Suspenzi 2 kg

Solkafloc“¹ ve 20 1 etanolu se naplní filtr Estrella a vytvořená ^s směs se zahřeje na 60-65°C. Při této teplotě se reakční směs filtruje přes zahřívaný filtr pomocí čerpadla do dvou vydehtovaných nerezových nádob. První reakční nádoba, filtr, čerpadlo a trubice se promyjí horkou směsí 500 ml vodného roztoku amoniaku ve 25 1 absolutního etanolu o teplotě 60-65°C.

Vsázka se přefiltruje do reakční nádoby za použití • · • *

- 64 zabudovaného filtru obsahujícího předem připravený sloupec s velikostí otvorů 10μ/ a pak se zahustí ve vakuu na objem přibližně 15 1. Etanol se nahradí celkem 45 1 isopropylacetátu metodou feeding and bleeding, tzn. přidáváním a proplachovánim třikrát 15 i isopropylacetátu. Podle plynové chromatografie obsahuje reakční směs po dokončení výměny rozpouštědel méně než 1% etanolu. Reakční směs se zředí na objem přibližně 33 1 přidáním 20 1 isopropylacetátu. Tento roztok spiroindolinaminu (lb), jehož hmotnost' jé podlekapalinové chromatografie·1,855 kg, v isopropylacetátu se použije v následující syntéze.

Přiklad 14A

i a .......

__________BocjLOzzbejizxlje^m-^ ýll)_

Výchozí sloučeniny:

Spiroindolin-amin (lb)

Amino kyselina (10)

1587 g (5.966 mol)

1938 g (6.563 mol)

NHBOC

Dicyklohexylkarbodiimid (DCC)

N-hydroxybenztriazol (HOBt)

Metylkyanid

0.5N roztok hydroxidu sodného

0.5N kyseliny chlorovodíkové

Nasycený roztok hydrogen uhličitanu sodného

Isopropylacetát

1334.5 g (6.563 mol)

884 g (6.563 mol)

1

1

1

1

1

Na roztok spiroindolin-aminu (1b) v 25 1 metylkyanidu nebo vodného roztoku isopropylacetátu se postupně při teplotě místnosti a pod dusíkem působí 884 g (1.1 ekv.) HOBT jako pevné látky, 1334,5 g DCC (1.1 ekv.) jako taveniny (připravené zahříváním 1 hodinu v horké vodě o teplotě 60°C), a nakonec 1938 g aminokyseliny (10) jako pevné látky. Reakční směs se tři hodiny míchá za vzniku husté sraženiny DCU. Podle kapalinové chromatografie zůstává v reakční směsi 0,5% plochy pod křivkou aminu (lb). Přidá se 9 1 isopropylacetátu, suspenze se filtruje . přes Solka-floc™ a filtrační koláč se promyje 19 1 isopropylacetátu. Sloučený organický roztok se postupně promyj-e 18 1 0,5N roztoku hydroxidu sodného, 18 1 0,5N roztoku kyseliny chlorovodíkové a 18 1 nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného.

Promytím vodou vznikla emulze, která byla odložena.

Organický podíl se zahustí ve vakuu a zbytek' sě~’rozpustí' metárídlu' nebo etanolu do konečného objemu 10 1 roztoku. Výtěžek je 3026 g tj. 89%.

Výtěžek sloučeniny 11 a nebo 14 z reakce, ve které se použiji alternativní peptidová vazebná činidla, jako je karbonyldiimidazol, nebo směs anhydridů, jako je sek.butylkarbonát, je nižší. V případe sloučeniny (11) dojde k epimerizaci vysokého stupně. Ostatní peptidová vazebná činidla jsou finančně • «·

nedostupná.

Příklad 14B

Boc-O-benzylserin-spiroindolin (11)

Výchozí sloučeniny:

Spiroindolin-amin (lb) Isopropylacetát

Dicyklohexyikarbodiimid (DCC) 1-Hydroxybenztriazol (HOBt) N-Boc-O-benzyl-D-serin

1.855 kg (6.96 mol)

1

1.58 kg (7.65 mol)

1.03 kg (7.62 mol)

2.26 kg (7.65 mol)

1M vodný roztok hydroxidu sodného

1

0,5M vodný roztok kyseliny chlorovodíkové 26

Nasycený vodný roztok hydrogenuhličitanu

*) sodného

1

Absolutní etanol

1

Do míchaného roztoku 1,855 kg spiroindolinaminu (lb) ve

1 isopropylacetátu se v reakční nádobě přidá 20 1 vody. Postupně se při teplotě místnosti a v atmosféře dusíku přidá:

1,58 kg (1.1 ekv.) DCC, 1,03 kg (1.1. ekv.) HOBt, a nakonec (1.1 ekv.) 2,26 kg N-Boc-O-benzyl-D-serinu. Reakční činidla se • *

- 67 promývají 7 1 isopropylacetátu.-Po 5 hodinách mícháni při teplotě místnosti a v atmosféře dusíku se kapalinovou chromatograflí potvrdil poměr produktu a výchozí sloučeniny v reakční směsi 99,4:0,6. Reakční směs se filtruje do jiné nádoby přes filtr Estrella při pouhém použití tkaniny upevněné v lepence a čerpadla. První nádoba se propláchne 22 1 isopropylacetátu a. tímto materiálem se propláchne filtr, čerpadlo a trubice spojující nádoby. Směs dvou fází se v nádobě 10 minut míchá, a pak se během 15 minut nechá' ustát.' Spodní vodný podíl se oddělí a organický roztok se nechá stát přes noc při teplotě místnosti.

Následující den se organický roztok promyje 26 1 1M vodného roztoku hydroxidu sodného, 26 1 0,5M vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové, a nakonec 26 1 nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Výtěžek výsledné sloučeniny podle kapalinové chromatografie je 3,787 kg, t.j. 93% z 3 kg (7,49 mol) CBZ-spiroindolinu (1) jako výchozí sloučeniny. Reakční směs se zahustí v-e vakuu (vnitřní teplota = 13-15^eC, teplota manžety = 40*C, vakuum = 3857 Pa) na přibližně 15 1. Rozpuštědlose zamění na etanol pomalým přidáváním a proplachováním 50 1 etanolu do konečného objemu roztoku přibližně 15 1. Podle plynové chromatografie je v roztoku přítomno méně než 1% isopropylacetátu. Roztok se použije v následující syntéze.

SOjMe

O-benzylserin-spiroindolin (ve formě volných bázi) (12)

Výchozí sloučeniny:

Boc-O-benzylserin-spiroindolin (11)	30	26 g	(5.57	mol)
Kyselina metansulfonové (MsOH)	1.	16 1	(17.9	mol)
Metanol	10	1
Isopropylacetát (iPrOAc)	24	1
0.5N roztok hydroxidu sodného	35	1

Na roztok Boc-O-benzylserin-spiroindolinu (11) v 10 1 metanolu (nebo etanolu) se působí 1,16 1 kyseliny metansulfonové jako čisté látky, která se přidávala přibližně 30-40 minut (počáteční teplota 16°C, konečná teplota 28°C). Tmavočervený roztok se přes noc nechá stát pod dusíkem. Reakční směs se přečerpá do extrakčního zařízení o objemu 100 1, které obsahuje 24 1 isopropylacetátu a 35 1 0,5N roztoku hydroxidu sodného.. Počáteční pH vodného podílu je 7. Po přidávání 6M roztoku hydroxidu sodného se zvýši na pH větší nebo rovno 10,5. Během zvyšování pH roztoku se jeho barva mění z červené na žlutou. Podíly se oddělí a 24 1 organického podílu podle NMR obsahuje 13% molárnich metanolu v isopropanolu (5% objemových). Výtěžek zkoušky podle kapalinové chromatografie je 2,48 kg.

Příklad I5B

f «Μ

- 69 O-Benzylserin-spiroindolin (ve formě volných baží) (12)

Výchozí sloučeniny:

Boc-O-benzylserin-spiroindolin {11)	3.787 kg (6.96 mol)
Kyselina metansulfonové	2.006 kg (20.87 mol
Isopropylacetát	38 1
1M vodný roztok hydroxidu sodného	16 1
50% vodný roztok hydroxidu sodného	1.6 1

Do přibližně 15 1 míchaného roztoku 3,787 kg Boc-O-benzylserin-spiroindolinu (11) v etanolu se v reakční nádobě přidá 2,006 kg (1,355 1, přibližně 3 ekv.) kyseliny metansulfonové. Reakční-směs se ohřeje na teplotu 35-40°C. Po 7 hodinách se kapalinovou chromatografii prokáže vymizeni počátečního materiálu a reakce se přes noc nechá zchladit na teplotu místnosti. Následující den se během míchání přidá 44 1 vody. Po zchlazení na asi 5*0 a 30 minutách mícháni se směs filtruje do druhé nádoby přes zabudovaný filtr s velikostí otvorů 10μ a přečerpá se zpět do reakční nádoby. Nádoby, filtrační zařízení a nakonec roztok v reakční nádobě se propláchne 10 1 vody a následně se postupně přidá 38 1 isopropylacetátu a 16 1 1M vodného roztoku hydroxidu sodného. Reakční směs se zchladí na 10-15°C. Hodnota pH spodní vodné fáze je přibližně 7 a přidá se 1,6 1 50% vodného, roztoku hydroxidu sodného na hodnotu vyšší než 10. Po 25 minutách míchání při tepíotě^-lT^lT^^e”šměs~nO'chcr během 10-15 minut usadit. Oddělí 78,1 kg spodní vodné fáze, která podle kapalinové chromatografie obsahuje 28,4 g sloučeniny (12) s teoreticky vypočítaným výtěžkem 0,85%. Organický podíl o objemu

1 obsahuje podle kapalinové chromatografie 3,057 kg výsledné sloučeniny s výtěžkem 92% vztaženým na 3 kg (7,49 mol) .

CBZ-spiroindolinsulfonamidu (1). Výsledný roztok se použije v následující syntéze.

- 70 Přiklad 16A

Boc-aminoisobutyryl-O-benzylserin-spiroindolin (14)

Výchozí sloučeniny:

Spiroindolinamin (12)

Peptid aminokyseliny (13)

2481 g (5.57 mol)

1247.1 g (6.16 mol)

Dicyklohexylkarbodiimid (DCC)

1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) Isopropylacetát (IPAc)

Voda

1266.7 g (6.16 mol)

827 g (6.16 mol)

1

1

0.5N rozto'k hydroxidu sodného---------3-6—1—

0.5N roztok kyseliny chlorovodíkové 36 1 Nasycený roztok hydrogenuhličitanu sodného

1

Roztok aminu (12) v isopropylacetátu se použitím isopropylacetátu (IPAc) zředí na celkový objem 39 1 a přidá se 37 1 vody. Na směs se dvěmi fázemi se při teplotě místnosti a pod dusíkem působí postupně 827 g HOBT jako pevné látky, 1266,7 g DCC « ··♦ • · · ··««

jako taveniny a aminokyselinou (13). Reakční směs se 2 hodiny míchá a vymizení (<0,3% plochy pod křivkou) výchozích sloučeniny (12) se prokáže kapalinovou chromatografií. Reakční směs se filtruje přes Solka-floc™ a pevná látka se promyje 13 1' isopropylacetátu. Reakční směs se takto může uchovat přes noc.

Po přemístění reakční směsi do extrakčního zařízení o objemu 100 1 se oddělí vodný podíl a organický podíl se promyje postupně '36 1 0/5N'roztoku hydroxidu sodného, 0,5N roztoku kyseliny chlorovodíkové a nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Výtěžek zkoušky je 3160 g (81% ze spiroindolinu s chybou měření objemu + 5%) . Roztok se zahustí na malý objem a dvakrát se promyje 4 1 etanolu. Meziprodukt (14) se může oddělit krystalizací přidáním vody.

Výtěžek sloučeniny 14 z reakce, ve které se použijí alternativní peptidová vazebná činidla, jako je karbonyldiimid- azol, nebo směs anhydridů (sek.butylkarbonát)je nižší a s vysokým stupněm epimerizace. Ostatní peptidová vazebná činidla jsou finančně nedostupná.

Příklad 16B

N.

SOjMe

Boc-aminoisobutyryl-O-benzylserin-spiroindolin (14)

- 72 Výchozí sloučeniny:

Spiroindolinamin (12) Dicyklohexylkarbodiimid (DCC) 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt)

Boc-2-aminoisomáselná kyselina (13) Isopropylacetát

1M Vodný roztok hydroxidu sodného

0.5M Vodný roztok kyseliny chlorovodíkové Nasycený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného

Absolutní etanol

3.057 kg (6.89 mol)

1.56	kg	(7.56	mol)
1.02	kg	(7.55	mol)
1.54	kg	(7.58	mol)

1

1

1

1

1

Do přibližně 51 1 míchaného roztoku 3,057 kg spiroindolinaminu (12) v isopropylacetátu se v atmosféře dusíku a při teplotě místnosti přidá 49 1 vody. Postupně se do reakční nádoby při teplotě místnosti a v atmosféře dusíku přidá: (přibližně 1.1 ekv.) 1,5 6 kg DCC', 1,02 kg {přibližně- 1.1. ekv.) HOBt, a nakonec 1,54 kg (přibližně 1.1 ekv.) N-Boc-O-benzyl-D-serinu. Po 2 hodinách energického míchání při teplotě místnosti v atmosféře dusíku se kapalinovou chromatografií potvrdí dokončení reakce. Reakční směs se filtruje přes filtr Estrella při použití čerpadla. První nádoba, filtr, čerpadlo a spojující trubice-se propláchnou 22 1 isopropylacetátu. Směs dvou fází se v nádobě 5 minut míchá a podíly se oddělí. Spodní včdny podíl o hmotnosti 51,1 kg se oddělí. Organický roztok se postupně promyje 38 1 1M vodného roztoku hydroxidu sodného, 38 1 0,5M vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové, a nakonec 38 1 nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného.

Organický roztok se čerpadlem přes zabudovaný filtr (obsahující předem připravený sloupec s velikostí otvorů 10μ) • ·· • » • · * >.

přemísti do jiné nádoby, kde se provede výměna rozpouštědla na etanol. Nádoba se propláchne 10 1 isopropylacetátu a tímto roztokem se promyje čerpadlo, filtr a trubice do nádoby s reakční směsí. Filtrát a promývací podíly se sloučí. Celkový objem, měřený ponorným měřítkem, je 75 1. Podle kapalinové chromatografie vznikne 4,395 kg Boc-aminoisobutyryl-O-benzylserin-spiroindolinu (14) s celkovým výtěžkem 93% (z 7.49 mol výchozího CBZ-spiroindolin-sulfonamidu (1)).

Reakční směs se zahustí ve vakuu na objem okolo 15 1. Provede se výměna rozpouštědla na etanol pomalým přidáváním a proplachovánim celkem 5 1 absolutního etanolu. Podle plynové chromatografie zůstává ve vsázce méně než 1% isopropylacetátu. Roztok o objemu 25 1 obsahuje 4,395 kg sloučeniny (14), která se použije v další syntéze. Pokud je třeba, lze sloučeninu (14) přidáním vody nechat krystalizovat.

Příklad 17A

N

SO₂Me

Aminoisobutyryl-O-benzylserin-spiroindolin (15)

Výchozí sloučeniny:

• * • · • ·

Boc-spiroindolin (14)	3160 g	(5.03 mol)
Metansulfonové kyselina (MsOH)	979 ml	(15.1 mol)
Etanol	6.2 1
Voda	30 1
IN roztok hydroxidu sodného '	11 1
Etylacetát	26 1
Aktivní uhlí Darco 60	1 kg

Na roztok Boc-spiroindolinu (14) v 6,2 1 etanolu se působí 979 ml kyseliny metansulfonové. Teplota se tím zvýší z 20 na 30°C a reakce se nechá probíhat přes noc. Po 12 hodinách při teplotě 20®C zůstává ve směsi stále 15% plochy pod křivkou výchozí sloučeniny. Směs se proto- zahřívá 6'hodin na teplotu

35°C. Po ukončení reakce (méně než 0,1% plochy pod křivkou sloučeniny (14)) se reakční směs zchladí na teplotu 20°C a přidá se 30 1 vody. Roztok se filtruje přes skleněnou nálevku s polypropylenovým filtrem, čímž se odstraní zbývající množství DCU. Směs se přemístí do extrakčního zařízení o objemu 100 1 a přidá se 26 1 etylacetátu. Vodný podíl se přivede na zásadité pH přidáním 11 1 zchlazeného IN roztoku hydroxidu sodného a 1 1 50% roztoku hydroxidu sodného. Aby se teplota udržela pod 14°C, je' třeba přidat led. Vyšší teplota vede ke vzniku emulze.

Organický podíl se destiluje při teplotě 50°C a tlaku

2793 Pa na hodnotu KF nižší než 1000 μg/ml. Nižší KF je výsledkem účinnějšího působení aktivního uhlí a jeho lepší izolace po tvorbě soli. Za vzniku 700 g produktu bylo dosaženo hodnoty KF 160 pg/ml. Roztok se zředí etylacetátem do celkového objemu 31 1 (roztok obsahuje podle kapalinové chromatografie 2,40 kg produktů). Přidá se aktivní uhlí Darco G-60 a směs se 24 hodin míchá. Po filtraci přes Solka-floc™ se filtrační koláč promyjé 16 1 etylacetátu za vzniku 2,34 kg produktu.

• · ♦ • ·	« · * ·	• ··	• ·	··
	• ·	*	•	•	• ···	•
• · ·	•	•	•	*	•	«
···· ··	··	··	··	·

Přiklad 17B

Aminoisobutyryl-O-benzylserin-spiroindolin (15)

Výchozí sloučeniny:

Boc-spiroindolin (14)

Metanesulfonová kyselina

4.395 kg (6.99 mol)

2.017 kg (20.99 mol)

Etylacetát185 1

M vodný roztok hydroxidu sodného16 1

50% vodný roztok hydroxidu sodného2.6 1

Darco· G-60

Solka Floc™

900 g

2.5 kg

Do přibližně 25 1 míchaného roztoku 4,395 kg Boc-spiroidolinu (14) v etanolu, umístěného v reakční nádobě, se při teplotě místnosti přidá 2,017 kg (1,36 1, přibližně 3 ekv.) kyseliny metansulfonové. Reakční směs se ohřeje na 35-40^eC a přes noc se míchá. Následující den obsahuje reakční směs přibližně 1,1% plochy pod křivkou výchozího materiálu, a proto reakce pokračuje další 4 hodiny. Podle kapalinové chromatografie byl poměr produktu a výchozího materiálu 99,6:0,4. Reakční směs se zahustí ve vakuu na objem okolo 15 1, a následně se zředí 44 1 vody. Reakční směs se zchladí na 5°C, 30 minut se míchá a filtruje se za použiti čerpadla přes zabudovaný filtr Sparkler (obsahující předem vyrobený sloupec s velikostí otvorů 10μ) do

- 76 druhé nádoby k odstraněni malého množství zbytkového DCU.

Nádoba, čerpadlo, filtr a trubice se promyjí 10 1 vody, která se pak přidá do nádoby s reakční směsí. Přidá se 36 1 etylacetátu a míchaná směs se zchladí na teplotu 10°C. Při této teplotě se přidá 16 1 studeného 1M vodného roztoku hydroxidu sodného o teplotě 5-10°C a 2,6 1 studeného 50% vodného roztoku hydroxidu sodného o teplotě 5-10°C. Teplota se zvýší na 14°C. Výsledná směs se 15 minut míchá při teplotě nižší než 14°C a spodní vodný podíl se oddělí.

. Reakční směs se zahustí ve vakuu na objem přibližně 20 a do směsi se přidá směs 35 1 etylacetátu a 5 1 etanolu do konečného objemu 20 1. Ke konci destilace je KF 9160mg/ml. Rozpouštědlo se vyměmí na etylacetát při pomalém přidávání a proplachování celkem 40 1 etylacetátu. Ke konci této destilace' je hodnota KF 446 mg/ml. Reakční směs se zředí 10 1 etylacetátu.

Do směsi se přidá 900 g aktivního uhlí zn. Darco G-60 a směs se promyje 6 1 etylacetátu. Směs se míchá přes noc při teplotě místnosti a následující den se za stálého míchání reakční směsi v reakční nádobě přidá 0,5 kg Solka Floc™. V malém množství etylacetátu se míchá 2,0 kg Solka Floc™ a tímto materiálem se naplní filtr Estrella. Přebytek rozpouštědla se odčerpá přes zabudovaný filtr Sparkler obsahující sloupec s velikostí otvorů 10 μ. Suspenze se dvakrát filtruje pomocí čerpadla do dvou _A' nerezových zásobních nádob o objemu 4 0 1. Kapalina je čistá a čirá. Reakční nádoba se promyje 22 1 etylacetátu, a tímto < materiálem se promyje ostatní zařízení a vlije do zásobních nádob. Obsah obou zásobních nádob se přemístí do reakčních nádob a roztok se dokonale promísí.

Reakční směs o objemu 58 1 má hodnotu KF 2950 mg /ml, a proto se znovu suší ve vakuu na objem 20-25 1. Po zředění reakční směsi na objem 46 1 (měřeno ponorným měřítkem) přidáním 235 1 »

·4·

- 77 etylacetátu je hodnota KF 363 mg/ml. Reakční směs se zředí na objem 62 1 přidáním 17 1 etylacetátu a použij.e se v dalším konečném postupu syntézy.

Příklad 18A

Spiro[3H-indol-3,4'-piperidin]-1'-yl)karbonyl]-2-(fenýlmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropanamid-metansulfonát (16)

Výchozí sloučeniny:

Amin (15) 2340 g (4.43mol)

Metansulfonová kyselina (MsOH) 316 ml (4.88mol)

Étylacetát60' 1

8% roztok etanolu v etylacetátu20 1

Objem roztoku sloučeniny (15) z předchozí části se přivedl přidáním etylacetátu a 4,8 1 etanolu na 60 1. Při teplotě 45^eC se přidá roztok 316 ml kyseliny metansulfonové ve 3 1 etylacetátu. Do tmavě červeného homogenního roztoku se k • · • * naočkováni přidá 496 g výsledné sloučeniny obecného vzorce I (10% hmotnostních volného aminu jako očkovacího materiálu).

Teplota se zvýší na přibližně 48°C a reakční směs se nechá stát 1,5 hodiny při teplotě 52^eC. Podle analýzy dojde k úplnému vytvoření výsledné sloučeniny obecného vzorce I. Použitím méně než 10% očkovacího materiálu se prodlouží doba stání (vyšší než 3 hodiny), Suspenze se nechá přes noc zchladit na teplotu 20^qC a pod dusíkem se filtruje v centrifuze. Filtrační koláč se promyje 20 1. 8%. roztoku etanolu v etylacetátu. Přítomnost dusíku je velmi _£ důležitá, protože mokré krystaly jsou velmi hygroskopické.

Reakční směs se ve vakuu suší za teploty 35^eC za vzniku 2,7 kg výsledné sloučeniny obecného vzorce I s celkovým výtěžkem 56% a s čistotou 99,9% plochy pod křivkou a s přítomností méně než 0,1% enantiomeru.

Přeměna sloučeniny obecného vzorce II na sloučeninu obecného vzorce I se provede tvorbou soli ve směsi etylacetátu a etanolu přidáním .kyseliny metansulfonové, jak bylo shora uvedeno, a počáteční roztok soli o teplotě 55^ŮC se zchladí na teplotu 45^eC. Při této teplotě se začnou objevovat krystaly a suspenze • zhoustne. Teplota se zvýší na 51°C a suspenze se nechá přes noc stát. Dojde k úplné přeměně sloučeniny (16) na sloučeninu obecného vzorce I. Tímto postupem lze vytvořit očkující krystaly sloučeniny (16) obecného vzorce I.

M..........—__________________________________________

Příklad 18B

Spiro [3H-indol-3,4'-piperidin]-1'-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropanamid-metansulfonát (16) · · • · · οι» 0»

- 79 0 0 · · « 0 · · • 0 *0

Výchozí sloučeniny:

Amin (15)

Metansulfonové kyselina

Etylacetát

Absolutní etanol

Spiro[3H-indol-3,4'-piperidin]-1'yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]2-amino-2-metylpropanamidmetansulfonát (obec, vzorec' I)

3.1 kg (5.86 mol)

620 g (6.45 mol)

1

8.7 1

70g (0.11 mol)

Do roztoku o objemu přibližně 62 1 3,1 kg aminu (15) v etylacetátu se v reakční nádobě přidá 6,4 1 absolutního etanolu. Reakční směs se v reakční nádobě ohřeje na teplotu 50°C a během přibližně 5 minut se při teplotě 50-54“C přidá roztok 620 g (412 ml, 1,1 ekv.) kyseliny metansulfonové v 11 1 etylacetátu. Reakční —ή— ....směs-s.e_nao.čkuj.e__7P—g_sg_ito í3H-indol-3, 4 ' -piperidin] -1 '-yl) karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropanamidmetansulfonátu (obecného vzorce I) . Vytvořená suspenze se přes noc míchá a pod dusíkem zahřívá na teplotu 55°C.

Následující den se suspenze zchladí na teplotu 15-20°C, při které se udržuje 2 hodiny, a pak se po kapkách v atmosféře dusíku filtruje přes 50 cm polypropylenový filtr. Produkt jako pevná látka se promyje směsí 2,3 1 absolutního· etanolu ve 26 1 t · * ♦ ·· • · · φ · · φφ ·Φ

- 80 • · * ♦ ♦ · · ···» ·· • · · · ♦ · ·· etylacetátu. Bílý produkt jako pevná látka se oddělí a přibližně dva dny se suší v peci Apex ve vakuu při teplotě 35°C. Sušený spiro[3H-indol-3,4'-piperidin]-l'-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropanamid metanesulfonát o hmotnosti 3,352 kg se přesije přes Jackson-Crockattovo síto za vzniku 3,347 kg výsledné sloučeniny včetně 70 g očkující látky. Celkový výtěžek je 3,277 kg.

Podmínky HPLC:

Kapalinová chromatografie:

Doba retenc.e na sloupci Zorbac RX-C8 (4.6 mm x 25 cm), detekce při 210 nm, rychlost průtoku =1.5 ml/min.

Sloučenina

Sloučenina

Sloučenina

Sloučenina

Sloučenina

1: 60:40 CH₃CN-H₂0 (1% H₃P0₄) RT = 5.0 minut ob j . % NH₄0Ac ) RT = 6.2 minut. H₃P0₄) RT = 2.9 minut.

% HjPOJ RT = 5.4 minut.

[pH 5.25 NaH₂PO₄ (6.9 g/1 vody)

RT = 5.6 minut lb:

10:

11:

12:

35:65

60:40

60:40

40:60 [pH dosaženo

CHjCN-Η,Ο

CH₃CN-H₂0

CHjCW-HíO (0.1

CH,CN-H,0 přidáním hydroxidu sodného]

Sloučenina 14: 60:40%

4.65 minut

Sloučenina 15: 40:60% [pH dosaženo

CH₃CN-H₂O (0.1 % H₃P0J RT =

CH₃CN-H₂O [pH = 5.25 NaH₂PO₄ přidáním hydroxidu sodného] RT = 4.9 minut ^4--..........-Kap-a-l-i-nová-ch-romatografie·:-------------------=_________________________

Doba retence na sloupci Zorbac RX-C8 (4.6 mm x 25 cm), detekce

A při 210 nm, rychlost průtoku = 1.2 ml/min, teplota sloupce = 48°C.

Rozpouštědlo A = 0,05% roztok kyseliny fosforečné + 0,01% roztok trietylaminu ve vodě.

Rozpouštědlo B = acetnitřil.

- 81 Přehled gradientu koncentrací rozpouštědel:

Čas	%A	%B
0 minut	95	5
35 minut	10	90
38 minut	95	5
40 minut	95	5

Doba retence (minuty)

Sloučenina 1	25.2
Sloučenina lb	8.5
Sloučenina 10	20.5
Sloučenina 11	26.3
Sloučenina 12	14.8
Sloučenina 14	. 25.6
Sloučenina 15	15.7

Příklad 19

Příprava sloučeniny obecného vzorce I,

N-z.LlJR15_[.(ic2^dihydro513inetansulfonylspiro [3H-indol-3,4 piperidin)-1'-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy) etyll-2-amino-2metylpropanamid-raetansulfonátu

Přeměna sloučeniny obecného vzorce I na sloučeninu obecného vzorce II se provede podle postupu uvedeného v příkladě 18A. Ve směsi etylacetátu a etanolu se vytvoří sůl, přidáním kyseliny metansulfonové a počáteční roztok soli o teplotě 55°C se zchladí na 45 °C. Po dosaženi této teploty se začnou tvořit krystaly a ♦ φ·· suspenze zhoustne. Po zvýšení teploty na 51°C se suspenze nechá přes noc stát, čímž by měla být přeměna sloučenin ukončena.

Příklad 20

Příprava N-[1(R)-[(1,2-dihydro-l-metansulfonylspiro[3H-indol-3,4-piperidin]-1'-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropanamid-metansulfonátu (obecný vzorec I)

Přeměna sloučeniny obecného vzorce I na sloučeninu obecného vzorce II se provede mícháním 2-24 hodin roztoku sloučeniny N-[1(R)-[(1,2-dihydro-l-metansulfonyl-spiro[3H-indol-3,4'-piperidin]-1'-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropanamidu obecného vzorce II v isopropanolu při teplotě přibližně 25®C.

Příklad 21

Příprava N- [1 (R) - [ (1,2-dihydro-l-metansulfonylspiro[3H-indol-3,4'-piperidin]-l'-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropanamid-metansulfonátu (obecný vzorec IV)

Ve směsi 24,8 mi etylacetátu, 1,6 ml etanolu a 1,95 ml vody se při' teplotě 42°C a za stálého míchání rozpustí 8,4 g N-[1(R)-[{1,2-dihydro-l-metansulfonyl-spiro[3H-indol-3,4'-piperidin]k. -1' -yl) karbonyl] -2- (fenylmetyloxy) etyl] -2-amino-2-metylpropanamid-metansulfonátu ve vhodné morfologické formě. Při teplotě 40°C se odpaří rozpouštědlo a vytvořená pevná látka se rozemele na jemný prášek, který se vystaví účinku přibližně 75% relativní vlhkosti za vzniku výsledné sloučeniny obecného vzorce

IV.

Příklad 22

Příprava N- [1 (R) - [(1,2-dihydro-l-metansulfonylspiro[3H-indol-3,4'-piperidin]-1'-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropanamid-metansulfonátu (obecný vzorec IV)

Z roztoku etylacetátu, etanolu a vody v poměru objemů

24,8 : 1,6 : 1,95 se ve vhodné morfologické formě nechá krystalizovat N-[1(R)-[(1,2-dihydro-l-metan-sulfonylspiro[3H-indol-3,4'-piperidin]-1'-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropanamid-metansulfonát za vzniku sloučeniny obecného vzorce IV.

Příklad 23

Příprava N-[1(R)-[(1,2-dihydro-l-metansulfonylspiro[3H-indol-3,4'-piperidin]-1'-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropanamid-metansulfonátu obecného vzorce IV

Při teplotě přibližně 25°C se přes noc míchá suspenze sloučeniny

N-[1(R)-[(1,2-dihydro-l-metansulfonyl-spiro[3H-indol-3,4'-piperidin]-l'-yl)karbonyl]-2-(fenylmetyloxy)etyl]-2-amino-2-metylpropanamid-metansulfonátu obecného vzorce I ve směsi isopropylacetátu a etanolu v poměru objemů 90:10 obsahující přibližně 2,8% objemových vody. Vznikne výsledná sloučenina jako t pevná látka. ” ~ i

V popisu a příkladové části byl předmět vynálezu popsán v souvislosti s některými zvláštními a výhodnými provedeními, je však zřejmé, že by odborník mohl navrhnout různé úpravy, změny, modifikace uvedených postupů, zejména pokud jde o vypuš-.

tění, náhradu nebo přidání některých částí postupů, aniž by při tom došlo k odchýlení od smyslu vynálezu.

- 84 Bylo by například možno použít jiné účinné dávky, než jsou svrchu uvedené dávky, zejména v důsledku změn v reakci savce na léčení nebo vzhledem k onemocnění, při němž by byly účinné látky použity. Specifické reakce na účinnou látku se totiž mohou měnit v závislosti na typu účinné látky nebo na zvoleném farmaceutickém nosiči, na zvolené lékové formě a způsobu podávání a takové očekávané změny je zapotřebí brát do úvahy. Svrchu uvedené údaje tedy nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Zastupuje:

Claims (28)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Polymorfní formaN-/l(R)-/(l,2-dihydro-l-methansulfonylspiro-/3H-indol-3,4'-piperidin/l'-yl)karbony1/-2-(fenyl- ci v rtg-záření základní hodnoty ohybu 6,5, 14,7, 16,9, 17,1, 17,9, 19,5, 21,1, 21,7 a 22,0° (2 theta).
2. 2. Polymorfní forma podle nároku 1, jejíž křivka při zahřívání v diferenciálním kalorimetru rychlostí 10 °C/min pod dusíkem je endothermní křivka pro tání s extrapolovanou teplotou začátku tání 170 °C.
3. 3. Polymorfní forma podle nároku 1, jejíž rozpustnost v isopropanolu je 4,6 mg/ml.
4. 4. Polymorfní forma podle nároku 1, která se jeví v polarizovaném světle jako dvojlomná.
5. 5. Polymorfní forma N-/l(R)-/(l,2-dihydro-l-methansulfonylspiro/-3H-indol-3,4'-piperidin-/l'-yl)karbonyl/-2-(fenylmethyloxy )ethyl/-2-amino-2-methylpΓopanamidmethan- ₁₁ sulfonátu, označovaná jako forma IV, u níž je možno pozoro- j--------..... vat”při^_difrák’ci rtg-záření základní hodnoty ohybu 16,0,

   16,2, 18,3, 20,1, 21,0 a 24,2° (2 theta).
6. 6. Polymorfní forma podle nároku 5, jejíž křivka při zahřívání v diferenciálním kalorimetru rychlostí 10 °C/min pod dusíkem je endothermní křivka pro ztrátu vody při tep-lotě 45 °C, následovaná endothermní křivkou pro tání s extrapolovanou teplotou začátku tání 129 °C.

   • ···
7. 7. Polymorfní forma podlé nároku 5, obsahující 3,5 mol vody na 1 mol N-/l(R)-/(l,2-dihydro-l-methansulfonylspiro-/3-indol-3,4^<’-piperidin/-l'’-yl)karbonyl/-2-(fenylmethyloxy)ethyl/-2-amino-2-methylpropanamidmethansulfonátu.
8. 8. Farmaceutický prostředek, vyznačující se t í m , že obsahuje farmaceutický nosič a účinné množství polymorfní formy podle nároku 1.
9. 9. Farmaceutický prostředek pro léčení osteoporosy, vyznačující se tím, že obsahuje kombinaci bifosfonátu a polymorfní formy podle nároku 1 =
10. 10. Farmaceutický prostředek podle nároku ^vyznačující se tím, že jako bifosfonát obsahuje alendronát.
11. 11. Farmaceutický prostředek, vyznačující se t í m , že obsahuje farmaceutický nosič a účinné množství polymorfní formy podle nároku 5.
12. 12. Farmaceutický prostředek pro léčení osteoporosy, vyznačující se tím, že obsahuje kombinaci bifosfonátu a polymorfní formy podle nároku 5.

    ______
13. 13..._Earmaceu-t-i-ck-ý-p-rostředek'’poďle“n'ár'dku’ ‘12’, ..... značující se tím, že jako bifosfonát obsahuje alendronát.
14. 14. Způsob zvyšování koncentrace endogenního růstového hormonu u člověka nebo jiného živočicha, vyznačuj í cí se tím, že se podává účinné množství polymorfní formy podle nároku 1.

    *«·« · ·
15. 15. Způsob zvyšování koncentrace endogenního růstového hromonu u člověka nebo jiného živočicha, vyznačující se tím, že se podává účinné množství polymorfní formy podle nároku 1, v kombinaci s další látkou, zvyšující sekreci růstového hormonu.
16. 16. Způsob podle nároku 15, vyznačující

    I s e t í m , že se další látka, zvyšující sekreci růstového

    1 hormonu volí ze skupiny peptidu GHRP-6, uvolňujícího růstový hormon, peptidu GHRP-2, uvolňujícího růstový hormon, peptidu GHRP-1, uvolňujícího růstový hormon, B-HT92O, faktoru pro uvolňování růstového hormonu, faktoru pro uvolnění analogu růstového hormonu, IGF-1 a IGF-2.
17. 17. Způsob zvyšování využití krmivá, podpory růstu, zvyšování produkce mléka a zlepšení kvality karkasu u hospodářských zvířat; vyznačující se tím, že se těmto hospodářským zvířatům podává účinné množství polymorfní formy podle nároku 1.
18. 18. Způsob léčení nebo prevence stavů ze skupiny osteoporosa, katabolická onemocnění, nedostatečnost imunitního systému včetně stavů se sníženým poměrem buněk Τ^/Τ.θ, zlomeniny kyčle, poruchy svalového a kosterního sysému u starých lidí, nedostatek růstového hormonu u dospe-

    Λ lých nebo u dětí, obezita, kachexie . ,.a_ztrá,t.a„b.álkov.in_při_______ ] chronických onemocněních, jako AIDS nebo zhoubných nádorů, léčení nemocných, zotavujících se po závažných chirurgických zákrocích, poraněních nebo popáleninách, vyznačující se tím, že se podává účinné množství polymorfní formy podle nároku 1.
19. 19. Způsob léčeni osteoporosy, vyznačuj ící se t í m , že se podává kombinace bifosfonátu a polymorfní formy podle nároku 1.

    • ΦΦΦ Φ· * · φφφ · · ♦· * · · φ φ · · ·· · φ · φ · · » · φφφ φφ φφ φφ ··
20. 20. Způsob podle nároku 19, vyznačuj ící se t í m , že se v kombinaci jako bifosfonát podává alendronát.
21. 21. Způsob zvyšování koncentrace endogenního růstového hormonu u člověka nabo jiného živočicha, vyznačující se tím, že se podává účinné množství polymorfní formy podle nároku 5..
22. 22. Způsob zvyšování koncentrace endogenního růstového hromonu u člověka nebo jiného živočicha, vyznačující se tím, že se podává účinné množství polymorfní formy podle nároku 5, v kombinaci s další látkou, zvyšující sekreci růstového hormonu.
23. 23. Způsob podle nároku 22,. vyznačující se t í m , že se další látka, zvyšující sekreci růstového hormonu volí ze skupiny pept.idu GHRP-6, uvolňujícího růstový hormon, peptidu GHRP-2, uvolňujícího růstový hormon, peptidu GHRP-1, uvolňujícího růstový hormon, B-HT92O, faktoru pro uvolňování růstového hormonu, faktoru pro uvolnění analogu růstového hormonu, IGF-1 a IGF-2.
24. 24. > Způsob zvyšování využití krmivá, podpory růstu, zvyšování produkce mléka a zlepšení kvality karkasu u hospodářských zvířat,_v_ y .z_.n.a_S_;.u j„_í_ c..i. s.„e.._t„í„m_;,_.že. se- — těmto hospodářským zvířatům podává účinné množství polymorfní formy podle nároku 5.
25. 25. Způsob léčení nebo prevence stavů ze skupiny osteoporosa, katabolická onemocnění, nedostatečnost imunitního systému včetně stavů se sníženým poměrem buněk zlomeniny kyčle, poruchy svalového a kosterního sysému u starých lidí, nedostatek růstového hormonu u dospě* ··· • ♦ · 'v lých nebo u dětí, obezita, kachexie a ztráta bílkovin při chronických onemocněních, jako AIDS nebo zhoubných nádorů, léčení nemocných, zotavujících se po závažných chirurgických zákrocích, poraněních nebo popáleninách, vyznás e t í m , že se podává účinné množství polymorfní formy podle nároku 5.
26. 26. Způsob léčení osteoporosy, vyznačující se tím’, že se podává kombinace bifosfonátu a polymorfní formy podle nároku 5.
27. 27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se t í m , že se jako bifosfonát užije alendronát.
28. 28. Způsob výroby polymorfní formy podle nároku 1, označované jako forma I,vyznačující se tím, že se míchá roztok formy II N-/l(Ř)-/(l,.2_!-dihydro-l-methansulfonylspiro/3H/indol-3,4'-piperidin/l'-yl)karbonyl/-2-

    -(fenylmethyloxy)ethyl/-2-amino-2-methylpropanamidmethansulfonát v isopropanolu při teplotě přibližně 25 °C po dobu 2 až 24 hodin.