CZ137597A3 - Konjugáty BDNF a NT-3 s vodou rozpustným polymerem - Google Patents
Konjugáty BDNF a NT-3 s vodou rozpustným polymerem Download PDFInfo
- Publication number
- CZ137597A3 CZ137597A3 CZ971375A CZ137597A CZ137597A3 CZ 137597 A3 CZ137597 A3 CZ 137597A3 CZ 971375 A CZ971375 A CZ 971375A CZ 137597 A CZ137597 A CZ 137597A CZ 137597 A3 CZ137597 A3 CZ 137597A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- bdnf
- polypeptide
- polyethylene glycol
- water
- soluble polymer
- Prior art date
Links
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 title claims abstract description 33
- 101150035467 BDNF gene Proteins 0.000 title 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 claims abstract description 124
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 claims abstract description 124
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 76
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 68
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims abstract description 66
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 65
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 41
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 38
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 35
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 18
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 16
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 claims description 13
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 claims description 12
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 claims description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 5
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 4
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 4
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 4
- 235000019422 polyvinyl alcohol Nutrition 0.000 claims description 4
- VDFVNEFVBPFDSB-UHFFFAOYSA-N 1,3-dioxane Chemical compound C1COCOC1 VDFVNEFVBPFDSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 3
- 229920001583 poly(oxyethylated polyols) Polymers 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 3
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 4
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 claims 4
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims 2
- 229920000191 poly(N-vinyl pyrrolidone) Polymers 0.000 claims 2
- ODIGIKRIUKFKHP-UHFFFAOYSA-N (n-propan-2-yloxycarbonylanilino) acetate Chemical compound CC(C)OC(=O)N(OC(C)=O)C1=CC=CC=C1 ODIGIKRIUKFKHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 claims 1
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 claims 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 claims 1
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 claims 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims 1
- -1 for instance Polymers 0.000 abstract description 4
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 38
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 19
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 17
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 16
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 15
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 14
- 238000005932 reductive alkylation reaction Methods 0.000 description 14
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 12
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 12
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 11
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 11
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 11
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 11
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 11
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 7
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 description 6
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 6
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 5
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 5
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 5
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- PHKQVWWHRYUCJL-HJOGWXRNSA-N Tyr-Phe-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O PHKQVWWHRYUCJL-HJOGWXRNSA-N 0.000 description 4
- 108010009111 arginyl-glycyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 210000000256 facial nerve Anatomy 0.000 description 4
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 4
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 4
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 4
- CSCSROFYRUZJJH-UHFFFAOYSA-N 1-methoxyethane-1,2-diol Chemical compound COC(O)CO CSCSROFYRUZJJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N Ala-Leu-Thr Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 3
- TULNGKSILXCZQT-IMJSIDKUSA-N Cys-Asp Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O TULNGKSILXCZQT-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 3
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 3
- 230000006576 neuronal survival Effects 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 229940124606 potential therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 210000003594 spinal ganglia Anatomy 0.000 description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- CXCHEKCRJQRVNG-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoroethanesulfonyl chloride Chemical compound FC(F)(F)CS(Cl)(=O)=O CXCHEKCRJQRVNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- BVSGPHDECMJBDE-HGNGGELXSA-N Ala-Glu-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N BVSGPHDECMJBDE-HGNGGELXSA-N 0.000 description 2
- IASNWHAGGYTEKX-IUCAKERBSA-N Arg-Arg-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(O)=O IASNWHAGGYTEKX-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- IOXWDLNHXZOXQP-FXQIFTODSA-N Asp-Met-Ser Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N IOXWDLNHXZOXQP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- CEZSLNCYQUFOSL-BQBZGAKWSA-N Cys-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O CEZSLNCYQUFOSL-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- DTLLNDVORUEOTM-WDCWCFNPSA-N Glu-Thr-Lys Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O DTLLNDVORUEOTM-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 2
- UQJNXZSSGQIPIQ-FBCQKBJTSA-N Gly-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN UQJNXZSSGQIPIQ-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 2
- FXTUGWXZTFMTIV-GJZGRUSLSA-N Gly-Trp-Arg Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)CN FXTUGWXZTFMTIV-GJZGRUSLSA-N 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- STGQSBKUYSPPIG-CIUDSAMLSA-N His-Ser-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 STGQSBKUYSPPIG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- GYAFMRQGWHXMII-IUKAMOBKSA-N Ile-Asp-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N GYAFMRQGWHXMII-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 2
- CKRFDMPBSWYOBT-PPCPHDFISA-N Ile-Lys-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N CKRFDMPBSWYOBT-PPCPHDFISA-N 0.000 description 2
- KGCLIYGPQXUNLO-IUCAKERBSA-N Leu-Gly-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O KGCLIYGPQXUNLO-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- GCMWRRQAKQXDED-IUCAKERBSA-N Lys-Glu-Gly Chemical compound [NH3+]CCCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CCC([O-])=O)C(=O)NCC([O-])=O GCMWRRQAKQXDED-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- BCRQJDMZQUHQSV-STQMWFEESA-N Met-Gly-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O BCRQJDMZQUHQSV-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N Nalpha-L-Leucyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N Propionic aldehyde Chemical compound CCC=O NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SQBLRDDJTUJDMV-ACZMJKKPSA-N Ser-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O SQBLRDDJTUJDMV-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- VQBCMLMPEWPUTB-ACZMJKKPSA-N Ser-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VQBCMLMPEWPUTB-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N Sulfisoxazole Chemical compound CC1=NOC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=C1C NHUHCSRWZMLRLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N Thr-Ala-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 2
- GNHRVXYZKWSJTF-HJGDQZAQSA-N Thr-Asp-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O GNHRVXYZKWSJTF-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- WCRFXRIWBFRZBR-GGVZMXCHSA-N Thr-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 WCRFXRIWBFRZBR-GGVZMXCHSA-N 0.000 description 2
- GQHAIUPYZPTADF-FDARSICLSA-N Trp-Ile-Arg Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)=CNC2=C1 GQHAIUPYZPTADF-FDARSICLSA-N 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 2
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000007441 retrograde transport Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000011421 subcutaneous treatment Methods 0.000 description 2
- 210000003523 substantia nigra Anatomy 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 2
- AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) propanoate Chemical compound CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UPXRTVAIJMUAQR-UHFFFAOYSA-N 4-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-1-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound C1C(C(O)=O)N(C(=O)OC(C)(C)C)CC1NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 UPXRTVAIJMUAQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- APRZHQXAAWPYHS-UHFFFAOYSA-N 4-[5-[3-(carboxymethoxy)phenyl]-3-(4,5-dimethyl-1,3-thiazol-2-yl)tetrazol-3-ium-2-yl]benzenesulfonate Chemical compound S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=C(OCC(O)=O)C=CC=2)=NN1C1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1 APRZHQXAAWPYHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004042 4-aminobutyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 1
- RDIKFPRVLJLMER-BQBZGAKWSA-N Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N RDIKFPRVLJLMER-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- SVHRPCMZTWZROG-DCAQKATOSA-N Arg-Cys-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N SVHRPCMZTWZROG-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- AUFHLLPVPSMEOG-YUMQZZPRSA-N Arg-Gly-Glu Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AUFHLLPVPSMEOG-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- QKSAZKCRVQYYGS-UWVGGRQHSA-N Arg-Gly-His Chemical compound N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(O)=O QKSAZKCRVQYYGS-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- UAOSDDXCTBIPCA-QXEWZRGKSA-N Arg-Ile-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N UAOSDDXCTBIPCA-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- NIELFHOLFTUZME-HJWJTTGWSA-N Arg-Phe-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O NIELFHOLFTUZME-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 1
- XNSKSTRGQIPTSE-ACZMJKKPSA-N Arg-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O XNSKSTRGQIPTSE-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- ZPWMEWYQBWSGAO-ZJDVBMNYSA-N Arg-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ZPWMEWYQBWSGAO-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 1
- SONUFGRSSMFHFN-IMJSIDKUSA-N Asn-Ser Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SONUFGRSSMFHFN-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- CELPEWWLSXMVPH-CIUDSAMLSA-N Asp-Asp-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CELPEWWLSXMVPH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- NVFSJIXJZCDICF-SRVKXCTJSA-N Asp-Lys-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N NVFSJIXJZCDICF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- GCACQYDBDHRVGE-LKXGYXEUSA-N Asp-Thr-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@H](O)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O GCACQYDBDHRVGE-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- 102100021277 Beta-secretase 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710150190 Beta-secretase 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010041884 CD4 Immunoadhesins Proteins 0.000 description 1
- 101100289888 Caenorhabditis elegans lys-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100315624 Caenorhabditis elegans tyr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 241001573498 Compacta Species 0.000 description 1
- HAYVTMHUNMMXCV-IMJSIDKUSA-N Cys-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CS HAYVTMHUNMMXCV-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- BYALSSDCQYHKMY-XGEHTFHBSA-N Cys-Arg-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CS)N)O BYALSSDCQYHKMY-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- YZFCGHIBLBDZDA-ZLUOBGJFSA-N Cys-Asp-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YZFCGHIBLBDZDA-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- WXOFKRKAHJQKLT-BQBZGAKWSA-N Cys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CS WXOFKRKAHJQKLT-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- BNCKELUXXUYRNY-GUBZILKMSA-N Cys-Lys-Glu Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N BNCKELUXXUYRNY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WYVKPHCYMTWUCW-YUPRTTJUSA-N Cys-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O WYVKPHCYMTWUCW-YUPRTTJUSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- FBEJIDRSQCGFJI-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FBEJIDRSQCGFJI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- QOXDAWODGSIDDI-GUBZILKMSA-N Glu-Ser-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N QOXDAWODGSIDDI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- TWYSSILQABLLME-HJGDQZAQSA-N Glu-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O TWYSSILQABLLME-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- MIWJDJAMMKHUAR-ZVZYQTTQSA-N Glu-Trp-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N MIWJDJAMMKHUAR-ZVZYQTTQSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 description 1
- XCLCVBYNGXEVDU-WHFBIAKZSA-N Gly-Asn-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XCLCVBYNGXEVDU-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- YZACQYVWLCQWBT-BQBZGAKWSA-N Gly-Cys-Arg Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O YZACQYVWLCQWBT-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- YIWFXZNIBQBFHR-LURJTMIESA-N Gly-His Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CN=CN1 YIWFXZNIBQBFHR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- UTYGDAHJBBDPBA-BYULHYEWSA-N Gly-Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)CN UTYGDAHJBBDPBA-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- 206010019196 Head injury Diseases 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- FONIDUOGWNWEAX-XIRDDKMYSA-N His-Trp-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O FONIDUOGWNWEAX-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- 101000739876 Homo sapiens Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 101000634196 Homo sapiens Neurotrophin-3 Proteins 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- ATXGFMOBVKSOMK-PEDHHIEDSA-N Ile-Arg-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O)N ATXGFMOBVKSOMK-PEDHHIEDSA-N 0.000 description 1
- HVWXAQVMRBKKFE-UGYAYLCHSA-N Ile-Asp-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N HVWXAQVMRBKKFE-UGYAYLCHSA-N 0.000 description 1
- BGZIJZJBXRVBGJ-SXTJYALSSA-N Ile-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O)N BGZIJZJBXRVBGJ-SXTJYALSSA-N 0.000 description 1
- RWYCOSAAAJBJQL-KCTSRDHCSA-N Ile-Gly-Trp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N RWYCOSAAAJBJQL-KCTSRDHCSA-N 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- HQUXQAMSWFIRET-AVGNSLFASA-N Leu-Glu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN HQUXQAMSWFIRET-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- IDGZVZJLYFTXSL-DCAQKATOSA-N Leu-Ser-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IDGZVZJLYFTXSL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- LJBVRCDPWOJOEK-PPCPHDFISA-N Leu-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O LJBVRCDPWOJOEK-PPCPHDFISA-N 0.000 description 1
- URHJPNHRQMQGOZ-RHYQMDGZSA-N Leu-Thr-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O URHJPNHRQMQGOZ-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- BRSGXFITDXFMFF-IHRRRGAJSA-N Lys-Arg-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)N BRSGXFITDXFMFF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- JPNRPAJITHRXRH-BQBZGAKWSA-N Lys-Asn Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O JPNRPAJITHRXRH-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- HQVDJTYKCMIWJP-YUMQZZPRSA-N Lys-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O HQVDJTYKCMIWJP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- CTBMEDOQJFGNMI-IHPCNDPISA-N Lys-His-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CN=CN3)NC(=O)[C@H](CCCCN)N CTBMEDOQJFGNMI-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- ZJWIXBZTAAJERF-IHRRRGAJSA-N Lys-Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N ZJWIXBZTAAJERF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- PLDJDCJLRCYPJB-VOAKCMCISA-N Lys-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PLDJDCJLRCYPJB-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- LKDXINHHSWFFJC-SRVKXCTJSA-N Lys-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)N LKDXINHHSWFFJC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- RMOKGALPSPOYKE-KATARQTJSA-N Lys-Thr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RMOKGALPSPOYKE-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- TZLYIHDABYBOCJ-FXQIFTODSA-N Met-Asp-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O TZLYIHDABYBOCJ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800000135 N-terminal protein Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101800001452 P1 proteinase Proteins 0.000 description 1
- 108091006006 PEGylated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 201000007737 Retinal degeneration Diseases 0.000 description 1
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 1
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 1
- WTWGOQRNRFHFQD-JBDRJPRFSA-N Ser-Ala-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O WTWGOQRNRFHFQD-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- QFBNNYNWKYKVJO-DCAQKATOSA-N Ser-Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CCCN=C(N)N QFBNNYNWKYKVJO-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- BRIZMMZEYSAKJX-QEJZJMRPSA-N Ser-Glu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N BRIZMMZEYSAKJX-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- QBUWQRKEHJXTOP-DCAQKATOSA-N Ser-His-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O QBUWQRKEHJXTOP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- UIPXCLNLUUAMJU-JBDRJPRFSA-N Ser-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UIPXCLNLUUAMJU-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- OWCVUSJMEBGMOK-YUMQZZPRSA-N Ser-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O OWCVUSJMEBGMOK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- HHJFMHQYEAAOBM-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HHJFMHQYEAAOBM-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- NBIIPOKZPUGATB-BWBBJGPYSA-N Thr-Ser-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O NBIIPOKZPUGATB-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- AOAMKFFPFOPMLX-BVSLBCMMSA-N Trp-Arg-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 AOAMKFFPFOPMLX-BVSLBCMMSA-N 0.000 description 1
- UKINEYBQXPMOJO-UBHSHLNASA-N Trp-Asn-Ser Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N UKINEYBQXPMOJO-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- ZSXJENBJGRHKIG-UWVGGRQHSA-N Tyr-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 ZSXJENBJGRHKIG-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- NOSIYYJFMPDDSA-UHFFFAOYSA-N acepromazine Chemical compound C1=C(C(C)=O)C=C2N(CCCN(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 NOSIYYJFMPDDSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005054 acepromazine Drugs 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 229940060205 adagen Drugs 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000003444 anaesthetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013103 analytical ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- WVMHLYQJPRXKLC-UHFFFAOYSA-N borane;n,n-dimethylmethanamine Chemical compound B.CN(C)C WVMHLYQJPRXKLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RJTANRZEWTUVMA-UHFFFAOYSA-N boron;n-methylmethanamine Chemical compound [B].CNC RJTANRZEWTUVMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NNTOJPXOCKCMKR-UHFFFAOYSA-N boron;pyridine Chemical compound [B].C1=CC=NC=C1 NNTOJPXOCKCMKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010046910 brain-derived growth factor Proteins 0.000 description 1
- ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N butyric aldehyde Natural products CCCC=O ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 210000001653 corpus striatum Anatomy 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 210000005064 dopaminergic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 108010020688 glycylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 108010084389 glycyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 210000004884 grey matter Anatomy 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 102000051542 human BDNF Human genes 0.000 description 1
- 102000057714 human NTF3 Human genes 0.000 description 1
- 229940077456 human brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 150000002463 imidates Chemical class 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960004184 ketamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 238000004989 laser desorption mass spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 1
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000032405 negative regulation of neuron apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003955 neuronal function Effects 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 1
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 1
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 1
- 210000004896 polypeptide structure Anatomy 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- CCOXWRVWKFVFDG-UHFFFAOYSA-N pyrimidine-2-carbaldehyde Chemical compound O=CC1=NC=CC=N1 CCOXWRVWKFVFDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920005604 random copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004258 retinal degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000013223 sprague-dawley female rat Methods 0.000 description 1
- 238000004544 sputter deposition Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003901 trigeminal nerve Anatomy 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/839—Nerves; brain
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Treatment Of Sludge (AREA)
- Treatment Of Water By Ion Exchange (AREA)
- Physical Or Chemical Processes And Apparatus (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Pyrrole Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Hydrogenated Pyridines (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
Description
Oblast techniky
Vynález se týká nové třídy BDNF a NT-3 derivátů, ve kterých je BDNF a NT-3 molekula navázána na vodou rozpustný polymer, a způsobu přípravy těchto derivátů.
Dosavadní stav techniky
Proteiny určené pro terapeutické použití jsou v současné době dostupné v adekvátních množstvích ve vhodných formách, které jsou z velké části výsledkem rekombinantních DNA technologií. Chemické deriváty těchto proteinů mohou účinně blokovat proteolytické enzymy před fyzikálním kontaktem s proteinovým hlavním řetězcem a tak zabraňovat degradaci. Dalšími výhodami může být, za určitých podmínek, zvýšení stability terapeutického proteinu, prodloužení cirkulační doby terapeutického proteinu a snížení jeho imunogenicity. Je však třeba uvést, že účinek modifikace příslušného proteinu nelze předpokládat. Přehledným článkem, popisujícím modifikaci proteinů a fúzní proteiny je Francisův článek „Focus on Growth Factors 3: 4-10, pub. Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lané, Londýn, Anglie (1992).
nebo -„peg) používá při terapeutických proteinových proteinů). Pro ošetření
Polyethylenglykol („PEG chemická část, která se („pegylatizaci) („pegylátovaných kombinovaných imunodeficientních chorob byl je jediná přípravě produktů vážných například • · • ··
I · · • · · ·· ···· vyvinut Adagen, což je formulace pegylované adenosindeaminázy. Při klinických testech zaměřených na ošetření poranění hlavy byla použita pegylatovaná superoxiddismutáza. V první fázi klinických testů, zaměřených na léčení hepatitidy, se prováděly testy s pegylátovaným alfa interferónem. Rovněž existují záznamy o předklinických testech prováděných s pecvláto-vanou. glukocerebrosidázou a pegylovaným hemoglobinem. Ukázalo se, že některým proteinům poskytuje navázání polyethylenglykoluochranu před proteolýzou, Sada a kol., J. Fermentation Bioengíneeríng 71; 137 až 139 (1991) . Způsoby navázání určitých polyethylenových zbytků jsou již dostupné, viz patent US 4,179,337 (Davis a kol.) a patent US 4,002,531 (Royer) a přehled viz Abuchowski a kol.
Dalšími vodou rozpustnými polymery, které se používají pro modifikaci proteinů, jsou například kopolymery ethylenglykolu a propylenglykolu, karboxymethylcelulóza, dextran, polyvínylakohol, polyvinylpyrrolidon, poly-1,3dioxan, poly-1,3,6-trioxan, kopolymery ethylenu a anhydridu kyseliny maleinové a polyaminové kyseliny (buď homopolymery nebo nahodilé kopolymery).
Pro navázání polyethylenglykolových molekul na protein se používá celá řady prostředků. Polyethylenglykolové molekuly se váží na protein zpravidla přes reakční skupinu, která je součástí proteinu. Pro' toto navázání jsou vhodné aminoskupiny, například aminoškupiny na lysihových zbytcích nebo N-koncích. Výše jmenovaný Royerův patent například uvádí, že pro navázání polyethylenglykolových molekul na enzym se používá redukční alkylace. Evropská patentová přihláška 0 539 167, publikovaná 28. dubna 1993, cituje, že peptidy a organické sloučeniny s volnou aminoskupinou • *· · · (amínoskupinami) se modifikují imidátovým derivátem PEG nebo příbuznými vodou rozpustnými organickými polymery. Patent US 4,904,584 (Shaw) se týká modifikace lysinových zbytků v proteinech, používané při navazování polyethylenglykolových molekul pomocí reakčních aminových skupin.
Specifickým terapeutickým proteinem, který již byl chemicky modifikován, je stimulační faktor granulocytové kolonie, tj. G-CSF, viz Evropské patentové přihlášky EP 0 401 384, EP 0 473 268 a EP 0 335 432. Dalším příkladem specifického terapeutického proteinu je pegylátovaný IL-6, popsaný v patentu US 5,264,209 (Mikayama a kol.). Evropská patentová přihláška 0 154 316, publikovaná 11. září 1985 rovněž popisuje reakci lymfokinu s aldehydem polyethylenglykolu.
Produktem pegylace proteinových molekul je zpravidla směs chemicky modifikovaných proteinových molekul. Pro ilustraci lze uvést případ, kdy proteinové molekuly s pěti lysinovými zbytky a třemi amínoskupinami na N-konci, pokud se použijí ve výše popsaných reakcích, poskytnou heterogenní směs, kdy část produktu má šest ' polyethylenglykolových zbytků, část produktu má pět, čtyři, tři, dva nebo jeden polyethylenglykolový zbytek a část tohoto produktu nemá na sobě navázaný žádný polyethylenglykolový zbytek. Polyethylenglykolové zbytky nemusí být u různých molekul, obsahujících několik polyethylenglykolových zbytků, navázány ve stejném místě. U výše popsaných metod je zpravidla žádoucí, aby byla mezi proteinem a polyethylenglykolovou molekulou přítomna vazebné skupiny. Součástí postupu, který popisuje Delgado a kol., v „Coupling of PEG to Protein by Activation with Tresyl • v • · * * · · ♦ • · · · · · · ·· • « · · · ♦ ······ • · ·«« · * · ·»·· ··· ·· · ·· ··
I ί
Chloride, Aplications In Immunoaffinity Cell Partitioning, Separations Using Aqueous Phase Systems, Applications In Cell Biology and Biotechnology, Plenům Press, New York, NY (1989), na stránkách 211 až 213, je zabudování tresylchloridu, který eliminuje potřebu vazebné skupiny mezi proteinem a polyethylenglykolovou molekulou. Použití tohoto způsobu při výrobě terapeutických produktů může být obtížné, protože použití tresylchloridu s sebou přináší vznik toxických vedlejších produktů.
Chamow a kol., Bioconjugate Chem. 5:133 až 140 (1994) popisuje modifikaci CD4 imunoadresinu monomethoxyethylenglykolaldehydem („MePEG glykolaldehydem) za použití redukční alkylace. Autoři uvádějí, že vazebná schopnost modifikovaného CD4-IgG (na proteinový gp 120) in vitro se snižuje rychlostí odpovídající rozsahu MePEGylatizace.
Růstový faktor odvozený z mozku (BDNF) a neutrofin-3 (NT-3) jsou známými polypeptidy, spadajícími do třídy neurotrofních faktorů, označovaných jako neurotrofiny, která rovněž zahrnuje nervový růstový faktor (NGF). Tyto faktory podporují přežívání neuronů a zachování jejich funkce a jsou hlavními kandidáty při terapeutickém léčení neurodegenerativních onemocnění, Bardě a kol., Neuron 2:1525 až 1534 (1989); Snider a kol., Cell 77:627 až 638 (1994). Způsoby identifikace a rekombinantní produkce těchto faktorů byly již v patentové literatuře popsány, viz například viz patent US 5,169,762 (Gray a kol.) pro NFG, patenty US 5,180,820 (Barde a kol.) a 5,229,500 (Barde a kol.) pro BDNF a publikovaná PCT přihláška č. WO 91/03569 pro NT-3.
• · • · · • · · » «······· ·· t
Podstata vynálezu
Jak již bylo uvedeno, vynález se obecně týká BDNF a NT-3 derivátů, ve kterých jsou BDNF nebo NT-3 polypeptidové zbytky navázány na vodou rozpustný polymer.
Konkrétněji se vynález týká BDNF a NT-3 derivátů, které jsou produktem reakce polypetidů s reakčnimi (tj. „aktivovanými) vodou rozpustnými polymerními částmi, při které se uvedený polymer naváže na polypeptid. Tohoto navázáni lze dosáhnout použitím zde popsaných reakcí, jakými jsou acylace nebo alkylace. Acylace nebo alkylace s polyethylenglykolem nebo jiným vodou rozpustným polymerem se může provádět za' podmínek, za kterých se získá hlavní monoderivatizovaný (monofunkcionalizovaný) nebo polyderivatizovaný (polyfunkcionalizovaný) produkt. Polyderivatizace zpravidla zahrnuje navázání polyethylenglykolu nebo jiného vodou rozpustného polymeru na ε-aminoskupiny lysinových zbytků polypeptidu a může dále zahrnovat navázání polymeru na N-konec polypeptidu. Monoderivatizace výhodně zahrnuje navázání polymeru na α-aminoskupinu zbytku BDNF nebo NT-3 polypeptidového zbytku s N-zakončením, tj . selektivní navázání vodou rozpustné polymerové části na N-konec polypeptidu. Monoderivatizace tedy v podstatě poskytuje homogenní přípravek polymer/BDNF nebo polymer/NT-3 konjugátových molekul a stejně tak (pokud se použije polyethylenglykol) přípravek pegylátovaných BDNF nebo NT-3 molekul, které mají polyethylenglykolovou část navázanou přímo na BDNF nebo NT-3 část.
BDNF a NT-3 deriváty podle vynálezu jsou použitelné pro stejné účely jako trofické faktory BDNF resp. NT-3. Těmito účely je zejména podpora přežívání neuronů a jejich • · • · · · · · » « · ♦ · * · ·· • · v · β * ··· · * • « « · * · •v «· ♦ ·♦ ·· funkčnosti in vitro a in vívo a rovněž mohou být použity jako potenciální terapeutická činidla pro léčení neurodegenerativních onemocnění u lidí, zahrnujících kromě jiných například Parkinsonovu amyotrofickou laterální sklerózu (ALS), Huntingtonovu chorobu, retinální degeneraci, periferální neuropatii a Alzheimerovu chorobu.
Jak ukazuji některé níže uvedené příklady, derivatizace_ (modifikace) podle vynálezu může rovněž zlepšovat schopnosti molekuly migrovat mozkovou tkání, a tedy usnadňovat dopravu účinné látky do terapeuticky cílových míst uvnitř mozku.
Vynález dále poskytuje způsob přípravy výše zmíněné množiny BDNF a NT-3 derivátů, ve kterých jsou' voďoů rozpustné polymery, zejména polyethylenglykol, navázány na α-aminoskupinu na N-konci polypeptidu (BDNF nebo NT-3) za vzniku homogenní populace derivatizovaných molekul, tj. konjugátů těchto polypeptidu s polymerem.
Stručný popis obrázků
Obr. 1 znázorňuje příklad BDNF (nebo NT-3) acylace, prováděné za použití N-hydroxysukcinimidylových (NHS) aktivních esterů monoethoxypolyethylenglykolaldehydů, jejímž produktem je polypegylátovaný BDNF nebo NT-3, přičemž k označuje počet MPEG molekul zreagovaných s molekulou BDNF nebo NT-3, n označuje stupeň polymerace MPEG, použitého při reakci (n = 2000 pro MPEG, mající molekulovou hmotnost 100 kDa a n = 40 pro MPEG, mající molekulovou hmotnost 2 kDa) a m označuje celkový počet primárních aminoskupin na BDNF nebo NT-3 molekulu.
» · • · • · · · · · · • · · o · · * · · · · • · · · * ·
Obr. 2 znázorňuje příklad nespecifické redukční alkylace BDNF (nebo NT-3), prováděné za použití monomethoxyethylenglykolových aktivních aldehydů, jejímž produktem je polypegylátovaný produkt, přičemž k, m a n jsou definovány stejně jako na předchozím obrázku.
Obr. 3 znázorňuje příklad místně specifické redukční alkylace BDNF nebo NT-3 na α-aminoskupině N-zakončeného polypeptidového zbytku, která se provádí za použití monomethoxyethylenglykolových aktivovaných aldehydů a která poskytuje v podstatě monopegylátovaný produkt (na N-konci).
obr. 4 znázorňuje cholinacetyltransferázovou (ChAT) imunohistochemii axotomizovaných .faciálních motoneutronů na in vívo zvířecím modelu, navrženém pro testování ztráty periferní nervové funkce. Yan a kol., J. Neurosci. 14(9):5281 až 5291 (1994). Pravé faciální nervy dospělých krysích samiček se přerušily a zvířata se ošetřovala každodenně po dobu sedmi následujících dní subkutánním způsobem: PBS (A); nepegylátovaným BDNF v dávce 5 miligramů na kilogram tělesné hmotnosti, mg/kg, (B); pegylátovaným na N-zakončení v dávce 0,3 miligramů na kilogram tělesné hmotnosti, mg/kg, (C); nebo nahodile pegylátovaným BDNF v dávce 0,3 miligramů na kilogram tělesné hmotnosti, mg/kg (D) . U krys ošetřených PBS měla axotomie za následek velký pokles ChAT imunoreaktivity v poškozených faciálních jádrech, (pod písmenem A faciální jádra na pravé straně). Na druhé straně ošetření jak nepegylátovaným BDNF, tak pegylátovaným BDNF (pod písmenem C a D) tlumí poraněním indukovaný pokles ChAT imunoreaktivity. Použité symboly mají následující význam: FN - faciální jádro; py pyrimidalní trakt; Sp5 - jádro spinálního trojklanného nervu. Měřítko (pod písmenem D) představuje 1 mm.
«·· · · · · · • » » * · · ·· • » « · · ··· · * * · · · · · • ·· · ·· ·♦
Obr, 5 znázorňuje křivku vyjadřující závislosti dávka - odezva po ošetření testovaných zvířat nepegylátovaným BDNF a pegylátovaným BDNF na stejném modelu axotomizováných faciálních motoneuronů jako v příkladu 4. Zvířata dostala denně subkutánní injekci (s.c.) vehikula (O), nepegylátovaného BDNF (□) , N-zakončeného pegylátovaného BDNF (♦), nebo nahodile_p.e.gylát.O-V.aného.
BDNF () v dávkách indikovaných na dobu několika dní. Stanovené hodnoty představovaly průměrné hodnoty + SEM (n=4) Data se analyzovala pomocí ANOVY a následně testem Dunett t. *, p < 0,05; **, p < 0,01, BDNF ošetření vs. vehikulum.
Obr. 6 znázorňuje sloupcový diagram, ukazující průnik nepegylátovaného BDNF („NAT-BDNF) nebo pegylátovaného BDNF („PEG-BDNF) do mozku živých krys po jediné injekci aplikovaní do středu pravého žíhaného tělesa (Corpus Striatum). O dvacet čtyři hodin později se zvířata perfúzně-fixovala 4% paraformaldehydem. Mozky se vyjmuly, dezintegrovaly a napustily protilátkou specifickou pro BDNF. Tento postup popsal Yan a kol., v Soc. Neurosci. Abs. 20:1306 (1994). Celkový objem BDNF penetrace do mozkové tkáně se kvantifikuje integrací všech BDNF imunoreakčních tkáňových sekcí. Stanovené hodnoty představovaly průměrné hodnoty + SEM (n = 4). Data se analyzovala testem Student t. *, P < 0,0001.
Obr. 7 znázorňuje sloupcový diagram, ukazující průnik nepegylátovaného BDNF a pegylátovaného BDNF do mozku živých krys po kontinuálním lokálním několikadenním podání. Celkový objem BDNF průniku se kvantifikoval stejným způsobem jako na obrázku 6. Stanovené hodnoty představovaly ··*· ··« • 4 ·· »· · * · • ♦ · ·♦ ·· průměrné hodnoty + SEM (n = 4). Data se analyzovala testem Student t. *, p < 0,0001.
Obr. 8 znázorňuje retrográdní transport nepegylátovaného BDNF (pod písmeny A a B) a pegylátovaného BDNF (pod písmeny C a D) mozkovou tkání do dopaminergických neuronů, nacházejících se uvnitř mozkové tkáně, po infúzi zavedené do žíhaného tělesa mozku živých krys za použití stejného postupu jako v případě obrázku 7, Pod písmeny Ba Γ jsou zvětšeniny čtvercového výřezu uvedených'pod písmeny Ά resp. C. Symboly pod písmenem A mají následující význam; SNC - subst.antia nigra reticulata; a VTA - ventrální tegmentální oblast. Čára pod písmenem D představuje měřítko, které znamená 500 μτη pro A'a C a 200 μιη pro panely B a D.
Vhodnými pro použití v rámci vynálezu jsou přirozené sekvence BDNF a NT-3 (t. j. přirozeně se vyskytující), a stejně tak jejich fragmenty, prekurzory a polypeptidové molekuly, reprezentující jednu nebo více aminokyselinových substitucí, delecí nebo adicí, které jsou odvozeny z přirozené sekvence a které vykazují biologické vlastnosti podobné biologickým vlastnostem molekul přirozené sekvence, tj. chiméry, analogy a pod.. Výrazy „BDNF a „NT-3 budou, nebude-li stanoveno jinak, zahrnovat tyto polypeptidy v libovolné výše jmenované formě.
Způsoby přípravy BDNF a NT-3, zejména rekombinantními prostředky, které jsou zpravidla nejpraktičtější pro získání větších množství, jsou známy. Použitelné postupy jsou popsány ve vědecké a patentové literatuře, například v již jmenovaných patentech US 5,180,820 a 5,229,500 a publikované PCT přihlášce WO 91/03569. Zvláště výhodné pro • I · « · · · · * · « · · · ♦ ·· « » · « * · · ·»· · · » · · » · ♦ · · ·«»* ··«· ·« « ·· ·· použití v rámci vynálezu jsou přirozené sekvence BDNF a NT3, které jsou exprimované rekombinací v prokaryotických a eukaryotických buňkách včetně rekombinantních polypeptidových produktů, exprimovaňých z lidských nukleotidových sekvencí („r-HuBDNF a „r-HuNT-3) včetně sekvencí exprimovaňých v bakteriálních buňkách, které obsahují na Nkonci methioninový zbytek (tj. „r-metBDNF a „r-me_t.NTr3_l)_.. Příkladem těchto polypeptidů jsou polypeptidy, mající sekvence, které jsou uvedeny v seznamu sekvencí na konci textu přihlášky vynálezu, pod označením SEQ ID No; 1 („rHuBDNF), SEQ ID No: 2 (r-metHuBDNF), SEQ ID No: 3 („rHuNT-3) a SEQ ID No: 4 („r-metHuNT-3).
Pegylatizace BDNF a NT-3 se může provádět pomočí libovolné v daném oboru známé pegylatizační reakce. Viz například: Focus growth Factors 3(2):4-10 (1992;
EP 0 154 316; EP 0 401 384 a další zde citované publikace. Výhodně se pegylatizace provádí pomocí acylační nebo alkylační reakce s molekulou reakčního polyethylenglyko-lu (nebo analogického reakčního vodou rozpustného polymeru). Tyto výhodné způsoby derivatizace za použití polyethylenglykolu budou podrobněji diskutovány níže.
Acylace
Pegylatizace acylací zpravidla zahrnuje reakci aktivního esterového derivátu polyethylenglykolu (PEG) s BDNF nebo NT-3 polypeptidem. Pro provádění pegylatizace těchto polypeptidů lze prakticky použít libovolnou molekulu reakčního PEG. Výhodným aktivovaným PEG esterem je PEG esterifikovaný na N-hydroxysukcinimid („NHS). Výraz „acylace, jak je zde použit, zahrnuje neomezujícím způsobem následující typy vazeb mezi BDNF nebo NT-3 a vodou rozpustným polymerem, například PEG: amidovou,
9999·»*·
9 9 9 9 99 •9 99 · 9999 ·
9 9 9 9 «
9« 9 9 9 9 9 karbamátovou, urethanovou a pod., viz Bioconjugate Chem. 5:133-140 (1994). Pro reakci lze zvolit libovolné známé reakční podmínky, t j. teplotu, rozpouštědlo a pH, nebo následně vyvinuté, které nebudou inaktivovat BDNF nebo NT-3 druhy, určené pro modifikaci. Zpravidla se aplikují reakční podmínky, které budou popsány níže. Příkladná reakce NHS esteru monomethoxy-PEG je znázorněna na obrázku 6.
Pegylatizace alkylací poskytne zpravidla polypegylátovaný BDNF nebo NT-3 produkt, ve kterém budou lysinové ε-aminoskupiny pegylátované přes acylovou vazebnou skupinu. Spojovací vazbou bude výhodně amid. Výsledný produkt bude rovněž výhodně v podstatě (např., > 95%) mono, di- nebo tri-pegylátovaný. Nicméně některé druhy s vyšším stupněm pegylatizace (až maximální počet lysinových ε-aminokyselinových skupin BDNF a NT-3 plus jedna α-aminoskupina na aminoskupinou zakončeném konci BDNF nebo NT-3) budou zpravidla vznikat v množstvích, závisejících na specifických reakčních podmínkách, které se při reakci použijí. Pokud je to žádoucí, lze čistší pegylátované druhy ze směsi obsahující rovněž nezreagované druhy separovat standardními purifikačními technikami, zahrnujícími mimo jiné dialýzu, vysolování, ultrafiltraci, iontoměničovou chromatografii, gelovou filtrační chromatografii a elektroforézu.
Alkylace
Pegylatizace alkylací zpravidla zahrnuje reakci aldehydového derivátu PEG s polypeptidem, například BDNF nebo NT-3, v přítomnosti redukčního činidla. Pegylatizace alkylací může rovněž poskytnout polypegylátovaný BDNF nebo « * ♦
NT-3. Příkladnou redukční alkylační reakci, která poskytuje polypegylátovaný produkt, znázorňuje obrázek 7. Navíc v případě vhodně použitých reakčních podmínek lze dosáhnout pegylatizace, která proběhne v podstatě pouze na N-konci α-aminoskupiny BDNF nebo NT-3 polypeptidu (tj., dochází výlučně k tvorbě monopegylátovaných druhů). Příkladnou redukční alkylační reakci s BDNF nebo__N.Tj^3.f__k.t.erá—posky-tu-j-e--— monopegylátovaný produkt, znázorňuje obrázek 8. V dalších případech monopegylatizace nebo polypegylatizace se PEG skupiny výhodně naváží na polypeptid přes -CH2-NH- skupinu.
‘ Pokud jde o -CH2- skupinu, tento typ vazby se zde označuje jako „alkylová vazba.
Modifikace neboli' derivatižacé pomocí redukční alkylace.poskytuje monopegylátovaný produkt, který využívá různé reaktivity různých typů primárních aminoskupin (lysin vs. N-koncová), které jsou k dispozici pro derivatizaci BDNF nebo NT-3. Reakce se provádí při pH (viz níže), které umožňuje využít výhody rozdílných pKa mezi ε-aminoskupinami lysinových zbytků α-aminoskupiny N-koncem zakončeného zbytku polypeptidu. Touto selektivní derivatizaci se řídí navázání vodou rozpustného polymeru, který obsahuje reakční skupinu, například aldehyd, na polypeptid. Konjugace s polymerem probíhá převážně na N-konci polypeptidu. Kromě toho probíhá nepodstatná modifikace dalších reakčních skupin, například aminoskupin v lysinovém bočním řetězci.
Důležitým znakem vynálezu je, že poskytuje v podstatě b
homogenní přípravu konjugovaných molekul monopolymeru a BDNF nebo monopolymeru a NT-3, což znamená, že se molekula polymeru navázala na BDNF nebo NT-3 v podstatě pouze v jediném místě. Konkrétněji, pokud se použije polyethylenglykol, potom vynález rovněž poskytne
I · ···· v · ·· t · « · · • « · t· *· pegylátovaný BDNF nebo NT-3, postrádající možné antigennové vazebné skupiny a mající polyethylenglykolovou molekulu navázanou přímo na BDNF nebo NT-3 polypeptid.
Ve výhodném provedení se vynález týká pegylátovaného BDNF a NT-3, ve kterých je (jsou) PEG skupina (skupiny) navázaná (navázané) přes acylovou nebo alkylovou skupinu.
-xFa-k—j-i-ž—bylo—uvedeno—výše—tyto—produkty—mohou-být monopegylátované nebo polypegylátované (např. obsahující 2 až 6, výhodně 2 až 5 PEG skupin). PEG skupiny se zpravidla váží na a a/nebo ε aminoskupinu polypeptidového řetězce, dá se rovněž předpokládat, že by se mohly PEG skupiny vázat na libovolnou aminoskupinu polypeptidové struktury, která je dostatečně reaktivní na- to, aby se mohla za vhodných reakčních podmínek navázat na PEG skupinu.
Polymerní molekuly, používané jak při acyklačním, tak při acyiačním přístupu, lze zvolit z vodou rozpustných polymerů nebo jejich směsi. Zvolený polymer, by měl být vodou rozpustný, aby se polypetid, na který se naváže, nesrážel ve vodném prostředí, například fyziologickém prostředí. Zvolený polymer by měl být modifikovaný tak, aby měl k dispozici jednu reakční skupinu, například aktivní esterovou skupinu pro acyiaci nebo aldyhydovou skupinu pro alkylaci, přičemž výhodně by měl být modifikován tak, aby bylo možné způsobem podle vynálezu řídit stupeň polymerace. Výhodným reakčním PEG aldehydem je propionaldehyd polyethylenglykolu, který je ve vodě stabilní, nebo jeho mono Ci až Ci0 alkoxy- nebo aryloxyderiváty (viz patent US 5,252,714). Polymer může být větvený nebo přímý. Pro terapeutické použití konečného produktu je výhodné, aby byl použitý polymer farmaceuticky přijatelný. Vodou rozpustný polymer lze zvolit ze skupiny, zahrnující například *»·· ·· » ♦ · · · • · » · » · ·· • * · · · · · »·· · · • · · · · · · · *··· ·»·· *· · ·♦ *· polyethylenglykol (např. monomethoxypolyethylenglykol), dextran, póly(N-vinylpyrrolidon), homopolymery propylenglykolu, kopolymery polypropylenoxidu a ethylenoxidu, polyoxyethylátováné polyoly (např. glycerol) a polyvinylalkoholy. Při acylačních reakcích by měl mít zvolený polymer jednu reakční esterovou skupinu. Při redukční alkylaci by měl mít zvolený polymer jednu re.akční....a 1 dehydu skupinu. Jako vodou rozpustný polymer se zpravidla nevolí přirozeně se vyskytující glykosylové zbytky, které se běžněji připravují pomocí savčích rekombinantních expresních systémů. Zvolený polymer může mít libovolnou molekulovu hmotnost a může být větvený nebo přímý.
Zvláště' výhodným vodou rozpustným polymerem pro použití v rámci vynálezu je polyethylenglykol. Výraz „polyethylenglykol, jak je zde použit, zahrnuje libovolnou formu PEG, která se používá pro derivatizaci &)modifikaci) jiných proteinů, například mono- (Οχ-Cio) alkoxy- nebo aryloxypolyethylenglykol.
Derivatizaci lze zpravidla provádět za libovolných vhodných podmínek, používaných pro zreagování biologicky účinných látek s molekulou aktivovaného vodou rozpustného polymeru. Způsoby přípravy pegylátovaného BDNF nebo NT-3 budou zpravidla zahrnovat následující kroky: (a) uvedení BDNF nebo NT-3 polypeptidů do reakce s polyethylenglykolem (například reakčním esterovým nebo aldehydovým derivátem PEG) za podmínek, za kterých se BDNF nebo NT-3 naváže na jednu nebo více PEG skupin, a (b) získání reakčního produktu. Optimální reakční podmínky pro acylační reakce se zpravidla určí případ od případu na základě známých parametrů a s přihlédnutím k požadovanému produktu. Čím • · • « * · · · · • « ·· · · · · · • · · · · · · «····«·· · · · · · větší bude poměr PEG : proteinu, tím vyšší bude procentu polypegylátovaného produktu.
Při použití způsobu podle vynálezu bude redukční alkylace, poskytující v podstatě homogenní populaci konjugovaných molekul monopolymeru a polypeptidů, zahrnovat následující kroky: (a) uvedení BDNF nebo NT-3 polypeptidů do reakce s polyethylenglykolem za redukčně alkylačních podmínek, při pH vhodném pro selektivní modifikaci aaminoskupin koncových polypeptidových skupin, a (b) získání reakčního produktu.
Pro získání v podstatě homogenní populace molekul ko.njugátu monomeru a BDNF nebo monomeru a NT-3, jsou redukčně alkylačními podmínkami ty podmínky, které umožňují selektivní navázání vodou rozpustné polymerní části na Npolypeptidový konec. Tyto reakční podmínky zpravidla poskytují rozdíl v pKa lysinových ε-aminoskupin a aaminoskupiny na N-konci (pKa je pH, při kterém je 50% aminoskupin protonizováno a 50% nikoliv). Hodnota pH rovněž ovlivňuje poměr polymeru ku polypeptidů, který se má použít. Zpravidla platí, že pokud je pH nižší, je zapotřebí větší přebytek polymeru proti polypeptidů (tj. tj. méně reaktivnější je N-koncová α-aminoskupina, tím je pro dosažení optimálních podmínek zapotřebí více polymeru). Pokud je pH hodnota vyšší, potom nemusí být poměr polymer polypeptid tak vysoký (tj. pokud jsou k dispozici reaktivnější skupiny, potom je zapotřebí pouze pár molekul polymeru) . Pro účely vynálezu je optimální pH 3 až 9, výhodně 3 až 6.
Dalším důležitým faktorem je molekulová hmotnost polymeru. Zpravidla platí, že čím vyšší je molekulová • « • I • · · · · · a ··· «· hmotnost polymeru, tím méně polymerních molekul se může navázat na polypeptid. Podobným způsobem optimalizuje tyto parametry větvení polymeru. Čím vyšší molekulová hmotnost (nebo více větví), tím vyšší musí být poměr polymer : polypeptid. Pro zde uvažované pegylatační reakce se výhodná průměrná molekulová hmotnost polymeru pohybuje přibližně od 2 kDa do 100 kDa (výraz přibližně znamená + 1 kDa) . Výhodněji se průměrná molekulová hmotnost použitého polymeru pohybuje v rozmezí přibližně od 5 kDa do 50 kDa a nej výhodněji přibližně od 12 kDa do 25 kDa. poměr vodou rozpustného polymeru ku BDNF nebo NT-3 bude zpravidla ležet v rozmezí od 1:1 do 100:1, výhodně (pro polypegylatizaci) od 1:1 do 20:1 a (pro monopegylatizaci) od 1:1 do 5:1.
Při použití výše popsaných podmínek poskytne redukční alkylace podle vynálezu selektivní navázání ' polymeru na libovolný BDNF nebo NT-3 polypeptidový protein, mající aaminoskupinu na konci zakončeném aminoskupinou a v podstatě homogenní přípravu konjugátu monopolymeru a polypeptidového proteinu. Výraz „konjugát monopolymeru a polypeptidového proteinu, jak je zde použit, znamená kompozici obsahující jedinou polymerní molekulu navázanou na BDNF nebo NT-3 molekulu. Konjugátu monopolymeru a polypeptidového proteinu bude mít polymerní molekulu umístěnou na N-konci polypeptidového řetězce a nikoliv na lysinových postranních skupinách. Příprava zpravidla poskytne více než 80% konjugátu monopolymeru a polypeptidového proteinu a výhodněji více než 90% konjugátu monopolymeru a polypeptidového proteinu, přičemž zbývající molekuly zůstanou nezreagované (tj. zbytek tvoří polypeptid postrádající polymerní část). Níže uvedené příklady způsobu přípravy konjugátu monopolymeru a polypeptidového proteinu poskytly přibližně alespoň 90% tohoto konjugátu a přibližně ♦ · • · ·· · · · ·· • * * « « · · ···· · • · ··· · · · «·« · *··» ·· · ♦· ··
10% nezreagovaného polypeptidu. Konjugát monopolymeru a polypeptidového proteinu je biologicky aktivní.
redukční činidlo, určené pro redukční alkylaci podle vynálezu, by mělo být stabilní ve vodném roztoku a výhodně by melo být schopné redukovat pouze Schiffovu bázi, vytvořenou při počátečním procesu redukční alkylace. Výhodná řbdukční čiňidla^ŤSohču byt zvolena zě skupiny/ zahrnující borohydrid sodný, kyanoborohydrid sodný, dimethyiamin-boran, trimethylamin-borah a pyridinboran. Zvláště výhodným redukčním činidlem je kyanoborohydrid sodný.
Další reakční parametry, například rozpouštědlo, reakční časy, teploty atd. a rovněž způsob čištění produktů, lze zvolit případ od případu na základě publikovaných informací, týkajících se derivatizace proteinů vodou rozpustnými polymery (viz zde citované publikace). Konkrétněji budou tyto parametry diskutovány v níže uvedených příkladech.
Pro přípravu směsi molekul konjugátů monopolymeru a polypeptidového proteinu lze zvolit acylační ' a/nebo alkylační metod a výhoda této volby spočívá v tom, že umožňuje při pravit směs, která bude obsahovat požadovaný poměr konjugátu monopolymeru a polypeptidového konjugátu. takže pokud je to žádoucí, lze připravit směs různých polypeptidu s různým počtem navázaných polymerních molekul (tj. di-, tri-, tetra- atd.) a kombinovat s konjugátovým materiálem monopolymeru a polypeptidu, připraveným za použití způsobů podle vynálezu a mít tedy směs s předem stanoveným poměrem konjugátů monopolymeru a polypeptidu.
• · · · ·· ···· · +
Jak již bylo uvedeno, konjugáty monopolymeru a polypeptidu podle vynálezu lze použít pro stejné účely jako BDNF nebo NT-3. Již dříve bylo známo, že tyto polypeptidy jsou účinné například jako trofické faktory, které podporují přežívání neuronů a zachování jejich funkčnosti in vitro, a umožňují tak studii a použití neuronů při výzkumech. Tyto buňky se v kultuře zpravidla udržují velmi těžko naživu. Tyto biologické aktivity rovněž umožňují použít tyto polypeptidy in vivo při neurologických studiích zvířat a představují potenciální terapeutická činidla pro léčení neurodegenerativním chorob, které souvisí se ztrátou neuronové funkce.
Pro terapeutické účely lze konjugáty polymeru a polypeptidu ·podle vynálezu formulovat a podávat v libovolném sterilním biologicky slučitelném farmaceutickém nosiči, kterým může být například solný fyziologický roztok, pufrovaný biologický roztok, dextróza a voda. Množství konjugátu polymeru a BDNF nebo polymeru a NT-3, které bude účinné při léčení konkrétní poruchy nebo zdravotního stavu, bude záviset na povaze poruchy nebo stavu a lze ho stanovit standardními klinickými technikami. Kde je to možní, je žádoucí pře prováděním testů na lidech sestavit pro farmaceutické kompozice podle vynálezu křivku, vyjadřující závislost dávka - odezva a to nejprve in vitro například v BDNF a NT-3 biologických testovacích systémech popsaných v literatuře a následně na použitelných zvířecích modelech. Způsoby podání budou zahrnovat intradermální, intramuskulární, intraperitoneální, intravenózní, subkutánní, intranazální, pulmonální a orální. Kromě toho může být žádoucí zavést farmaceutické kompozice do centrální nervové soustavy libovolnou vhodnou cestou včetně intraventriculární nebo intratekální. Dále může být žádoucí * · ·· ·· ·· aplikovat farmaceutické kompozice lokálně do oblasti, která toto ošetření vyžaduje. Toho lze dosáhnout například lokální infúzi během chirurgického zákroku, injektováním pomocí katetru nebo použitím implantátu tvořeného porézním, neporézním, želatinovým, vláknitým nebo membránovým materiálem.
Příprava konkrétních ďeřivátů BDNF a—NT-3—podi-e vynálezu a jejích fyzikální a biologické vlastnosti budou diskutovány v následující části textu, 'je třeba uvést, že následující příklady mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky v těchto příkladech se, není-l-í stanoveno·· jinak, použily lidské BDNF a NT-3 polypeptidy, které se .připravily rekombinací v E. coli (tj., r-metHuBDNF a r-metHuNT-3).
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Příprava konjugátu monoPEG (6 kDa) a BDNF s místem navázáním na N-koncové α-aminoskupině (skupinách)
Do vychlazeného (4°C), míchaného roztoku r-metHuBDNF (2,5 mg/ml) ve 100 mM fosfátu sodného, jehož pH bylo 4.0, Obsahujícího 20 mM NaCNBH3, se přidal dvojnásobný molární přebytek aktivovaného aldehydu · methoxypolyethylenglykolu (MPEG), majícího průměrnou molekulovou hmotnost 6 000 daltonů (tj., 6 kDa).
«··· ····
« · ·· • · · * • · ·· ··
Rozsah modifikace proteinu v průběhu reakce se monitoroval pomocí velikostně vylučovací chromatografie za použití sloupce Superose 6HR 10/30 (Pharmacia) eluovaného rychlostí 0,4 ml/min 100 mM fosforečnanu sodného, pH 6,9, obsahujícího 0,5 M NaCl. Po deseti hodinách vylučovací chromatografie ukázala, že již byl v podstatě veškerý polypeptid (který v roztoku existoval jako dimer) převeden na dvě možné formy pegylátovaného derivátu zakončeného Nkoncovou skupinou: MPEG konjugovaný na jedné nebo obou Ňkoncových skupinách BDNF dimeru.
Reakční směs se následně naředila sterilní vodou na pětinásobný objem a aplikovala na HiLoad 16/10 S Sepharose HP iontoměničový sloupec (Pharmacia),, uvedený do rovnovážného stavu pomocí 20 mM sodnofosfátovým.. pufrem, pH 7,5. Reakční směs se- aplikovala na sloupec rychlostí 1 ml/min a'nezreagovaný MPEG aldehyd se eluoval třemi objemy sloupce stejného pufru. Pro eluci dvou forem, pegylátovaného BDNF dimeru s N-zakončením se použil..
χ^Χ-t--í e· λ-Ητπ Ί -ni i +- ΓΜΖΓΜ1 yC- V k*1 W r v m γτηρηηη lineární eluční gradient £ koncentrace od 0% do 100% 20 mM fosforečnanu sodného, pH 7,5, obsahující 0,75 M NaCl. Frakce, obsahující MPEGBDNF deriváty se zachytily, zahustily a sterilně přefiltrovaly.
Příklad 2
Příprava konjugátu monoPEG (20 kDa) a BDNF s místem navázáním na N-koncové α-aminoskupině (skupinách)
V tomto příkladu se použil stejný postup jako v příkladu 1 s tou výjimkou, že se použil aldehyd « « * · • 9 · ♦ « · · ♦ • · ♦ · «»»· »··* ·· methoxypolyethylenglykolu (MPEG) s molekulovou hmotností 20 000 daltonů (20 kDa) a pH 5,0.
Příklad 3
Příprava konjugátu monoPEG (6 kDa) a BDNF redukční alkylací za použiti MPEG aldehydu
Do vychlazeného (4°C), míchaného .roztoku r-metHuBDNF (10 mg/ml) ve 100 mM pufru BICINE, pH 8,0, obsahujícího 20 mM NaCNBH3, se přidal čtyřnásobný molární přebytek aktivovaného aldehydu methoxypolyethylenglykolu (MPEG), majícího průměrnou molekulovou hmotnost 6 000 daltonů (tj., 6 kDa).
Rozsah modifikace proteinu v průběhu reakce se monitoroval pomocí velikostně vylučovací chromatografie za použití sloupce Superose 6HR 10/30 (Pharmacia) eluované rychlostí 0,4 ml/min 100 mM fosforečnanu sodného, pH 6,9, obsahujícího 0,5 M NaCl. Po deseti hodinách vylučovací chromatografie ukázala, že již byl v podstatě veškerý polypeptid modifikován MPEG.
Reakční směs se následně naředila sterilní vodou na pětinásobný objem, pH se upravilo pomocí kyseliny fosforečné na pH 7 a aplikovala na HiLoad 16/10 S Sepharose HP iontoměničový sloupec (Pharmacia), uvedený do rovnovážného stavu pomocí 20 mM sodnofosfátovým pufrem, pH 7,5. Reakční směs se aplikovala na sloupec rychlostí 1 ml/min a nezreagovaný MPEG aldehyd se eluoval třemi objemy sloupce stejného pufru. Pro eluci konjugátů MPEG a BDNF se použil lineární pětisetminutový gradient od 0% do 100% 20 mM fosforečnanu sodného, pH 7,5, obsahující ···· ···· • · ·· ··· · · • « ·' ·· ·*
0,75 M NaCl. Frakce, obsahující MPEG-BDNF konjugáty, se zachytily, zahustily a sterilně přefiltrovaly.
Příklad 4
Příprava konjugátu monoPEG (6 kDa) a BDNF redukční acylací za použi~tl~MPEG'~alděhydů
V tomto příkladu se požil stejný postup jako v příkladu 3 s tou výjimkou, že se použil šestinásobný molární přebytek MPEG aldehydu.
Přiklad 5
Příprava konjugátu polyPEG (6 kDa) a BDNF acylací za použití aktivovaných MPEG derivátů
Do vychlazeného (4°C), míchaného roztoku r-metHuBDNF (6 mg/ml) ve 0,1 M pufru BICINE, pH 8,0, se přidal čtyřnásobný molární přebytek aktivovaného su-kcini-m-idylesteru -karboxymethyl MPEG, maj.ícího.,průměrnou molekulovou hmotnost 6 000 daltonů (tj., 6 kDa). Polymer se rozpustil mírným mícháním a reakce se nechala pokračovat při stejné teplotě.
Rozsah modifikace proteinu v průběhu reakce se monitoroval pomocí velikostně vylučovací chromatografie za použití sloupce Superose 6HR 10/30 (Pharmacia) eluované rychlostí 0,4 ml/min 100 mM fosforečnanu sodného, pH 6,9, obsahujícího 0,5 M NaCl. Po třech hodinách vylučovací • ♦ · • * chromatografie ukázala, že již byl v podstatě veškerý BDNF dimer modifikován MPEG.
Reakční směs se následně naředila sterilní vodou na čtyřnásobný objem, pH se upravilo pomocí 0,5M kyseliny fosforečné na pH 7 a tento roztok se aplikoval na HiLoad 16/10 S Sepharose HP iontoměničový sloupec (Pharmacia), uvéděňy—db—rovno váŽfTéhb—s ta vupomocí'_20“”mM'''sO'dnO'fo'sfátovým pufrem, pH 7,5. Nezreagovaný MPEG aldehyd se eluoval třemi objemy sloupce stejného pufru. Pro eluci konjugátů MPEG a BDNF se použil lineární pětisetminutový gradient od 0% do 100% 20 mM fosforečnanu sodného, pH 7,5, obsahující
0,75 M NaCl. Frakce, obsahující MPEG-BDNF konjugáty, se zachytily, zahustily a sterilně přefiltrovaly.
Příklad 6
Příprava konjugátů polyPEG (6 kDa) a BDNF acylací za použití aktivovaných MPEG derivátů
V tomto příkladu se použil postup popsaný v příkladu 5 s tou výjimkou, že se použil ekvimolární poměr reakčních činidel.
Příklad 7
Příprava konjugátů polyPEG (20 kDa) a BDNF acylací za použití aktivovaných MPEG derivátů
V tomto příkladu se použil postup popsaný v příkladu 5 s tou výjimkou, že se použil MPEG sukcinimidylpropionát • 9 ·' • » * • 9 · · • 9 9 · 9 ·
9 » 9 ·
9·99 9999 99 * ··
99· 9 ·
9 « »9 ·♦ mající průměrnou molekulovou hmotnost 20 kDa a šestinásobný molární přebytek MPEG.
• ···· ··· · • · ·» ·»
Příklad 8
Příprava konjugátu monoPEG (20 kDa) a NT-3 s místem navázáním na N-koncové α-aminoskupině (skupinách)
Do vychlazeného (4’C), míchaného roztoku r-metHuNT-3 (4,77 mg/ml) v 20 mM fosfátu sodného, jehož pH bylo 4.0, obsahujícího 150 mM NaCl a 20 mM NaCNBH3, se přidal trojnásobný molární přebytek aktivovaného MPEG, majícího průměrnou molekulovou hmotnost 20 000 daltonů (tj., 20 kDa).
Rozsah modifikace proteinu v průběhu reakce se monitoroval pomocí velikostně vylučovací chromatografie za použití sloupce Superose 6HR 10/30 (Pharmacia) eluované rychlostí 0,4 ml/min .10 mM fosforečnanu sodného, pH 7,1, obsahujícího 150 mM NaCl. Po čtyřech hodinách vylučovací chromatografie ukázala, že již byl v podstatě veškerý polypeptid (který v roztoku existoval jako dimer) převeden na dvě možné formy pegylátovaného derivátu zakončeného Nkoncovou skupinou: MPEG konjugovaný na jedné nebo obou Nkoncových skupinách NT-3 dimeru.
Reakční směs se následně naředila 20 mM fosforečnanem sodným na pětinásobný objem, pH 7,1, a aplikovala na HiLoad 16/10 Ξ Sepharose HP iontoměničový sloupec (Pharmacia), uvedený do rovnovážného stavu pomocí 20 mM sodnofosfátovým pufrem, pH 7,5. Reakční směs se aplikovala na sloupec rychlostí 1 ml/min a nezreagovaný MPEG aldehyd se eluoval třemi objemy sloupce stejného pufru. Pro eluci dvou forem pegylátovaného NT-3 dimeru s N-zakončením se použil lineární pětisetminutový gradient od 0% do 100% 20 mM fosforečnanu sodného, pH 7,1, obsahující 0,4 M NaCl.
• 9
9 «··> 9999 • 9 * ·* « · · 999 · · • 99 · 9 · ·· · ·* 99
Frakce, obsahující MPEG-NT-3 deriváty se zahustily a sterilně přefiltrovaly.
zachytily,
Podobným způsobem modifikace BDNF nebo NT-3 s MPEG aldehydy s různou průměrnou molekulovou hmotností, například s molekulovou hmotností ležící v rozmezí od 5 kDa do 50 kDa, lze připravit i další MPEG-BDNF nebo MPEG-NT-3 koňj'trgiátyt Honfo‘g‘en'i'ťa~výs'l_e'dných—pegybátováných—BDNF—neboNT-3 konjugátů se stanová Nátriumdodecylsulfátpolyakrylamidovou gelovou elektroforézou (SDS-PAGR), za použití 10 až 20% nebo 4 až 20% prefabrikovaných gradienčních gelů (Integrated Separation. systems). Pro charakterizování účinné velikosti (hydrodynamického poloměru) všech MPEG-BDNF nebo MPEG-NT-3 druhů se použil 10/30 (Pharmacia) gelový filtrační sloupec. Proteiny se detekovaly UV absorbancí při 280 nm. BIO-RAD gelové filtrační standardy slouží jako granulované proteinové markéry molekulové hmotnosti. Molekulové hmotností konjugátů se stanovily sedimentací rovnovážným analytickým ultracentrifugací a z matrice pomocí laserové desorpční hmotnostní spektrometrie. Struktura každého N-zakončeného MPEG-BDNF nebo MPEG-NT-3 konjugátu byla potvrzena standardními metodami sekvencování proteinů s N-zakončením a peptidovým mapováním.
Biologická aktivita ín vitro MPEG-BDNF konjugátů, připravených v příkladech 1 až 7, se stanovila na základě jejich vliv na růst vnitřní soli, 3-(4,5-'dimethylthiazol-2yl)-5-(3-karboxymethoxyfenyl)-2-(4-sulfofenyl)2H-tetrazolia, způsobený PC12/pcDneo-trkB#18 buňkami. Tyto výsledky a rovněž základní reakční parametry použité při přípravě konjugátů jsou shrnuty v níže uvedené tabulce 1.
·»·· · ···
I · » * ··· · <
* · « »· ··
TABULKA •3
P φ
g ni a
x3 u
Ή rd
XJ a
Q
CQ
I ω
OLl
P '3 tr>
n
O •3
P
Φ g
(ti (ti a
X!
o KH >
(ti
Ή
O
X (ti
Φ x
o '>
>
(ti a
Ή >3 a
Λ!
•rl
P
Cti
-rl
Φ
P
Λ4 (ti (ti
X
O
X
O
CO
P '(0 tti •o
O
X >.
rl _P__ m
Ή
Φ
P
X (ti (ti x
o o
P
H >
>
P e— 0 H a 2 a
O a
dP
O
O t3
CO rCM
CO
LO
CM
CM
0D
CM
CD
CM
CM
5J1
K,
CM
CD
CD
CO
CM
CD
CM
X >U p JZ 3 3 OJ * a ω
a
Ή >U λ:
(D
P '3 &>
ΓΊ
O
W
Q
Aí
X a
a a
z
Q a
co [
CM co oo v
O i—I
CM γοο
CM
CO
ΟΊ
CM
CM
CO
C0 co (Ti
CM i—I
OO
CM
CD iD co
CO
CD
CD o
CM
CD
CD
CD
O
CM d
X
0) d
i—I rij d
C3 x
φ d
i—1 d >1 x φ d i—i
XJ
Φ d
i—I (=4
Φ
P
Cti
Φ
CO
X
Z
Φ
P cti
Φ co
X
Z
Φ
P
Cti
Φ co
X
Z molekulová hmotnost, stanovená gólovou filtrací a
z o
a
CC
P
Φ g
a o
a i
W a
o
O g
a §
CQ a
a o
O g
a z
Q a
t a
a §,
Γ—| o
a a
z o
a
I a
a s
i—I a
a z
Q a
I a
a
5,
H
O a
a z
a a
I a
a š
H
O a
a a
a i
a a
δ
Γ—I o
a
CM co
M1
CD
| Φ | 3 | o |
| g | > | 3 |
| -rl | •rl | r—1 |
| d | P | ω |
| 3 | P | |
| a | i—1 | 3 |
| 2 | Φ | ί> |
| a | 3 | O |
| a | X | |
| '3 | Ή | |
| 1—1 | > | i—1, |
| 0 | -rl | a |
| g | rd | 3 |
| 3 | Φ | |
| r-H | '3 | 3 |
| O | d | |
| g | N | 1 |
| [ | 1 | 3 |
| \ | ||
| 3 | Xi | 3 |
• · « 9 « * 9 * * ·* • » · * · · · · · · · *
9 9·· · · »
99*» ·*· *· · ** ·*
Příklad 9
Hodnocení in vivo biologické aktivity konjugátu MonoMPEG (20 kDa) na motoneuronech u dospělých krys
Jak se již ukázalo dříve BDNF chrání vývoj motoneuronů před přirozeně se vyskytující a axotomii indukovanou
-buněčnou:_smrtí.;__Yan a kol. Nátuře 360:753-755 (1992);
Oppenheim a kol., Nátuře 360:757-759 (1992); a Sendtner a kol.., Nátuře 360:757-759 (1992). Rovněž se ukázalo, že axotomizované dospělé motoneutrony reagují na exogenní BDNF a přesněji na BDNF, aplikované různými způsoby podání, tak že tlumí axotomii indukované snížení chilonacatyltransferázové (ChAT) imunoreaktivity ve faciálních motoneuronech dospělých krys; Yan a kol., J.Neurosci. 14(9):5281-5291 (1994). Snížení aktivity ChAT indikuje ztrátu motoneuronové funkce, protože ChAT je vitálním neurotransmiterem, produkovaným motoneurony. Tyto studie tedy ukazují, Že BDNF je použitelný jako potenciální terapeutické činidlo pro motoneuronové choroby dospělých jedinců. Tato studie hodnotila in vivo biologickou aktivitu * !r · pegylátovaných a nahodile pegylátovaných druhů BDNF (viz příklad 1 a 3) na poškozených dospělých motoneuronech.
Metody
A. veterinární chirurgie a léčení
Dospělé samičky Sprague-Dawleyových krys (celkem 52 krys, n=4 pro každou skupinu) se znecitlivěly koktejlem (43 itig/ml ketaminhydrochloridu, 8,6 mg/ml xylazinu a 1,43 mg/ml acepromazinu) , který jim byl podán v dávce 0,7 ml/kg tělesné hmotnosti. Po znehybnění se pravý faciální nerv přeřízl v ' blízkosti foramenu » · * «
• · »· ·· « *
9 · ·· ·» stylomastoideumu. Zvířata se každodenně ošetřovala sedm dní subkutánním způsobem, přičemž prvním dnem ošetření byl den, kdy byl proveden chirurgický zákrok (den 0) . Použité dávky tvořilo 0,1, 0,3, 1,0 a 5,0 mg na kg tělesné hmotnosti nepegylátovaného BDNF, monoPEG(20kDa)-BDNF s N-zakončením, nebo nahodilého polyMPEG-BDNF konjugátu, vždy v PBS. Kontrolní skupinu tvořila skupina krys, která se ošetřila pouze PBS.
B. ChAT imnunohistochemie
Krysy se utratily předávkováním anestetika a promyly transkardiálně PBS a následně 4% paraformaldehydem v 0,1 M sodnofosfátovým pufrem, pH 7,2. Po izolování mozkových kmenů se tyto kmeny konzervovaly hlubokým zmrazením pomocí 30% sacharózou v PBS, na. posuvné mikrotomovém podložce a následně se faciální jaderná oblast nařezala na 80 μτα sériové koronární řezy. Řezy se potom připravily pro imunohistochemii zpracováním za použití myší monoklonálníprotilátky působící proti ChAT (ascity, 1:500, Chemicon, Temecula, CA), a následně 2 μg/ml sekundární biotinylátované koňské antimyší protilátky pomocí ABC metody (Vector Laboratories, Burlingame, CA), kterou popsal Yan a Johnson v J. Neurosci. 8(9):3481-3498 (1988).
C. Kvantifikace imunohistochemických řezů
Pro kvantifikaci relativní intenzity ChAT zbarvení se použil zobrazovací analyzér Quantimet 520 (Leica, lne., Deerfield,. IL) spojený s mikroskopem Nikon Optiphot-FXA. Pro získání vysoce kontrastních obrazů faciální nukleové oblasti v histologických řezech se použil filtr s 510 nm úzkou pásmovou propustí (Oriel Corp., Stratford, CT) spolu s objektivem Nikon-Plan Apochromatic 2x. Relativní * · ·· • · · · · • * · · * · · · ···· ·*·« ·· $ *· ·* intenzita ChAT imunoreaktivity se stanovila získáním průměrné intenzity stupnice šedi pro každé jádro, od které se odečetlo zabarvení pozadí, sousedící ChAT negativní šedé hmoty. Pro kvantifikaci se použily tři nebo čtyři řezy, obsahující faciální jádra, z každého zvířete.
Protože BDNF ošetření neovlivňuje ChAT imunozabarvení n epo řuŠěňyčh f ačia Iňíčři j’ádě r“, vy j ádřila s e—z is-kaná—da tajako poměr relativní optické hustoty porušených a neporušených faciálních jader ve stejném vzorku. Získaná data se statisticky analyzovala pomocí testu ANOVA a následně pomocí testu Dunnett t.
D. Výsledky
Axotomie u dospělých krys způsobuje rychlý a reprodukovatelný pokles ChAT imunoreaktivity motoneuronů; Lams a kol., Brain Res. 475:401-406 (1988) a Armstrong a kol., J. Comp. Neurol. 304:596-607 (1991). Ke stanovení účinků nepegylátovaného BDNF a pegylátovaného BDNF na dospělých motoneuronech, se použil výše popsaný typ řezu faciálního nervu, u kterého se studoval vlivu těchto polypeptidů na expresi ChAT v motoneuronech.
Několik dní po přeříznutí pravého faciálního nervu se ChAT imunoreaktivita v poškozeném faciálním jádru, ošetřovaném PBS, v podstatě vymizela (Obr. 4, pod písmenem A, faciální jádro na pravé straně). Subkutánní ošetření přirozeným BDNF (5 mg/kg, obr. 4 pod písmenem B), konjugátem N-zakončeného monoMPEG a BDNF (0,3 mg/kg, obr. 4, pod písmenem C) a nahodilým konjugátem polyMPEG a BDNF (0,3 mg/kg, obr. 4, pod písmenem D) značně zmírnilo poškozením indukované snížení ChAT imunoreaktivity. Za účelem kvantifikace tohoto jevu se měřila průměrná optická • ·
9 99 • ♦··· · • · ·· ·· hustota jak poškozeného, tak nepoškozeného faciálního jádra ChAT zabarveného řezu. Jak přirozený, tak N-zakončený monoMPEG-BDNF konjugát a rovněž nahodilý polyMPEG-BDNF konjugát snížily dávkově dependentním způsobem ChAT imunoreaktivítu (obrázek 5). Přirozený BDNF při dávce 5 mg/kg dávce vykazoval značné zmírnění poškozením indukované ChAT imunoreaktivity oproti kontrolnímu vehikulu (ρ,Ο,ΟΙ). Ošetření N-zakončeným monoMPEG-BDNF konjugátem nebo nahodilým polyMPEG-BDNF konjugátem mělo za následek podstatné zlepšení oproti kontrolnímu vehikulu při všech testovaných dávkách a proti přirozenému BDNF při nižších testovaných dávkách (p<0,01). Zjištění, že ošetření pěgylátovaným BDNF posunulo křivku, vyjadřující závislost dávka-odezva, přibližně o dvacetinásobek doleva v porovnání s přirozeným BDNF (obr. 5), naznačilo zvýšení účinnosti pegylátovaného BDNF na poškozených motoneuronech.
Příklad 10
Hodnocení In Vitro biologické aktivity konjugátu Nzakončeného monoMPEG a NT-3 v embrionickém kuřecím DRG biologickém testu
Srovnatelné biologické aktivity nepegylátovaného NT-3 a Nezakončeného monoMPEG(20kDa)-NT-3 konjugátu se měřily pomocí testu embrionického kuřecího dorzálního kořenového ganglionu (DRG), který popsal Lindsay a kol., v Dev. Biol. 112:319-328 (1985). Pět embrionických (E8) kuřecích dorzálních kořenových ganglionů na jamku se kultivovalo jako explantáty v kolagenové matrici 2 ml F14 média, obsahujícího 5% normálního koňského séra. Účinky neurotrofního faktoru (jak nepegylátovaného, tak * · pegylátovaného) se stanovily vizuálně pod’ fázovým mikroskopem a vyhodnotily na stupnici 0 až 5 (0 znamenala žádný neutritový výrůstek a 5 znamenala maximální neutritový výrůstek),
Výsledky shrnuté v níže uvedené tabulce 2 naznačují, že pegylátovaný NT-3 netrpí ztrátou aktivity v porovnání s 'ňěpěgyleCtdvaným- NT—což-j_e—překvap-i-v-ý—v-ýs-l-edek—v-zh-ledem. ke zkušenostem s jinými pegylátovanými proteiny, testovanými in vitro, které podléhají podstatnému snížení biologické aktivity.
TABULKA 2
| Biotest E8 kuřecího DRG In vitro | ||
| . Faktor | Konc. vzorku (ng/ml) | Neutritový výrůstek |
| NT-3 | 0,5 | 1, 2, 2, 3, 3 |
| 5 | 4, 4, 5, - | |
| 10 | 0,5, 1, 1, 1, 2 | |
| 50 | 0,5, 0,5, 0,5, 1, 1 | |
| v | ||
| Pegylátovaný NT-3 | 5 | 4, 4, 4, 2, 2 |
| 50 | 3, 3, 2, 2, 1 | |
| 500 | 0, 0,5, 0,5, 1, 2 | |
| 1000 | 3, 3, 2, 1, 0,5 |
Příklad 11
Další hodnocení In Vivo biologické aktivity N-zakončeného monoMPEG(20kDa)-BDNF konjugátu u dospělých krys- Pronikání mozkovou tkání
1. Jediná injekce vedená do žíhaného tělesa
Jeden mikrolitr nepegylátovaného BDNF nebo N-zakončeného mon'oMPEG(20kDa) -BDNF konjugátu . (1 mg/ml fosfátem pufrovaného solného roztoku) se 18 až 20 hodin injektovalo in vivo do středu pravého žíhaného tělesa mozku dospělé krysí samičky (n=4). O dvacet čtyři hodin později se ..zvířata utratila _předávkováním anestézií a transkardiálně .promyla PBS a následně 4% paraformaldehydu v 0,1 M sodnofosfátovým pufrem, pH 7,2. Po izolování mozkových kmenů se tyto kmeny konzervovaly hlubokým zmrazením pomocí 30% sacharózou v PBS, zmrazily na posuvné mikrotomovém podložce a následně se faciální jaderná oblast nařezala na 60 pm sériové koronární řezy. Řezy se potom připravily pro imunohistochemii zpracováním za použití 1 pm/ml králičí protilátky, působící proti BDNF, a následně 2 pg/ml sekundární biotinylátované králičí protilátky, působící proti BDNF, pomocí ABC metody (Vector Laboratories, Burlingame, CA), kterou popsal Yan a Johnson v J. Neurosci. 8(9):3481-3498 (1988). V případě obou použitých látek, tj . nepegylátovaného a pegylátovaného BDNF vzorku, bylo možné pozorovat velmi intenzívni zabarvení v místě vpichu. Pegylátovaný BDNF pronikal přibližně do 2,4x větší oblasti tkáně než nepegylátovaný BDNF, jak je patrné z obrázku 6. Několik pozitivně značených neuronů se nacházelo rovněž v černé hmotě (není znázorněno).
·· · i
2. Sedmidenní infúze zavedená do žíhaného tělesa
Dospělé krysí samičky (n = 4) přijímaly denní infúzi 12 μg, buď nepegylátovaného BDNF nebo N-zakončeného monoMPEG(20kDa)-BDNF konjugátu, která se aplikovala po dobu sedmí dní do žíhaného tělíska. Průnik obou forem BDNF, k němuž došlo v rámci této studie, je dokonce lepší než v připad'ě',-jědno3.učhěhd~_rňj'ěJčtá''zní'h‘o'“pO'stupu7'“který-byl—popsán výše. Pegylátovaný BDNF difundoval do mnohem větší oblasti než přirozený BDNF (přibližně 6,lx Větší oblasti, viz obrázek 7) . Po provedení infúze pegylátovaným BDNF bylo v oblasti substantia nigra compacta („SNC) a ve ventrální tegmentální oblasti („VTH) pozitivně označeno mnohem více neuronů (obr. 8, pod písmeny Ca D), než po infúzi nepegylátovaným BDNF (viz obr. 8 pod písmeny A a B) . Za většího energetického zvětšení, bylo možno pozorovat BDNFimunoreaktivitu jako tečky uvnitř cytoplazmy obklopující jádro, což naznačilo, že BDNF bylo retrográdní transportováno z nervového zakončení do těla buňky. Pozitivní zabarvení, patrné v mediálové ventrální části substantia nigra reticulata ,SNR' bylo v neurofilu a nesouviselo s žádným buněčným tělem. Toto zabarvení bylo způsobeno nespecifickou difúzí a nikoliv receptorem mediovaným retrográdním transportem; Ferguson a kol., J. Comp. Neutrol. 313:680-692 (1991).
Tyto výsledky jsou velmi významné. Zjistilo se, že po parenchymální aplikaci do mozku zvířat, je průnik BDNF mozkovou tkání velmi slabý. Nyní získaná data ukazují značné zlepšení schopnosti difúze v případě použití pegylátovaného BDNF, který svědčí o potenciálně vyšší terapeutické účinnost, alespoň pokud jde o tyto formy podání.
·«« ···· ·*··
SEZNAM SEKVENCI
INFORMACE PRO SEQ ID NO:1:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 119 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý- (D) TOPOLOGIE; lineární (ii) TYP MOLEKULY:protein (xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE: SEQ ID NO:1:
| His | Ser | Asp | Pro | Ala | Arg | Arg | Gly | Glu | Leu | Ser | Val | Cys | Asp | Ser | Ile |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Ser | Glu | Trp | Val | Thr | Ala | Ala | Asp | Lys | Lys | Thr | Ala | Val | Asp | Met | Ser |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Gly | Gly | Thr | Val | Thr | Val | Leu | Glu | Lys | Val | Pro | Glu | Ser | Lys | Gly | Gin |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Leu | Lys | Gin | Tyr | Phe | Tyr | Glu | Thr | Lys | Cys | Asn | Pro | Met | Gly | Tyr | Thr |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Lys | Glu | Gly | Cys | Arg | Gly | Ile | Asx | Lys | Arg | His | Trp | Asn | Ser | Gin | Cys |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Arg | Thr | Thr | Gin | Ser | Tyr | Val | Arg | Ala | Leu | Thr | Met | Asp | Ser | Lys | Lys |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Arg | Ile | Gly | Trp | Arg | Phe | Ile | Arg | Ile | Asp | Thr | Ser | Cys | Val | Cys | Thr |
| 100 | 105 | 110 |
Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg 115
INFORMACE PRO SEQ ID NO:2:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 120 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý ______(DLJ.OZQLOGI^.:_nneární__________ __ (ii) TYP MOLEKULY .-protein (xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE: SEQ ID NO:2:
| Met 1 | His | Ser Asp Pro 5 | Ala | Arg | Arg | Gly | Glu 10 | Leu | Šer | Val | Cys | Asp 15 | Ser |
| Ile | Ser | Glu Trp Val 20 | Thr | Ala | Ala | Asp 25. | Lys | Lys | Thr | Ala | Val 30 | Asp | Met |
| Ser | Gly | Gly Thr Val 35 | Thr | Val | Leu 40 | Glu | Lys | Val | Pro | Val 45 | Ser | Lys | Gly |
| Gin | Leu 50 | Lys Gin Tyr | Phe | Tyr 55 | Glu | Thr | Lys | Cys | Asn 60 | Pro | Met | Gly Tyr | |
| Thr 65 | Lys | Glu Gly Cys | Arg 70 | Gly | Ile | Asp | Lys | Arg 75 | His | Trp | Asn | Ser | Gin 80 |
| Cys | Arg | Thr Thr Gin 85 | Ser | Tyr | Asx | Arg | Ala 90 | Leu | Thr | Met | Asp | Ser 95 | Lys |
| Lys | Arg | Ile Gly Trp 100 | Arg | Phe | Ile | Arg 105 | Ile | Asp | Thr | Ser | Cys 110 | Asx | Cys |
Thr Leu Thr Ile Lya Arg Gly Arg 115 120
Β ’ Β » · • Β Β Β Β • Β · Β ··« Ι·Μ ♦>
Β ·· • · · » · ·
INFORMACE PRO SEQ ID NO:3:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 119 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý ____(D}_TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY:protein
| SEQ | (xi) ID NO: | POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH 3: | MÍS | ;T SEKVENCE: | |||||||||||
| Tyr 1 | Ala | Glu | His | Lys 5 | Ser | His | Arg | Gly | Glu 10 | Tyr | Ser | Val | Cys | Asp 15 | Ser |
| Glu | Ser | Leu | Trp 20 | Val | Thr | Asp | Lys | Ser 25 | Ser | Ala | Ile | Asp | Ile 30 | Arg | Gly |
| His | Gin | Val 35 | Thr | Val | Leu | Gly | Glu 40 | Ile | Lys | Thr | Gly | Asn 45 | Ser | Pro | Val |
| Lys | Gin 50 | Tyr | Phe | Tyr | Glu | Thr 55 | Arg | Cys | Lys | Glu | Ala 60 | Arg | Pro | Val | Lys |
| Asn €5 | Gly | Cys | Arg | Gly | Ile 70 | Asp | Asp | Lys | His | Trp 75 | Asn | Ser | Gin | Cys | Lys 80 |
| Thr | Ser | Gin | Thr | Tyr 85 | Val | Arg | Ala | Leu | Thr 90 | Ser | Glu | Asn | Asn | Lys 95 | Leu |
| Val | Gly | Trp | Arg 100 | Trp | Ile | Arg | Ile | Asp 105 | Thr | Ser | Cys | Val | Cys 110 | Ala | Leu |
Ser Arg Lys Ile Gly Arg Thr 115
INFORMACE PRO SEQ ID NO:4:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 120 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý _ __ (D) TOPOLOGIE: lineární_____;_________,_____ (ii) TYP MOLEKULY:protein (xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE:
| SEQ ID NO:4: | |||||||||||||||
| Met ή | Ala | Glu | His | Lys Ser | His | Arg | Gly | Glu | Tyr | Ser | Val | Cys | Asp | ||
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Ser | Glu | Ser | Leu | Trp | Val | Thr | Asp | Lys | Ser | Ser | Ala | Ile | Asp | Ile | Arg |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Gly | His | Gin | Val | Thr | Val | Leu | Gly | Glu | Ile | Lys | Thr | Gly | Asn | Ser | Pro |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Val | Lys | Gin | Tyr | Phe | Tyr | Glu | Thr | Arg | Cys | Lys | Glu | Ala | Arg | Pro | Val |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Lys | Asn | Gly | Cys | Arg | Gly | Ile | Asp | Asp | Lys | His | Trp | Asn | Ser | Gin | Cys |
| 65 | 70 | 75 | 80 , | ||||||||||||
| Lys | Thr | Ser | Gin | Thr | Tyr | Val | Arg | Ala | Leu | Thr | Ser | Glu | Asn | Asn | Lys |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Leu | Val | Gly Trp Arg | Trp | Ile | Arg | Ile | Asp | Thr | Ser | Cys | Val | Cys | Ala |
100 105 110
Leu Ser Arg Lys Ile Gly Arg Thr 115 120 * · t * · * · * ·· *
Claims (4)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. BDNF derivát .obsahující BDNF polypeptid, navázaný -na-aTespoň—j-eden-vodou-rozpustný-po-l-ymer-r------—-—2. NT-3 derivát obsahující NT-3 polypeptid, navázaný na alespoň jeden vodou rozpustný polymer.3. Derivát podle nároku 1 nebo 2, vyznačený tím , že polypeptid je připraven rekombinací v bakteriální buňce.4. Derivát podle nároku 1 nebo 2, vyznačený tím , že se vodou rozpustný polymer zvolí ze skupiny zahrnující dextran, póly(N-vinylpyrrolidon), polyethylenglykol, polypropylenglykol, poly-1,3-dioxan, poly-1,3,6trioxan, kopolymery polypropylenoxidu a ethylenoxidu, polyoxyethylátované polyoly a polyvinylalkoholy.5. Derivát podle nároku 4,vyznačený tím, že vodou rozpustným polymerem je polyethylenglykol.* ·6. Derivát podle nároku 5, vyznačený tím, že polyethylenglykolem je monomethoxypolyethylenglykol.7. Derivát podle nároku 5,vyznačený tím, že polyethylenglykol je -navázán ňa polypeptid pomocí -acy-1o v-é-neb o - -a-l-ky-lov-é—v-a-z by-.—-----------------:------.----8. Derivát podle nároku 5, vyznačený tím, že polyethylenglykol má molekulovou hmotnost přibližně 2 až 100 kDa.9. Derivát podle nároku 8,vyznačený tím, že polyethylenglykol má molekulovou hmotnost přibližně od 5 kDA do 50 kDa.10. Způsob navázání vodou rozpustného polymeru na polypeptid, zvolený ze skupiny zahrnující BDNF a NT-3, vyznačený tím, že vodou rozpustný polymer má jednu reakční aldehydovou skupinu a uvedený způsob zahrnuje:(a) uvedení polypeptidu do reakce s vodou rozpustným polymerem za redukčně alkylačních podmínek, při pH, které je natolik kyselé, že umožní α-aminoskupině na N-konci uvedeného polypeptidu být reaktivní; a (b) izolování polypeptidu, navázaného na alespoň jeden vodou rozpustný polymer.t ♦ » · · * · ·· • 9 · 9 * · · ·** * · • · · # * · * *»*·«· b· '· ·· · ·11. Způsob podle nároku 10, vyznačený tím, že dále zahrnuje (c) separaci polypeptidu, navázaného na alespoň jednom vodou rozpustném polymeru, od nezragovaných molekul.________________12„.__ Zp.ů s.o.b_. podle „ nároku 10, v___y_z___n__a__č e n ý tím., že polymer je farmaceuticky přijatelný.13. Způsob podle nároku 10, vyznačený tím, že se vodou rozpustný polymer zvolí ze skupiny zahrnující dextran, póly(N-vinylpyrrolidon), polyethylenglykol, polypropylenglykol, poly-1,3-dioxan, poly-1,3,6trioxan, kopolymery polypropylenoxidu a ethylenoxidu, polyoxyethylátované polyoly a polyvinylalkoholy.14. Způsob podle nároku 13, v y z n a č e n ý tím, že vodou rozpustným polymerem je polyethylenglykol.15. Způsob podle nároku 10, vyznačený tím, že pH hodnota se pohybuje přibližně mezi 3 a 9.16. Způsob podle nároku 10, vyznačený tím, že redukčně . alkylační podmínky zahrnují použití nátriumkyanoborohydridu jako redukčního činidla.ί'i.* ♦ »· · í t · « ·· ··17. Způsob navázání polyethylenglykolové molekuly na 'i polypeptid, zvolený ze skupiny ‘zahrnující BDNF a NT-3, tím, že polyethylenglykolové molekula\ má jednu reakční aldehydovou. skupinu a uvedený způsob zahrnuje:vyznačený A má ji uvedení polypeptidu do reakce ť. polyethylenglykolovou molekulou za__ redukčně _
podmínek, j,při pH, které je natolik kyselé, že umožní a- aminoskupině na N-konci uvedeného. polypeptidu být reaktivní; a (b) izolování polypeptidu, navázaného na polyethylenglykol..18. Způsob podle nároku 17, vyznačený tím, že dále zahrnuje (c) separaci reakčního produktu od nezragovaných molekul.19. Způsob podle nároku 17, vyznačený tím, že polyethylenglykolové molekula má molekulovou hmotnost přibližně 2 kDa až 100 kDa.20. Konjugát vodou rozpustného polymeru a polypeptidu, připraví způsobem podle nároku 17.21. V podstatě homogenní přípravek BDNF, monopegylátovaného na α-aminoskupíně N-konce polypeptidu.» · » · * • · * · · • « ♦ » b · · · * · ·«· ·♦*· b· 9 » * ·♦ t ·*·* · b · * ·· ·*22. V podstatě homogenní přípravek NT-3, monopegylátovaného na a-aminoskupině N-konce polypeptidu.23. Způsob zlepšení in vivo účinnosti BDNF při ošetření poškozených motoneuronů, vyznačený-------------—ge- -z ahrnu j-e-použ i ti—pegyláto váného- de-r i-vá-feu—BDNF-.—24. Způsob zlepšení in vivo účinnosti NT-3 při ošetření poškozených motoneuronů, vyznačený tím, že zahrnuje použití pegylátovaného derivátu BDNF.Zastupuje:AnotaceNázev vynálezu: Konjugáty BDNF a NT-3 s vodou rozpustným polymerem------Navázáním-neuroťrořiek-ýeh-fa-k-feo-rů—BDNF— a—NT—3—na—vodou.rozpustný polymer, například polyethylenglykol, se připravily deriváty těchto polypeptidů.· • * »« « « » ♦ * I • ·- * · · • · · · ·· · » ♦ ·* ··» · *1/8Obr. 1[C^O(CH2CH2O)n- CH2C-NH]k-BDNF-( ΝΗ2)^ »11 · • · · · > · · ·»«♦ »··· ·· * · ·» • ·»·« · • * * ·· ·« - 2/8Obr. 2 ’ k CH3O(CH2CH2O)nCH2CH2C(O)H + (I^NVBDNFNaCNBH3T [CH3O(CH2CH2O)nCH2CH2CH2-HN]|(-BDNF-(NH2)nhk ···· · · ’ TT’.’ * t ·»«4 « »1 · ♦ · 4 «4** » • 4 · · · · · · «··· t··· ·· * ·* ··
- 3/8Obr. 3Όθσ-(ΒθΝΡ/Ν^-ΝαΗ2 OOG-(6pNF/NT-3)—N°H2
- 4NaCNBH3 oog-(|dnf/n^3)—nh-ch 2-pegOOC-(^DNF/NT^)-N aH;, *OOC-<£DNF/Nr-3)—NH-CH 2-PEG oog-<|dnf/nt-J>-nh-ch 2-peg nVSyntéza mono-MePEG-BDNF (NT-3) konjugátů
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/340,131 US5770577A (en) | 1994-11-14 | 1994-11-14 | BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ137597A3 true CZ137597A3 (cs) | 1998-10-14 |
Family
ID=23332020
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ971375A CZ137597A3 (cs) | 1994-11-14 | 1995-11-13 | Konjugáty BDNF a NT-3 s vodou rozpustným polymerem |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5770577A (cs) |
| EP (1) | EP0792288B1 (cs) |
| JP (1) | JPH10508853A (cs) |
| KR (1) | KR100253762B1 (cs) |
| CN (1) | CN1173183A (cs) |
| AT (1) | ATE175973T1 (cs) |
| AU (1) | AU694589B2 (cs) |
| CA (1) | CA2204640C (cs) |
| CZ (1) | CZ137597A3 (cs) |
| DE (1) | DE69507507T2 (cs) |
| DK (1) | DK0792288T3 (cs) |
| ES (1) | ES2126331T3 (cs) |
| GR (1) | GR3029790T3 (cs) |
| HU (1) | HUT77747A (cs) |
| IL (1) | IL115965A (cs) |
| MX (1) | MX9703362A (cs) |
| NO (1) | NO972176L (cs) |
| NZ (1) | NZ296452A (cs) |
| RU (1) | RU2136694C1 (cs) |
| SK (1) | SK283083B6 (cs) |
| WO (1) | WO1996015146A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA959653B (cs) |
Families Citing this family (47)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5824784A (en) * | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
| JPH10212241A (ja) * | 1996-05-27 | 1998-08-11 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | Ｂｄｎｆを安定に含有する製剤 |
| IL127872A0 (en) | 1996-07-19 | 1999-10-28 | Amgen Inc | Analogs of cationic proteins |
| CA2348835A1 (en) * | 1998-10-28 | 2000-05-04 | Cornell Research Foundation, Inc. | Methods for regulating angiogenesis and vascular integrity using trk receptor ligands |
| US6656474B1 (en) * | 1999-01-15 | 2003-12-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of using a neurotrophin and its analogues for the treatment of gastrointestinal hypomotility disorders |
| RU2290411C2 (ru) * | 2000-01-10 | 2006-12-27 | Максиджен Холдингз Лтд | Конъюгаты g-csf |
| US6800607B2 (en) * | 2000-02-29 | 2004-10-05 | Ltt Bio-Pharma Co., Ltd. | Modified BDNF |
| US7514239B2 (en) * | 2000-03-28 | 2009-04-07 | Amgen Inc. | Nucleic acid molecules encoding beta-like glycoprotein hormone polypeptides and heterodimers thereof |
| US6586398B1 (en) | 2000-04-07 | 2003-07-01 | Amgen, Inc. | Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods |
| UA82983C2 (ru) * | 2001-02-01 | 2008-06-10 | Байоджен Айдек Ма Інк. | Полимерные коньюгаты найбластина и способы их использования |
| US7442370B2 (en) * | 2001-02-01 | 2008-10-28 | Biogen Idec Ma Inc. | Polymer conjugates of mutated neublastin |
| MXPA03007316A (es) | 2001-02-19 | 2003-12-04 | Merck Patent Gmbh | Metodo para la identificacion de epitopes de celulas t y el uso para la preparacion de moleculas con inmunogenicidad reducida. |
| EP1234583A1 (en) * | 2001-02-23 | 2002-08-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | PEG-conjugates of HGF-NK4 |
| US7276580B2 (en) * | 2001-03-12 | 2007-10-02 | Biogen Idec Ma Inc. | Neurotrophic factors |
| RU2307126C2 (ru) * | 2001-07-11 | 2007-09-27 | Максиджен Холдингз Лтд. | Конъюгаты g-csf |
| DK1539857T3 (da) * | 2002-07-24 | 2007-03-12 | Hoffmann La Roche | Polyethylenglycol-aldehydderivater |
| JP4571776B2 (ja) * | 2002-11-05 | 2010-10-27 | Ｊｘ日鉱日石エネルギー株式会社 | 潤滑油組成物 |
| NZ541122A (en) * | 2002-12-26 | 2008-09-26 | Mountain View Pharmaceuticals | Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity |
| EA008866B1 (ru) * | 2002-12-26 | 2007-08-31 | Маунтин Вью Фамэсьютикэлс, Инк. | ПОЛИМЕРНЫЙ КОНЪЮГАТ МОДИФИКАЦИЙ ИНТЕРФЕРОНА-β, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ПРОДУКТЫ НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ |
| NZ581460A (en) * | 2003-01-31 | 2010-02-26 | Biogen Idec Inc | Polymer conjugates of mutated neublastin |
| WO2004085648A2 (en) | 2003-03-19 | 2004-10-07 | Biogen Idec Ma Inc. | Nogo receptor binding protein |
| CA2864810A1 (en) | 2003-04-18 | 2004-11-04 | Biogen Idec Ma, Inc. | Polymer-conjugated glycosylated neublastin |
| CA2556923A1 (en) * | 2004-02-20 | 2005-09-09 | Rinat Neuroscience Corp. | Methods of treating obesity or diabetes using nt-4/5 |
| PT1776136E (pt) | 2004-06-24 | 2012-12-05 | Biogen Idec Inc | Tratamento de estados que envolvem desmielinização |
| NZ553420A (en) | 2004-08-19 | 2010-02-26 | Biogen Idec Inc | Refolding transforming growth factor beta family proteins |
| BRPI0514534A (pt) * | 2004-08-19 | 2008-06-17 | Biogen Idec Inc | variantes de neublastina |
| WO2006133164A2 (en) | 2005-06-06 | 2006-12-14 | Wyeth | Anti-trkb monoclonal antibodies and uses thereof |
| SI1904104T1 (sl) | 2005-07-08 | 2013-12-31 | Biogen Idec Ma Inc. | Protitelesa SP35 in njihova uporaba |
| ITRM20050447A1 (it) * | 2005-08-19 | 2007-02-20 | Anabasis S R L | Uso del nerve growth factor in collirio nella terapia di patologie del sistema nervoso centrale, quali la malattia di alzheimer e il morbo di parkinson. |
| EP1988923A1 (en) * | 2006-02-02 | 2008-11-12 | Rinat Neuroscience Corp. | Methods for treating unwanted weight loss or eating disorders by administering a trkb agonist |
| EP1988920A1 (en) * | 2006-02-02 | 2008-11-12 | Rinat Neuroscience Corp. | Methods for treating obesity by administering a trkb antagonist |
| TWI501774B (zh) | 2006-02-27 | 2015-10-01 | Biogen Idec Inc | 神經性病症之治療 |
| EP1993590B1 (en) * | 2006-03-01 | 2013-12-25 | Biogen Idec MA Inc. | Compostions and methods for administering gdnf ligand family proteins |
| US8377448B2 (en) * | 2006-05-15 | 2013-02-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Standford Junior University | CD47 related compositions and methods for treating immunological diseases and disorders |
| AU2007249709A1 (en) * | 2006-05-15 | 2007-11-22 | Viral Logic Systems Technology Corp. | CD47 related compositions and methods for treating immunological diseases and disorders |
| CA2672750A1 (en) * | 2006-12-20 | 2008-07-03 | Rinat Neuroscience Corporation | Trkb agonists for treating autoimmune disorders |
| JP5583005B2 (ja) | 2007-05-01 | 2014-09-03 | バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド | 血管新生を増大させるための組成物および方法 |
| WO2009020964A2 (en) * | 2007-08-08 | 2009-02-12 | Biogen Idec Ma Inc. | Anti-neublastin antibodies and uses thereof |
| WO2009048605A1 (en) * | 2007-10-11 | 2009-04-16 | Biogen Idec Ma Inc. | Methods for treating pressure induced optic neuropathy, preventing neuronal degeneration and promoting neuronal cell, survival via administration of lingo-1 antagonists and trkb agonists |
| CA2702630C (en) * | 2007-11-08 | 2017-11-21 | Biogen Idec Ma Inc. | Use of lingo-4 antagonists in the treatment of conditions involving demyelination |
| DK2982695T3 (da) | 2008-07-09 | 2019-05-13 | Biogen Ma Inc | Sammensætninger, der omfatter antistoffer mod lingo eller fragmenter deraf |
| RU2013103763A (ru) | 2010-07-02 | 2014-08-10 | Ангиохем Инк. | Короткие и содержащие d-аминокислоты полипептиды для терапевтических конъюгатов и их применения |
| CN104470541A (zh) | 2012-05-14 | 2015-03-25 | 比奥根艾迪克Ma公司 | 用于治疗涉及运动神经元的疾患的lingo-2拮抗剂 |
| CN102964442B (zh) * | 2012-11-19 | 2015-04-29 | 未名生物医药有限公司 | 一种聚乙二醇同神经生长因子结合物的制备方法 |
| JP2018504400A (ja) | 2015-01-08 | 2018-02-15 | バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． | Ｌｉｎｇｏ‐１拮抗薬及び脱髄障害の治療のための使用 |
| CN111514279B (zh) * | 2020-06-16 | 2023-07-18 | 温州医科大学附属第二医院（温州医科大学附属育英儿童医院） | 神经营养因子3在制备治疗男性性腺功能减退症的药物中的应用 |
| CN115025723A (zh) * | 2022-05-10 | 2022-09-09 | 吉林大学 | 经神经生长因子及多巴胺改良的peg-plga微球 |
Family Cites Families (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4179337A (en) * | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
| US4002531A (en) * | 1976-01-22 | 1977-01-11 | Pierce Chemical Company | Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby |
| US5169762A (en) * | 1983-03-03 | 1992-12-08 | Genentech, Inc. | Human nerve growth factor by recombinant technology |
| EP0154316B1 (en) * | 1984-03-06 | 1989-09-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Chemically modified lymphokine and production thereof |
| GB8430252D0 (en) * | 1984-11-30 | 1985-01-09 | Beecham Group Plc | Compounds |
| US4904584A (en) * | 1987-12-23 | 1990-02-27 | Genetics Institute, Inc. | Site-specific homogeneous modification of polypeptides |
| CA1340810C (en) * | 1988-03-31 | 1999-11-02 | Motoo Yamasaki | Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor |
| EP0401384B1 (en) * | 1988-12-22 | 1996-03-13 | Kirin-Amgen, Inc. | Chemically modified granulocyte colony stimulating factor |
| IL95511A (en) * | 1989-08-30 | 2000-10-31 | Max Planck Gesellschaft | Neurotrophin-3 a novel neurotrophic factor related to nerve growth and brain derived neurotrophic factor |
| US5180820A (en) * | 1989-08-30 | 1993-01-19 | Barde Yves Alain | Brain-derived neurotrophic factor |
| US5229500A (en) * | 1989-08-30 | 1993-07-20 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Brain derived neurotrophic factor |
| US5182107A (en) * | 1989-09-07 | 1993-01-26 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates |
| JPH04218000A (ja) * | 1990-02-13 | 1992-08-07 | Kirin Amgen Inc | 修飾ポリペプチド |
| IE912365A1 (en) * | 1990-07-23 | 1992-01-29 | Zeneca Ltd | Continuous release pharmaceutical compositions |
| DK0550665T3 (da) * | 1990-09-25 | 1996-12-02 | Genentech Inc | Ny neurotrofisk faktor |
| US5252714A (en) * | 1990-11-28 | 1993-10-12 | The University Of Alabama In Huntsville | Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde |
| US5389529A (en) * | 1991-06-12 | 1995-02-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Modified lamβ signal sequence and processes for producing recombinant neurotrophins |
| NZ244778A (en) * | 1991-10-21 | 1994-03-25 | Ortho Pharma Corp | Peg imidates and protein derivatives thereof |
| US5260308A (en) * | 1991-11-06 | 1993-11-09 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Method to increase permeability of the blood-nerve/brain barriers to proteins |
| US5468872A (en) * | 1993-09-16 | 1995-11-21 | Cephalon, Inc. | K-252a functional derivatives potentiate neurotrophin-3 for the treatment of neurological disorders |
-
1994
- 1994-11-14 US US08/340,131 patent/US5770577A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-11-12 IL IL11596595A patent/IL115965A/en active IP Right Grant
- 1995-11-13 EP EP95939123A patent/EP0792288B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-13 NZ NZ296452A patent/NZ296452A/xx unknown
- 1995-11-13 SK SK571-97A patent/SK283083B6/sk unknown
- 1995-11-13 ES ES95939123T patent/ES2126331T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-13 CN CN95197321A patent/CN1173183A/zh active Pending
- 1995-11-13 AU AU41071/96A patent/AU694589B2/en not_active Ceased
- 1995-11-13 MX MX9703362A patent/MX9703362A/es not_active IP Right Cessation
- 1995-11-13 RU RU97107892/04A patent/RU2136694C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-11-13 CZ CZ971375A patent/CZ137597A3/cs unknown
- 1995-11-13 WO PCT/US1995/014658 patent/WO1996015146A1/en not_active Ceased
- 1995-11-13 DK DK95939123T patent/DK0792288T3/da active
- 1995-11-13 JP JP8516219A patent/JPH10508853A/ja not_active Ceased
- 1995-11-13 HU HU9800671A patent/HUT77747A/hu unknown
- 1995-11-13 CA CA002204640A patent/CA2204640C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-11-13 AT AT95939123T patent/ATE175973T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-11-13 KR KR1019970703211A patent/KR100253762B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1995-11-13 DE DE69507507T patent/DE69507507T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-14 ZA ZA9509653A patent/ZA959653B/xx unknown
-
1997
- 1997-05-12 NO NO972176A patent/NO972176L/no not_active Application Discontinuation
-
1999
- 1999-03-23 GR GR990400878T patent/GR3029790T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2136694C1 (ru) | 1999-09-10 |
| WO1996015146A1 (en) | 1996-05-23 |
| AU694589B2 (en) | 1998-07-23 |
| EP0792288A1 (en) | 1997-09-03 |
| NO972176D0 (no) | 1997-05-12 |
| CN1173183A (zh) | 1998-02-11 |
| IL115965A (en) | 2001-01-28 |
| ZA959653B (en) | 1997-08-26 |
| US5770577A (en) | 1998-06-23 |
| AU4107196A (en) | 1996-06-06 |
| GR3029790T3 (en) | 1999-06-30 |
| IL115965A0 (en) | 1996-01-31 |
| MX9703362A (es) | 1997-08-30 |
| SK57197A3 (en) | 1999-02-11 |
| CA2204640C (en) | 2001-01-09 |
| NZ296452A (en) | 1999-01-28 |
| ATE175973T1 (de) | 1999-02-15 |
| DE69507507T2 (de) | 1999-05-27 |
| CA2204640A1 (en) | 1996-05-23 |
| KR100253762B1 (ko) | 2000-05-01 |
| DE69507507D1 (de) | 1999-03-04 |
| ES2126331T3 (es) | 1999-03-16 |
| JPH10508853A (ja) | 1998-09-02 |
| EP0792288B1 (en) | 1999-01-20 |
| SK283083B6 (sk) | 2003-02-04 |
| DK0792288T3 (da) | 1999-09-13 |
| HUT77747A (hu) | 1998-07-28 |
| NO972176L (no) | 1997-07-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ137597A3 (cs) | Konjugáty BDNF a NT-3 s vodou rozpustným polymerem | |
| MXPA97003362A (en) | Conjugates of bdnf and nt-3 with a polymer solubleen a | |
| DE69836438T2 (de) | Substantiell reine histidin-gebundene protein polymerkonjugate | |
| JP5334347B2 (ja) | 化学的に修飾した新規なエリスロポエチン刺激タンパク質組成物および方法 | |
| JP3747070B2 (ja) | 改良型インターフェロン−ポリマーコンジュゲート | |
| JP3177449B2 (ja) | 水溶性ポリマーで修飾したコンセンサスインターフェロン | |
| JP4909843B2 (ja) | 截形グリア細胞系由来神経栄養因子 | |
| CA2978330C (en) | Conjugates of an il-7 moiety and a polymer | |
| CN101328213A (zh) | G-csf偶联物 | |
| WO1999038891A1 (en) | Multimeric erythropoietin with altered biological activity | |
| US8530417B2 (en) | Y-shaped polyethylene glycol modified G-CSF, the preparation and use thereof | |
| HU203783B (en) | Process for producing superoxide-dismutase conjugates | |
| KR20150139982A (ko) | 제약학적으로 용도되는 신규한 뉴트린 접합체 | |
| CA2113206A1 (en) | Modified pf4 compositions and methods of use | |
| WO2001076639A2 (en) | Chemically-modified myelopoietin conjugates | |
| US20060286657A1 (en) | Novel bioconjugation reactions for acylating polyethylene glycol reagents | |
| US20090203589A1 (en) | Chemically modified human growth hormone receptor antagonist conjugates | |
| MXPA99011862A (es) | Conjugados mejorados de polimero de interferon |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |