CZ152197A3 - Process for preparing nisine variant - Google Patents

Description

Předkládaný vynález se týká vylepšených metod a bakteriálních kmenů pro produkci nisinu, zejmena proteinem zpracovaného nisinu.

Dosavadní stav techniky

Nisin je vysoce modifikované peptidové antibiotikum produkované, napříkad, jistými kmeny Lactococcus lactis. Je velmi důležitý pro potravinářský průmysl vzhledem ke své účinné antimikrobiální aktivitě proti širokému spektru gram - pozitivních mikroorganismů včetně mnoha kazících bakterií a potravních patogenů, například Listeria, Clostridium a Bacillus species (viz Fowler & Gasson (1990) v Food Preservatives (vyd. N.J. Russell & G.V. Goulds) str. 135 152, Blackie and Sons, Glasgow, UK).

Chemická struktura nisinu je dobře stanovena (Obrázek 1). Je členem rodiny antibiotik nazývaných lantibiotika. Tyto neobvyklé polycyklické peptidy sdílejí strukturální vlastnosti dehydro-zbytků a meziřetězcové sulfidové můstky vytvářející lanthioninové a β-methyllanthioninové kruhy. Atypické zbytky jsou vloženy posttranslační modifikací aminokyselin šeřinu, threoninu a cysteinu v primární sekvenci prekursorového peptidu (lantibiotika jsou předmětem nedávné rozsáhlé zprávy Junga (1991) v Nisins and novel Lantibiotics (vyd. Jury, G & Sáhl, H. - S.) str. 1-34, ESCOM, Leiden, Netherlands). Biosyntesa nisinu tak vyžaduje geny jak pro inaktivaci prekursoru nisinu, známého jako prenisin, (nisA), tak také pro modifikaci enzymů odpovědných za maturaci nisinu. Maturovaná molekula nisinu je založena na sekvenci 34 aminokyselin. Protein kódovaný nisA obsahuje 23 aminokyselinovou N terminální signální sekvenci, která je štěpena během sekrece nisinu. Konverse prenisinu, kódovaného nisA, na zralý nisin vyžaduje štěpení leaderu a modifikaci jednotlivých aminokyselin. NisA gen byl klonován a charakterizován a ukázalo se, že má chromosomální umístění (viz. Dodd et al., (1990) J.Gen. Microbiol. 136: 555 - 566). Množství dalších genů vyžadovaných v enzymatické modifikaci prenisinu, translokaci a odolnosti vůči nisinu je kodováno nisin produkujícími kmeny (Kuipers et al., (1993),

Eur. J. Biochem 216: 281 - 291; Engelke et al., (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 814 - 825).

Zavedené techniky proteinového zpracování mohou být použity pro zavedení změn aminokyselinové sekvence nisinu. Toto vyžaduje modifikování kódujícího regionu strukturálního genu pro nisin, nisA, například místně řízenou nebo náhodnou mutagenesí. Exprese těchto změn je komplikována faktem, že nisin je posttranslačně modifikován.

Variantní nisiny mohou být konstruovány expresí variantních nisA genů v hostitelských kmenech, které kódují nezbytný maturační systém, a tím zpracování modifikovaného prekursorového peptidu. Jedním přístupem je transformace nisin produkujících kmenů rekombinantním plasmidem kódujícím variantní nisA gen. Na takovémto pozadí jsou maturační enzymy hostitele schopny zpracovat jak residentní prenisin, tak jeho plasmidem kodovanou variantu. Strategie tohoto typu byla popsána pro kmeny nesoucí divoký typ nisinových transposonů (Kuipers et al., (1991) v Nisins and novel Lantibiotics (vyd. Jung, G & Sáhl, H. - S.) str. 250 - 259, ESCOM, Leiden, Netherlands). Nicméně, nevýhodou tohoto systému je to, že jak nisiny hostitele, tak zpracované varianty jsou syntetizovány společně, což způsobuje nezbytnost komplexních chemických separačních postupů před analýzou vlastností nového peptidu. Takové postupy mohou být zejměna nežádoucí pro průmyslový rozsah produkce variantního nisinu.

VO 93/20213 popisuje proces pro produkci variantního nisinu z Lactococcus za absence přirozeného nisinu, ve kterém je z plasmidu pocházející variantní nisA gen (který kóduje variantní nisin) zaveden do kmenu Lactococcus, který nesecernuje svůj přirozený nisA nisin (jelikož nisA gen byl inaktivován), ale je schopen exprese genů pro modifikaci nisinu, odolnosti vůči nisinu a translokaci z buňky.

VO 92/18633 popisuje na plasmidu založený systém pro expresi variantních nisinů z nisZ genu (nebo jeho mutantu) kmenů Lactococcus, které neprodukují přirozený nisA nisin.

Neočekávaně jsme zjistili, že při nahrazení přirozené, chromosomální kopie nisA genu (nebo alespoň jeho části) variantním nisA genem (nebo jeho částí) můžeme produkovat překvapivě vysoké hladiny nisinu, zejmena variantního nisinu, z Lactococcus. Tak předkládaný vynález poskytuje zlepšenou metodu a organismy pro produkci variantních nisinů s větší účinností.

Jeden aspekt vynálezu poskytuje metodu pro výrobu buněk, které neobsahují přirozený nisA gen, ale exprivují nisin, která obsahuje krok poskytnutí buněk s variantním nisA genem a geny pro modifikaci nisinu, sekreci a odolnost vůči nisinuu, kde variantní nisA gen má stejné vztahy jako přirozený nisA gen k seskupení genů obsahujícímu přirozený nisA gen a geny pro modifikaci nisinu, sekreci a odolnost vůči nisinu.

Poskytnutím buněk s variantní nisA genem geny pro modifikaci nisinu, sekreci a odolnost vůči nisinu je míněna inserce variantního nisA genu do buňky, která již obsahuje geny pro modifikaci nisinu, sekreci a odolnost vůči nisinu, stejně jako inserce do buňky - ve stejné době - variantního nisA genu do buňky, plus genů pro modifikaci nisinu, sekreci a odolnost vůči nisinu.

Seskupení genů, obsahující geny kódující pre-nisin A (který je zpracován za tvorby nisinu A) a genů pro modifikaci nisinu, sekreci a odolnost vůči nisinu z Lactococcus lactis (nisABTCIPRK)jsou popsány v Kuipers et al. , (1993), Eur. J. Biochem 216: 281 - 291; Engelke et al. , (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 814 - 825, což je zde uvedeno j ako odkaz.

NisA gen je gen, který kóduje pre-nisin (pre-nisin obsahuje 23 aminokyselin N terminální signální sekvence, které jsou odštěpeny v průběhu sekrece); o nisB a C se soudí, že jsou vyžadovány v reakcích, které modifikuji pre-nisin tvořený přímo z exprese nisA genu; nisT je podobný transportní ATP-ase a je vyžadován v translokaci nisinu z buňky; nisP je vyžadován v extracelulárním zpracování plně zralého prekursoru nisinu; nisR a K kódují regulační proteiny vyžadované v genové expresi a nisl je vyžadován v odolnost vůči nisinu. Nukleotidová sekvence nisABTCIPRK seskupení genů j e ukázána na Obrázku 7 a 8.

Preferovaně obsazuje variantní nisA gen stejnou pozici v seskupeni genů jako přirozený nisA gen. Je preferováno, aby buňkou byla lactococcová buňka, nejvíce preferována je buňka Lactococcus lactis. Vhodné buňky, zejměna Lactococcus buňky, jsou odborníkům snadno dostupné. Samozřejmě je požadováno, aby to byly nisin produkující buňky, preferovaně nisin produkující, maturující a secernující buňky, ale mohou být použity jakékoliv buňky. Například, přirozeně se vyskytující nisin produkující kmen NCFB894, jak je uložen v National Collection of Food Bacteria v Institute of Food Research, Norwich Laboratory, Norwich Research Park, Colney, Norwich NR4 7UA, UK (a jak je popsán v Gasson (1984) FEMS microbial lett. 21: 7 - 10) je vhodnou Lactococcus buňkou pro použití v metodě podle vynálezu.

Přirozeným nisA nisinem je míněno peptidové antibiotikum produkované některými přirozeně se vyskytujícími nisin produkujícími kmeny bakterií. Zralá molekula je založena na sekvenci aminokyselin kódované genem nisA. Chemická struktura přirozeného nisA nisinuje ukázána na Obrázku 1.

Termínem přirozený nisA nisin také jsou míněny jiné přirozeně se vyskytující nisiny, které jsou založeny na, ale liší se od, nisA nisinu ukázaného na Obrázku 1. Například, zahrnujeme sem nisin Z, který má stejnou chemickou strukturu jako nisA nisin ukázaný na Obrázku 1 s výjimkou histidinu v pozici 27, který je nahrazen asparaginem. U genu, který kóduje nisin Z, byla nalezena pouze jedna nukleotidová substituce při srovnání s nisA genem, který kóduje nisin A ukázaný na Obrázku 1.

Zvýšenou hladinou jeho přirozeného nisA nisinu ve srovnání s přirozenou hladinou” se mini, že buňka modifikovaná podle vynálezu produkuje alespoň o 5% více, lépe o 10% vice a nejlépe o 50% více a úplně nejlépe >100% více přirozeného nisA nisinu než nemodifikovaná buňka, pokud jsou kultivovány za stejných kultivačních podmínek.

Variantním nisinem je míníněna proteinově zpracovaná varianta přirozeného nisA nisinu, ve které byly provedeny změny aminokyselinové sekvence v důsledku místně řízené nebo náhodné mutagenese nisA genu. Vhodně, jedna nebo více chybných mutací je vloženo do protein kódujícího regionu, což vede k substituci jedné nebo více aminokyselin za jiné. Alternativně, nesmyslná mutace může být zavedena, takže je produkován zkrácený nisin. V tomto případě si nisin stále uchovává antibiotickou aktivitu, jako další alternativa mohou být provedeny delece a/nebo inserce nisA genu, pokud si výsledný nisin uchovává antibiotickou aktivitu.

Místně řízená mutagenese nisA genu může být provedena, například, oligonukleotidy řízenou technikou mutagenese podle Zoller & Smith (1984) DNA 3: 479 - 480, kde je použito chybně spárovaných oligonukleotidových primerů pro zavedení mutace. Je vhodné použít metodu pro zlepšení

Ί výnosu mutantů, například, dut-ung metodu, kterou popsal Kunkel (1985) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 488 - 492. Alternativně může být použita polymerasová řetězová reakce (PCR) pro generování mutantů za použiti chybně spárovaných oligonukleotidů (Saiki et al., (1988) Science 239: 487 491). Náhodné mutanty nisA genu mohou být vyrobeny chemicky, například, za použití hydrogensiřičitanu sodného nebo hydroxylaminu jako mutagenu. Alternativně, náhodné mutace mohou být vloženy do nisA genu za použití enzymatické chybné inkorporace za použití DNA polymerasy s relativně nízkou správností, například AMV reversní transkriptasy nebo Taq DNA polymerasy nebo za použití směsi oligonukleotidů, v průběhu syntesy, pro inkorporování malého množství každé odlišné base v každé pozici. Tyto metody jsou v oboru dobře známé.

Variantním nisA genem jsou míněny fragmenty nisA genu, kde se uvedené fragmenty liší ve srovnání s ekvivalentní částí přirozeného nisA genu

Variantním nisA genem specificky jsou míněny geny, ve kterých je promotorový region přirozeného nisA genu nahrazen jiným (heterologním) promotorem, preferovaně takovým, o kterém je známo, že je silnějším promotorem než je přirozený promotor nisA genu. Příklady vhodných promotorů jsou indukovatelný lacA promotor (van Rooijen et al., (1992), J.Bacteriol. 179: 2273 - 2280) a T7 promotor (Vells et al., (1993) , Mol. Microbiol. 5: 1155 - 1162), obé je zde uvedeno j ako odkaz.

Termínem variantní nisA gen jsou také míněny geny, ve kterých je modifikován vazebný region pro ribosomy, preferovaně pro vylepšeni účinnosti iniciace translace nisA kódujícího regionu.

Také zahrnuty v termínu variantní nisA gen jsou geny, které mají silentní mutace v kódujícím regionu, to znamená geny, ve kterých je jeden nebo více kodonů zaměněno za jejich synonyma, ale kde je těmito kodován přirozený nisA nisin. Účinnost translace může být vylepšena za použití takových variant nisin kódujících regionů. Také sem zahrnuj eme geny, které obsahuj i heterologní promotory pro řízení transkripce variantního kódujícího regionu, to znamená, promotory odlišné od promotoru přirozeného nisA genu.

Ve všech případech je preferováno, aby kombinace promotoru, ribosomálního vazebného místa a kódujícího regionu dávala optimální expresi nisinu kočovaného kódujícím regionem.

Variantní nisiny, které mají vylepšené vlastnosti ve srovnání s přirozeným nisA nisinem, jsou preferovány při přidání do potravin, například ty variantní nisiny, které mají silnější antimikrobiální aktivitu nebo které mají vyšší resistenci na hydrolýzu nebo degradaci. Variantní nisiny jsou popsány v VO 93/20213 a VO 92/18633 (zde uvedeno jako odkaz), a v příkladech ilustrujících tento vynález.

Preferované provedení vynálezu poskytuje metodu pro výrobu buněk, které buď (a) neexprivuj! svůj přirozený nisA nisin, ale exprivují variantní nisin, nebo (b) exprivuji zvýšené hladiny svého přirozeného nisA nisinu vzhledem ke přirozené hladině a, v každém případě, jsou schopny exprese genů pro modifikaci nisinu a odolnost vůči nisinu, kde tato metoda obsahuje krok substituce variantního nisA genu nebo jeho části za přirozený, chromosomální nisA gen nebo jeho část v chromosomálním umístění uvedeného přirozeného nisA genu.

Variantního nisA gen nebo jeho část může být substituována za přirozený, chromosomální nisA gen nebo jeho část v chromosomálním umístění uvedeného přirozeného nisA genu v jednom kroku nahrazení genu. Výhodně, plasmid obsahující variantní nisA gen nebo jeho část je zaveden do hostitelské buňky obsahující chromosomální kopii přirozeného nisA genu (a výhodně genů pro modifikaci nisinu, odolnost vůči nisinu a translokaci nisinu z buňky). Dvojitá zkřížená rekombinace může vést k tomu, že přirozený nisA gen nebo jeho část je nahrazen variantním nisA genem nebo jeho částí. Vzniklá buňka bude obsahovat chromosomální kopii variantního nisA genu a proto bude produkovat variantní nisin, protože variantní nisA gen obsahuje kódující region, který byl modifikován.

Není nezbytné, aby byl nahrazen celý nisA gen. Lepší je, aby byla nahrazena část nisA genu, která kóduje aminokyselinovou změnu přítomnou ve variantním nisinu nebo která obsahuje heterologní promotor.

NisA gen, a jiné geny nezbytné pro biosyntesu nisinu, maturaci a sekreci jsou přirozeně umístěny na transposonu, který je částí chromosomu. Tak, chromosomální umístěni označuje přítomnost nisA genu v chromosomální DNA uvnitř seskupení genů pro nisin (nisABTCIPRK) spíše než pozici seskupení genů vzhledem k jiným genetickým markérům na chromosomů.

Je dobře známé, že homologní rekombinace vyskytující se u Lactococcus je velmi neúčinná a nepředvídatelná a, ačkoliv výše popsaná přímá, jednokroková metoda je proveditelná, více je preferováno, pokud je nahrazení genu provedeno nepřímým, dvoukrokovým procesem, při kterém je možná selekce požadovaných rekombinantů jak bude nyní popsáno:

Další preferovaná metoda obsahuje kroky (1) substituci counter-selektovatelného nisA genu nebo jeho části za přirozený, chromosomální nisA gen nebo jeho část v chromosomálním umístění uvedeného přirozeného nisA genu a (2) substituci variantního nisA genu nebo jeho části za značkovací-selektovatelný nisA gen nebo jeho část v chromosomálním umístění uvedeného přirozeného nisA genu.

Značkovací-selektovatelným nisA genem míníme, že nisA gen je modifikován tak, že je snadno odlišitelný od přirozeného nisA genu nebo od variantního nisA genu.

Vhodně, značkovací-selektovatelný nisA gen je nisA gen, ve kterém byl insertován gen antibiotické resistence (jako je gen resistence na erythromycin) nebo to je nisA gen, ve kterém byly některé nebo všechny regiony deletovány. Je preferováno, ale není to nezbytné, aby značkovací-selektovatelný nisA gen neexprivoval nisin.

Není nezbytné, aby byl nahrazen celý nisA gen. Lepší je, aby byla nahrazena část nisA genu obsahující značkovací-selektovatelný markér.

V těchto příkladech může být značkovací-selektovatelný nisA gen odlišen od přirozeného nebo variantního nisA genu pomocí resistence na antibiotika značkovacího-selektovatelného genu a/nebo odlišností velikosti.

Tak je relativně snadné určit, zda bylo dosaženo kroku 1 preferované metody, jelikož vzniklá buňka, například, získá antibiotickou resistenci nebo, pokud měl značkovací selektovatelný nisA gen deleci, budou specifické fragmenty buněčné chromosomálni DNA chybět nebo budou redukované délky.

To, že specifické fragmenty buněčné chromosomálni DNA chybý nebo jsou redukované délky může být snadno určeno známými molekulárními technikami jako je Southern blotting, polymerasová řetězová reakce (PCR) nebo analýza polymorfismu délky restrikčních fragmentů (RFLP).

Obdobně je relativně snadné určit, zda bylo dosaženo kroku 2 preferované metody, jelikož vzniklá buňka, například, ztratí antibiotickou resistenci nebo získá fragment chromosomálni DNA.

Obyčejně, v tomto preferovaném provedení, je selekce asociovaná s krokem 2. Například, je preferováno, aby značkovací-selektovatelný gen v kroku 1 obsahoval deleci celého nebo části nisA kočujícího regionu (delta nisA) a aby v kroku 2 bylo vybráno správné nahrazení variantním nisA genem. Tak, v preferované metodě, Lactococcus lactis kmen, obsahující ^Ληί8Α gen (vyrobený v kroku 1) je použit ve kroku 2. Termosensitivní přenosový vektor (replikace-permisivní při nízké teplotě, ale nikoliv při vysoké teplotě) je použit pro zavedení variantního nisA genu na chromosom ^AnisA kmenu. Například, ^AnisA kmen je transformován plasmidem obsahujícím variantní nisA gen a gen pro antibiotickou resistenci, a buňka je inkubována při permisivní teplotě za přítomnosti antibiotika. Buňka je potom přenesena do nepermisivní teploty za přítomnosti antibiotika a jednotlivé křížení vede k integraci plasmidu do chromosomu v místě plasmid/chromosom homologie (t.j. ve společných regionech ''nisA a variantního nisA genu) .

Buňka je pak transferována do nepermisivní teploty pro umožnění replikace plasmidu. rekombinace mezi dvěma homologními sekvencemi obklopuj ícími integrovaný plasmid vede k jeho excisi z chromosomu. Druhé probíhající kříženi vede tomu, že jak sekvencím pocházející z plasmidu (t.j. variantního nisA genu), tak původní sekvenci (t.j. značkovacího-selektovatelného nisA genu) jsou uchovány na chromosomu. Jak bylo zmíněno výše, variantní nisA gen a značkovací-selektovatelný nisA gen mohou být rozlišeny, a jsou vybrány buňky obsahující variantní nisA gen.

Buňky jsou zbaveny plasmidu kultivací za absence antibiotika.

V této preferované metodě je celý nisA gen a sousedící sekvence účinně nahrazen identickými sekvencemi, s vyj ímkou specificky inkorporovaných mutací. Velikost fragmentu plasmidové DNA, obsahujícího variantní nisA gen je omezena požadavkem na homologii sekvencí (jak na plasmidu, tak na chromosomu) přes které je rekombinace provedena, aby přinesla integraci plasmidu a následně nahrazení genu. Je zde preferována vektorová konstrukce, která má přibližně 1 kb homologní sousedící sekvence k jakékoliv alteraci sekvence. Například, náš vektor pro genovou náhradu má přibližně 800 bp na straně nisA genu a 1200 bp na druhé straně. Při redukci velikosti lze očekávat redukce incidence homologních rekombinací a tím šance na detekování genového nahrazení. Obrázek 10 ilustruje rekombinace, které se vyskytuji během preferované metody.

Metoda podle vynálezu vede k buňkám, které produkují vaiantní nisin z chromosomálních kopií variantního nisA genu nebo přirozený nisA nisin z chromosomální kopie variantního nisA genu. jak bylo zmíněno výše, nejvíce je preferováno, jestliže má variantní nisin antibiotickou aktivitu. Tak, buňky budou vykazovat Nis⁺ fenotyp, protože buňky produkují nisin (variantní nebo přirozený).

Určili jsme, že tyto nisin produkující buňky nezbytně musí být odolné na nisin v těch hladinách, ve kterých tyto produkují tento antimikrobiální peptid. Tak, v dalším preferovaném provedení metoda obsahuje další krok selekce těch buněk, které jsou odolné vůči nisinu, alespoň při hladině 1000 U/ml.

Ačkoliv je preferováno, aby buňky produkované podle '4 metody exprivovaly variantní nisin, metoda také zahrnuje výrobu buněk, které mohou exprivovat přirozený nisA ve vysokých hladinách díky silnému, heterolognímu promotoru.

V méně preferovaném provedení seskupení genů obsahuje variantní nisA gen a geny pro modifikaci nisinu a odolnost vůči nisinu a toto seskupení je umístěno na autonomně se replikujícím DNA elementu. Obyčejně je tímto autonomně se replikujícím elementem plasmid. Hostitelskou buňkou pro plasmid je buňka, která neexprivuje přirozený nisA nisin. Například, Lactococcus buňka, ve které nejsou přítomné přirozené geny pro nisin, nebo kde je nisA gen inaktivován.

Klonováni celého seskupení genů pro nisin na plasmid vyžaduje integraci velkého segmentu (= 11 kb) DNA. Tato strategie má výhodu v umožnění alterace množství kopií a tak dávky genu a také může usnadnit transfer nisinových determinant do spektra alternativních pozadí hostitele. Existují dva preferované typy replikonů (které využívají odlišné způsoby replikace), které mohou být využita jako vhodné vektory: kruhové plasmidy (například pTG262,

Dodd et al., (1990), J.Gen. Microbiol. 136: 555 - 566) nebo theta typ plasmidů (například, pIL253, vysoké množství kopií, a pIL277, nízké množství kopií, Simon and Chopin (1988) Biochimie 70: 559 - 566). Obě zprávy jsou zde uvedeny jako odkazy. Pokud metoda podle vynálezu využívá lactoccocové buňky, je preferováno, aby plasmid byl přenosový plasmid, což je plasmid, který se může replikovat v laktococcových buňkách a může se také replikovat v j iných hostitelských buňkách jako je Escherichia coli.

Jsou vyvinuty různé metody pro operativní navázání DNA na vektory prostřednictvím jejich komplementárních lepivých konců. Například, komplementární homopolymerové úseky mohou být přidány k DNA segmentu, který má být insertován na vektorovou DNA. Vektor a DNA segment jsou potom spojeny vodíkovou vazbou mezi komplementárními homopolymerovými konci za tvorby rekombinantních DNA molekul.

Syntetické linkery obsahující jedno nebo více restrikčních míst poskytuji alternativní metodu pro připojení DNA segmentů na vektor. DNA segment, generovaný trávením restrikční endonukleasou jak bylo popsáno dříve, je ošetřen bakteriofágovou T4 DNA polymerasou nebo E.coli DNA polymerasou I, enzymy, které odstraňují přesahující,

3’-jednořetězcové konce pomocí své 3’-5’-exonukleolytické aktivity a vyplňují přerušené 3’- konce pomocí své polymerizující aktivity.

Kombinace těchto aktivit proto generuje tupě zakončené DNA segmenty. Tupě zakončené segmenty j sou potom inkubovány s velkým molárním přebytkem linker molekul za přítomnosti enzymu, který je schopen katalyzovat ligaci tupě zakončených DNA molekul, jako je bakteriofágová T4 DNA ligasa. Tak, produktem reakce j sou DNA segmenty nesoucí polymerické linkerové sekvence na svých koncích. Tyto DNA segmenty jsou pak štěpeny vhodným restrikčním enzymem a ligovány do expresního vektoru, který byl štěpen enzymem, který produkuje konce kompatibilní s konci DNA segmentu.

Syntetické linkery obsahující množství míst pro restrikční endonukleasy jsou komerčně dostupné z množství zdrojů včetně International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, USA.

Žádoucím způsobem pro modifikaci DNA kódující polypeptid podle vynálezu je použití polymerasové řetězové reakce jak jí popsal Saiki et al., (1988), Science 239: 487 - 491.

V této metodě je DNA, která má být enzymaticky amplifikována, obklopena dvěma specifickými oligonukleotidovými primery, které samy budou inkorporovány do amplifikované DNA. Uvedené specifické primery mohou obsahovat rozpoznávací místa pro restrikční endonukleasu, která mohou být použita pro klonování do expresních vektorů za použiti metody v oboru známé.

Druhý aspekt vynálezu poskytuje buňky, které neobsahují přirozený nisA gen, ale exprivuj! nisin, které obsahují variantní nisA gen, kde variantní nisA gen má stejné vztahy jako přirozený nisA gen ke genovému seskupení, obsahujímu přirozený nisA gen a geny pro modifikacinisinu, sekreci a odolnost vůči nisinu.

V nejvíce preferovaném provedení je přirozený, chromosomální nisA gen, nebo jeho část, nepřítomen a buňka obsahuje variantní nisA gen nebo jeho část v chromosomálním umístění uvedeného přirozeného nisA genu.

Preferovanou buňkou je Lactococcus, lépe Lactococcus lactis.

Je preferováno, aby buňky exprivovaly variantní nisin, ačkoliv buňky, které exprivují zvýšené hladiny přirozeného nisA nisinu také tvoří část vynálezu.

Běžně variantní nisA gen obsahuje transkripční a translační kontrolní sekvence, které umožňují buňce bud’ exprivovat variantní nisin, nebo, v případě přirozeného nisA nisinu, umožňují buňce exprivovat tento ve zvýšené úrovni. Tak, v j ednom provedení buňka obsahuj e variantní , nisA gen skládající se z heterologního promotoru, který řídí expresi nisin kóduj ícího regionu (který může exprivovat . přirozený nisA nisin nebo variantní nisin).

V méně preferovaném provedení buňka obsahuje autonomně se replikujícím DNA element nesoucí variantní nisA gen a geny pro modifikaci nisinu a odolnost vůči nisinu. V tomto případě nebude buňka mít aktivní chromosomální nisA gen a preferovaně žádné chromosomální geny pro nisin.

Třetí aspekt vynálezu poskytuje proces pro produkci nisinu, který obsahuje kultivaci buněk jak je popsáno ve třetím aspektu vynálezu a získání nisinu zde produkovaného.

Výhodně je nisinem variantní nisin.

To je preferováno, jestliže buňky jsou buňkami podle nejvíce preferovaného provedení.

» Zjistili jsme, že při použití buněk podle nejvíce preferovaného provedení můžeme produkovat neočekávaně vysoký . výnos nisinu, zejměna ve srovnání se známými procesy, které využívají plasmidové nisA geny pro expresi nisinu (za absence plasmidových genů odolnosti vůči nisinu, modifikace a sekrece). Další podrobnosti tohoto překvapivého účinku jsou dány v Příkladech. Nicméně, v tomto bodě je významné si uvědomit, že, v případě nisinu variantního jak v tom, že dehydroalanin 5 je nahrazen alaninem, tak dehydroalanin 33 je nahrazen alaninem (tento je známý jako nisinA/Dha 5A, Dha 33A), buňky podle předkládananého vynálezu, ve kterých je přirozený nisA gen nahrazen variantním nisA genem, produkují vice než stonásobek nisinu ve srovnání s předchozími buňkami, ve kterých byl stejný variantní nisin (nisinA/Dha 5A, Dha 33A) kodován plasmidem. Navíc, všechny variantní nisiny, které byly testovány, dávaly vyšší výnos z buněk podle předkládaného vynálezu ve srovnání s dřívějšími buňkami obsahujícími gen pro variantní nisin na plasmidů.

Další výhody proti předchozím metodám a buňkám j sou získány za použití buněk nejvíce preferovaného provedení pro produkci nisinu. Například, jelikož buňky neobsahuji plasmid, tak zde není požadavek pro antibiotickou selekci během kultivace a ztráta plasmidů během kultivace není problémem.

Tak, pro stabilitu je výhodné, že gen pro variantní nisin je integrován uvnitř bakteriálního chromosomu i když jako část nisinového transposonu Tn5301. Tento další je extremně stabilní a skutečně jsme zjistili, že je obtížné ho úmyslně eliminovat. Laboratorní selekce pro plasmidový markér zabraňuje, aby toto byl praktický problém, ale pro průmyslové použití může toto být nevýhodou. Může být nežádoucí přidávat antibiotika k fermentaci.

V méně preferovaném provedení je variantní nisA gen a geny pro modifikaci nisinu a geny pro odolnost vůči nisinu nesen na autonomně se replikujícím elementu, jako je plasmid. Je jasné, v tomto provedení, že plasmidová selekce je požadována během kultivace buněk.

Zejmena preferovaným provedením třetího aspektu vynálezu je to, kde jsou buňky kultivovány za přítomnosti nisA nisinu nebo variantního nisinu, který může indukovat expresi nisinu. Nisin A, kde Ile30 je nahrazen Trp (I30V) je příkladem varianty, která v důsledku své mutace, nefunguje správně jako induktor své vlastní biosyntesy. Přidáním sub-inhibičních koncentraci nisinu do kultivačního media, během fermentace, jsou produkovány vysoké hladiny variantního nisinu. Jakékoliv varianty, které jsou méně účinné jako indukční agens, mají prospěch z inkluze nisinu do kultivačního media (t.j. krok nisinové indukce v purifikační proceduře). Velikost indukce se liší v závislosti na počáteční indukční kapacitě jakékoliv jednotlivé varianty (u I30V produkce nisinu A se více než zdvojnásobí v důsledku indukce). Indukce může být rutinně obsažena v metodě jako prostředek pro maximalisaci úrovně produkce Jakékoliv obavy ohledně kontaminace divokým typem molekuly jsou minimální, jelikož koncentrace nisinu potřebná pro indukci je zanedbatelná vzhledem k množství variantního nisinu, který je purifikován. Obyčejně, nisA nisin je minimální množství, které poskytuje maximální indukci produkce nisinu. Toto množství může být odborníkem určeno empiricky. Vhodné koncentrace nisA nisinu v tomto provedení jsou od 1 nM do 500 nM, výhodně 10 nM až 250 nM, ještě lépe 50 nM až 150 nM a nejlépe 100 nM.

Krok HPLC s reverzní fází v jakékoliv purifikaci potvrdí separaci jakéhokoliv nisA nisinu od variantních nisinů.

Čtvrtý aspekt vynálezu poskytuje nisin produkovaný způsobem podle vynálezu.

Přítomnost nenasycených mastných kyselin v lantibiotikách včetně nisinu a role, kterou hrají v biologických vlastnostech těchto komplexů molekul je zejmena v zájmu analýz struktura/funkce. Bylo navrženo, že reaktivní nenasycené vazby, které charakterizují dehydroaminokyseliny, hrají klíčovou roli v antimikrobiální aktivitě subtilinu, lantibiotika, používaného proti růstu bakteriálních spor. Tato residua také přitahují pozornost jako možný zdroj molekulární nestability. Dlouho je známo, že antimikrobiální aktivita komerčních vzorků přirozeného nisA nisinu se zhoršuje při skladování a že množství chemických složek je nacházeno v takových vzorcích (Berridge et al., 1952) a Chán et al., (1989) demonstrovali, že se vyskytuje specifické štěpení dehydroalaninových zbytků ve zralé molekule.

Štěpení v Dha5 vede k otevření prvního lanthioninového kruhu nisinu a je spojeno se ztrátou antimikrobiální aktivity. Oproti tomu, degradačni produkty vzniklé jako výsledek štěpení v Dha33 si uchovávaly v podstatě divoký typ aktivity (Chán et al., 1989).

V VO 93/20213 popisujeme konstrukci L.lactis derivativů exprivujících nisinA/Dha5A, nisinA/Dha33A a nisinA/Dha5A,Dha33A. V této práci také demonstrujeme, že tyto zpracovanné nisiny si uchovávají svou antimikrobiální aktivitu proti senzitivním indikátorovým kmenům. Stručně, jak je popsáno detailněji v Příkladech, tyto nisiny mohou být produkovány účiněj i předkládaným procesem. Nicméně, předkládaný proces může také být použit pro produkci jakýchkoliv dalších variantních nisinů, které mají jiné, vylepšené vlastnosti, stejně jako jsou kódovány variantním nisA genem.

Pátý aspekt vynálezu poskytuje použití nisinu produkovaného podle procesu podle vynálezu jako antimikrobiální agens. Schopnost nisinu inhibovat růst bakterií kazících potraviny a potravních patogenů vedla k jeho širokému použití jako přirozenného preservativu v jistých potravních produktech, zejmena mléčných produkech jako jsou měkké sýry. Variantní nisiny jsou také používány.

Popis obrázků na připojených výkresech

Vynález bude nyní popsán detailněji s odkazem na následující obrázky a příklady, kde:

Obrázek 1 ukazuje molekulární strukturu přirozeného nisinu A. Změny, které byly provedeny na sekvenci v důsledku proteinového zpracování, jsou ukázány šipkou.

Obrázek 2 ukazuje diagramaticky některé rekombinantní plasmidy konstruované a používané v této práci.

Obrázek 3 ukazuje diagramaticky značkovací selektovatelné nisA geny, kde je buď inzertován gen resistence na erythromycin, nebo byla provedena delece posunem rámečku (nisA-fs). Sekvence jsou ukázány v seznamu sekvencí jako SEQ

ID NO: 12 až 17.

Obrázek 4 ukazuje nukleotidovou sekvenci alespoň části přirozeného nisA genu a expresní signály ukazující změny zavedené PCR-zprostředkovanou místně řízenou mutagenesí. BamHI a BglII místa obklopující nisA byla zapracována do plasmidu pFI740 (Obrázek 2d). Substituce Ser 5 a Ser 33 kodonů za kodony pro alanin ve variantních nisA genech je ukázána nad sekvencí. Ukázané sekvence j sou v seznamu sekvencí jako SEQ ID NO: 18 a 19.

Obrázek 5 ukazuje agarosovou gelovou elektroforesu PCR fragmentů generovaných primery P39 a P40.PCR reakce byly provedeny na koloniích: dráha 3, FI5876; 4, FI7990; 5-10, FI7990 (pG hostiteló derivát) po proceduře genové náhrady. Standardy velikostí:- dráha 1 a 12, lambda DNA trávená BglI; 2 a 11, lambda DNA tárvená HindlII.

Obrázek 6 ukazuje plotnový difuzní biotest. 150 μΐ vzorků buněk prostých extraktů z kmenů: 4, FI5876; 5,FI7990; 7, FI8198; 8, FI8199 bylo zavedeno do jamek v MRS agaru osídleném indikátorovým kmenem Lactobacillus helveticus CH-1. Plotny byly inkubovány přes noc při 42 ®C. Standardy obsažené v testovací plotně jsou: - 1,50; 2,100; 3,200; 9,300; 10,400 U/ml.

Obrázek 7 ukazuje sekvence nisA, nisB, nisT, nisC a nisl genů Tn5276 L.lactis NIZO R5, a je převzat od Kuipers et al., (1993) Eur. Journal Biochem. 216: 281 - 291. Putativní riosomová vazebná místa (RBS) a invertované repeaty (->) jsou ukázány, jako je transkripční iniciační místo nisA genu a jeho předcházející autentické sekvece. Umístění restrikčních mist jsou následující: AccI, 6383 - 6388; Bell, 2914 - 2919; EcoRI, 3461 - 3466; EcoRV, 1805 - 1810; HaelII, 6509 - 6512; Ncol, 6218 - 6223; Ndel, 4518 - 4523; Pstl,

7418 - 7423; Sstl 283 - 288, 1547 - 1552 a 2463 - 2468.

Obrázek 8 ukazuje nukleotidovou sekvenci klonovaného 5,0 kb regionu downstream od nisC s otevřenými čtecími rámečky nisl, nisP, nisR a nisK, a je převzat z Engelke et al. , (1994), Appl. Environ. Microbiol. 60, 814 - 825. Možná ribosomální vazebná místa (RBS), restrikční místa, a invertované repeaty jsou podtrženy. Otevřené čtecí rámečky jsou označeny jednopísmenným kódem. Šipky ukazují putativní signální peptidová štěpící místa Nisl a NisP; putativní membránová kotvící sekvence je podtržena. Konzervovaná, funkční a aktivní místa aminokyselin jsou psána tučným písmem a označena hvězdičkou.

Obrázek 9 ilustruje vektor pro nahrazení genu. Velikost klonovaných fragmentů, které vytvářejí nisA kazetu a sousedící sekvence jsou dány v párech bází.

Obrázek 10 popisuje názorně protokol náhrady genu.

Obrázek 11 ukazuje dvouřetězcovou nukleotidovou sekvenci nisA genu a aminokyselinovou sekvenci pre-nisinu. -35 a -10 regiony a transkripČní iniciační místo jsou ukázány spolu s místem pro restrikční enzym použitým v nisA kazetě (viz Obrázek 2) nad DNA sekvencí. Je ukázáno umístění primerů (5’- konec) využitých v amplifikaci kazety fragmentů a PCR zprostředkované mutagenesi, nad a pod sekvencí, jako horizontální černé šipky ukazující směr DNA syntesy. Specifická aminokyselinová substituce, jako výsledek mutagenese, je ukázána pod sekvencí pre-nisinu.

Obrázek 12 je representace organisace nis genů.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Konstrukce Lactococcových buněk, ve kterých je přirozený, chromosomální nisA gen nahrazen variantním nisA genem.

Metody

Mikrobiologické techniky a použité kmeny. Lactococcové kmeny použité v této studii a jejich původ jsou dány v Tabulce 1.

Tabulka 1: Lactococcové kmeny použité v této studii.

Kmen	nisA mutace	Aktivita	Odolnost (U/mlxlO3	Odkaz
MG1614	-	-	0.01	Gasson (1983)
FI5876	divoký	+	>1	J.Bacteriol. 154, 1-9 Dodd et al.,
FI1847	typ nisA-(fs)		0.5 - 0.75	(1990) J.Gen. Microbiol. 136,555 - 566 Horn et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 228,129 - 135 tato práce
FI7990	AnisA	-	0.25 - 0.5	tato práce
FI8070	nisA/S5A	+	>1	tato práce
FI8198	nisA/S33A	+	>1	tato práce
FI8199	nisA/S5A S33A	+	>1	tato práce
FI7893	nisA	+	>1	tato práce
FI8003	nisA	-	0.25 - 0.5	tato práce

Není-li stanoveno jinak, byly kultury kultivovány při 30 v M17 mediu (Terzaghi and Sandine (1975) Appl. Environ.

Microbiol. 29, 807 - 813) doplněného 0.5% (hmotnost/objem) glukosy (GM17 medium). Bylo provedeno vyšetření kmenů na rezistenci na antibiotika při následujících hladinách: erythromycin, (Em^r) 5 pg/ml; streptomycin, (Sm^r) 200 gg/ml.

Escherichia coli MC1022 (Casadaban and Cohen (1980)

J. Mol. Biol. 138: 179 - 207) byla hostitelským kmenem pro konstrukci a molekulární analýzu rekombinantních plasmidů odvozených od vektorů pMTL23p (Chambers et al., (1988) Gene

68, 139 - 149), pGEM-3Z (Pr omega) , pCR™II (Invitrogen) a pG+host6 (Appligene). Rekombinantní plasmidy použité, a konstruované v průběhu této studí, jsou ukázány na Obrázku 2. E.coli kultury byly propagovány při 37 θϋ v L bujónu (Lennox (1955) Virology 9, 190 - 206). Selekce pro resistenci na ampicilin (Ap^r) byla provedena při 100 pg/ml, chloramfenikol (Cm^r) při 15 gg/ml, a erythromycin (Em^r) při 400 pg/ml.

Aktivita nisinu ve kmenech Lactococcus byla testována jak nepřímými, tak přímými prostředky. Difuzní biotesty na plotně byly provedeny jak bylo popsáno dříve (Dodd et al. , (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58, 3683 - 3693. Kolonie kultivované na povrchu GM17 plotny byly přímo testovány vypláchnutím chloroformem na 12 minut a překrytím agarem osídleným nisin sensitivním L. lactis kmenem MG161. Plotny byly inkubovány přes noc a byla měřena velikost zon okolo kolonií ve srovnání se zónami kontrol. Odolnost vůči nisinu byla určena očkováním kultur na sérii GM17 agarových ploten obsahujících zvýšenou koncentraci nisinu a hodnocením stupně růstu při různých hladinách nisinu. Kontrolní kultury (FI5876, pozitivní) a MG1614 (negativní) byly obsaženy na každé plotně.

Molekulární techniky

Celková DNA, plasmidová DNA byly provedeny jak popisuje Dodd et al., (1990), J.Gen. Microbiol. 136, 555 - 566 a Horn et al., (1991) Mol. Gen Genet., 228, 129 - 135. Restrikční enzymy a jiné DNA modifikující enzymy z různých zdrojů byly použity podle doporučení dodavatele. Rekombinantní plasmidy byly znovu získány transformací E.coli jak bylo popsáno dříve (Dodd et al., výše) nebo elektroporací L.lactis podle Holo and Nes (1989) Appl. Environ. Microbiol.55, 3119 - 2123 s modifiací podle Dodd et al., (1992), výše. Podmínky použité pro polymerasovou řetězovou reakci (PCR) byly ty, které popisuje Horn et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 228, 129 - 135. Primery byly syntetizovány na Applied Biosystems DNA syntetizéru (model 381A) a jsou uvedeny v Tabulce 2.

Fragmenty generované pro konstrukci vektorů pro genovou náhradu byly amplifikovány za použití Dynozym (Flowgen) a ’Τ’Τνί klonovány do pCRⁱⁿII před potvrzením nukleotidové sekvence, pro rutiní PCR vyšetřování rekombinantních klonů byla použita AmpliTaq-DNA polymerasa (Perkin Elmer). Přímé určení nukleotidové sekvence purifikovaných PCR generovaných templátů bylo provedeno na Applied Biosystems DNA sekvenátoru (model 373A) za použití výrobcova Taq’Dydeoxy’terminátorový cyklus sekvenačního kitu.

Tabulka 2. Primery použité v této studii

P13	(SEQ	ID	No	1)	5 ' -AACGGATCCGATTAAATTCTGAAGTTT<t-t > BamHI
P17 (SEQ GTGCAAT-:	ID 3'	No	2)	5 ’ -TCAGAGCTCCTGTTTTACAACCGGGTGTACATA
P18	(SEQ	ID	No	3)	5·-TAGTATTCACGTAGCTAAATAACC-3'
P19	(SEQ	ID	No	4)	5·-TTGGTTATTTAGCTACGTGAATAC-3'
P25	(SEQ	ID	No	6)	5'-AATCGGATCCGTTTATTATGCTrar-7' BamHI
P26	(SEQ	ID	No	6)	5' -ATAGTTGACGAATATTTAATA ΑΤΤΤΤ-ί * HincII
P27	(SEQ	ID	No	7)	5’-CTTGGTCGACACCATATTTT-Ί· Sáli
P28	(SEQ	ID	No	8)	5'-GTTAGATCTGACATGGATAC-3' Bglll
P32	(SEQ	ID	No	9)	5' -CCATGTCAGATCTAACAAAATAC-·} ' Bglll
P3 9	(SEQ	ID	No	10)5'-GACTTTCCATTATGCTTGGATTTTT-3 '
P40	(SEQ	ID	No	11)5'-GCTCCTATGCCAAATGTAGAATC-3 '

Konstrukce nahrazovacích vektorů nisA genu

Termosenzitivní přenosový vektor pG+host6 byl využit pro provedení genového přenosu. Homologní plasmidová DNA pocházející z pFI172 (Dodd et al., (1990) výše), která obsahuje 2,1 kb region FI5876 chromozomu (Obr. 2a) včetně nisA genu. Celý fragment byl subklonován do pG+host6 za generování nisA gen nahrazovacího vektoru pFI690 (Obr. 2b). Následná manipulace s tímto regionem, vedoucí k inaktivaci nebo mutagenesi nisA genu (viz níže) byla provedena jak v pGEM-3Z, tak pMTL23P. Konečným krokem v konstrukci každého gen nahrazujícího vektoru bylo klonování 2,1 kb fragmentu do pG-host6. Deriváty pG-host6 byly zavedeny do E.coli a plasmidová DNA, z tohoto hostitele, byla použita pro transformaci L.lactis FI7990 (Tabulka 1).

nisA mutace posunu rámečku - nisA-(fs)

Inzerční inaktivace nisA genu, klonováním Em^r genu do několika vnitřních Sací míst, byla popsána dříve (Dodd et al., (1992) výše). V tomto plasmidu je Em^r gen obklopen krátkým mnohotným klonujícím místem (Obr. 3). Trávení restrikčním enzymem Smál, po kterém následovala ligace pro recirkularizaci vektorových sekvencí, vedlo k deleci Em^r genu. Reziduální sekvence z mnohotného klonovacího místa ponechaly 20 bp inserci uvnitř Sací místa a způsobily výskyt mutace posunu rámečku v kodonu 16 nisA genu. Prvních 38 aminikyselin kódovaných tímto mutovaným genem (označeným nisA-(fs)) je neovlivněno. Nicméně, předpokládaný translační produkt bude zkrácený prenisin (45 zbytků), obsahující na nisinové aminokyselinové sekvenci RYPTOGEL na svém

COOH-konci (Obr.3). nisA-(fs) mutace byla subklonována do pG+host6 za generování gen-nahrazujícího vektoru pFI674 (Obr.2c).

nisA delece - /\nisA

Inaktivace nisA genu bylo také dosaženo delecí kódujícího regionu. Aby se delece omezila pouze na nisA bylo nezbytné zapracovat další restrikční enzymová místa na každou stranu- genu. Byly projektovány primery, pro PCR amplifikaci, které inkorporovaly BamHI místo (P13, Tabulka 2) 80 bp upstream od počátku nisA a BglII místo (P32,

Tabulka 2) 25 bp za stop kodon, v důsledku 2 bp změn v každém případě. Sousedící fragmenty (ukázané na Obr 2d) byly také generovány za použití PCR amplifikace. Primery P26 a P25 byly využity pro amplifikaci upstream 211 bp HincII/BamHI fragmentu a primery P28 a P27 byly využity pro amplifikaci downstream 1.1 kb BglII/SalI fragmentu (Tabulka 2). Templáty použité pro tuto PCR reakci byly pFI172 DNA. Vzniklý plasmid (pFI740) obsahoval intaktní nisA gen obklopený zapracovanými BamHI a BglII místy, vše obsaženo ve 2,1 kb sekevence homologní ke chromosomu (Obrázek 2d). Trávení pFI740 těmito dvěma enzymy, po kterém následovala ligace jejich kompatibilních konců vedlo ke generování plasmidu pFI751, ve kterém byl deletován nisA gen, a byl označen ^nisA (Obrázek 2e). PCR amplifikace této části plasmidu a analýza nukleotidové sekvence regionu překlenujícího deleci v amplifikovaném fragmentu potvrdila, že proběhla fúze BamHI a BglII míst.

nisA místně specifické mutace

Konstrukce plasmidu pFI877 (Obrázek 2f) umožnila použiti strategie kazetové mutagenese pro zavedení místně specifických mutací do nisA genu. Tento pGEM-3Zderivát obsahuje ekvivalentní sekvence jako pFI690 (Obrázek 2b), ale obsahuje zapracovaná BglII místa downstream nisA v pFI740 (Obrázek 2d). V pFI877 je HincII/SacI fragment kódující aminoterminální region nisA a upstream expresní signály nahrazen PCR generovaným fragmentem pFI740, který obsahuje zapracované BamHI místo. Tak, jediným rozdílem mezi sekvencí v pFI87 a ekvivalentní chromosomální sekvencí divokého typu je přítomnost dalšího BglII místa downstream od nisA genu. Konstrukce této nisA kazety je taková, že místně specifická mutace může být snadno zavedena do genu. PCR zprostředkovaná mutagenese byla použita pro amplifikaci buď HincII/SacI nebo SacI/BglII fragmentů obsahujících amino nebo COOH terminální regiony nisA genu, v příslušném pořadí. Tyto fragmenty, obsahující specifickou mutaci byly pak substituovány za divoký typ fragmentu pFI877. Mutace byly inkorporovány buď do primerů použitých k amplifikaci fragmentů kazety, nebo, pokud bylo požadované místo mutace vnitřní, byla použita technika spojené přesahující extense (Ho et al., (1989) Gene 77, 51 - 59) se specifikými mutacemi inkorporovanými do dvou komplementárních primerů překlenujících místo mutace (Dodd et al., (1992), výše).

Protokol nahrazení genu

L.lactis FI7990 transformanty obsahující deriváty pG+host6 byly udržovány při 28 θθ a kultivovány přes noc při této teplotě v GM17 obsahujícím Em v 5 gg/ml (GM17-Em). Přibližně 10^ buněk bylo použito pro inokulaci 100 ml čerstvého, předehřátého GM17-Em a kultury byly inkubovány při 28 po 4 hodiny. Inkubace pokračovala přes noc při zvýšené teplotě 37 θθ. Tato teplota je nepermisivní pro pG+host6 replikaci (Biswas et al., (193) J.Bacteriol. 175, 3628 - 3635) a přítomnost Em v kultivačním mediu zajišťuje selekci těch buněčných linií, ve kterých jednotlivá křížení veda k integraci derivátu do chromosomu v místě plasmid/chromosom homologie (Leenhouts et al., (1989) Appl. Environ. Microbiol. 55, 394 - 400; (Leenhouts et al., (1990) Appl. Environ. Microbiol. 56, 2726 - 2735; Chopin et al., (1989) Appl. Environ. Microbiol. 55, 1769 - 1774). Předhřáté GM17 (bez Em) bylo inokulováno přibližně 10^ buňkami z kultury přes noc a bylo inkubováno při 28 ®C. Při této teplotě je možná replikace plasmidu a rekombinace mezi homologními sousedícími sekvencemi integrovaného plasmidu, což vede k jeho excisi z chromosomu. V závislosti na výskytu druhého křížení budou na chromosomu zachovány buď sekvence pocházející z integrovaného plamidu, nebo původní sekvence. Délky DNA homoloie j sou ukázány na Obrázku 9. Tyto sekvence pocházející z AccI/SalI fragmentu vytváří část Sáli fragmentu, který je klonován a sekvencován v plasmidu pFI 172 (Dodd et al., (1990) J.Gen. Microbiol. 136, 555 - 566).

Kultury byly ředěny a šířeny, pro jednotlivé kolonie, na GM17 agarových plotnách. Aby byly ošetřeny buňky plasmidu, byly plotny inkubovány při 37 θθ. Kolonie (přibližně 50) byly vyšetřovány na ztrátu pG+host6 derivátu přenesením na GM17 plotny obsahující Em (5 gg/ml). Za použití této

-techniky k přerušení nisA genu byly kolonie také vyšetřovány na ztrátu nisinové aktivity a PCR analýza relevantního regionu chromosomu byla použita pro potvrzení jakýchkoliv změn na molekulární úrovni.

Protokol nahrazení genu je názorně ilustrován na Obrázku

10.

Výsledky

Inaktivace chromosomálně kódovaného FI5876 nisA genu

Pro identifikaci buněčných linií, které získaly variantní nisA geny bylo vhodné nejprve konstruovat Nis hostitelské kmeny, inaktivací vlastního nisA genu. Dobře charakterizovaný nisin produkující kmen L.lactis FI5876 byl selektován pro tento účel (Dodd et al (1990) výše; Horn et al. , (1991) výše). Geny pro biosyntézu nisinu z tohoto kmene byly klonovány a sekvencovány (Dodd et al., (1992) výše).

Genové nahrazení bylo použito k substituci divokého typu nisA genu u FI5876 plasmidem pFI674 kódovaným nisA-(fs) genem (Obr. 2d, 3). Z padesáti vyšetřovaných kolonií bylo pět Em^s a Nis^-, což naznačuje, že v těchto FI5876 derivátech proběhla náhrada genu. Navíc, tento výsledek naznačuje, že tento modifikovanžý nisA gen byl defektní a neexprivoval prekursorovou molekulu, která by mohla vyzrát v aktivní formu. Jeden z Nis kmenů, označený FI7847, byl analyzován dále. K testování systému bylo demonstrováno, že nisA-(fs) mutace v FI7847 může být revertována zpět na divoký typ provedením ekvivalentního experimentu za použití nisA genového nahrazovacího vektoru pFI69O (Obr.2b). Znovuzískáni produkce nisinu u vzniklého kmenu s nahrazeným genem,

FI7898, indikovalo, že Nis^-fenotyp vykazovaný FI7847 byl jedinou příčinou narušení nisA genu. Jiné determinanty biosyntesy nisinu se zdály být nepoškozeny přesmykem nisA genů. Alternativním přístupem bylo generování Nis hostitele delecí celého chromosomálního nisA genu u FI5876. Plasmid pFI751 (Obr. 2e) byl konstruován za tímto účelem a genová náhrada byla použita pro inkorporaci přibližně 300 bp delece ^ΛηίβΑ (Obr.4) na místo nisA. Nis kmeny byly znovu získány v asi stejné frekvenci aká byla shledána pro nisA-(fs) genovou náhradu. V tomto případě mohly být ^AnisA obsahující kmeny snadno rozlišeny od rodičovských kmenů PCR analýzou. Primery P39 a P40 (Tabulka 2, Obr. 2a) amplifikovaly 1,8 kb fragment v těchto kmenech s genovou náhradou (Obr. 5, dráha 4) ve srovnání s 2,1 kb fragmentem generovaným z ekvivalentního regionu FI5876, kódujícího divoký typ nisA (Obr.5, dráha 3). V jednom z Nis^- kmenů, označeném FI7990, potvrdila analýza nukleotidové sekvence PCR generovaného 1,8 kb fragmentu, že ^Ληΐ8Α byl inkorporován do správného regionu chromosomu. System byl znovu testován a bylo ukázáno, že produkce nisinu může být obnovena v FI7990 derivovaných kmenech nahrazením genu s pFI690 (Obr. 2b). PCR analýza těchto Nis⁺ kmenů ukázala, že ^AnisA mutace (1,8 kb fragment) byla nahrazena divokým typem nisA genu (2,1 kb fragment). Protože tento systém byl výhodný pro schopnost snadné identifikace genové náhrady na podkladě PCR analýzy (iz Obr. 5), byla další charakterizace a konstrukce mutantů provedena za použití FI7990 jako hostitelského kmene.

Odolnost vůči nisinu

Účinek narušení nisA genu na odolnost hostitelského kmene vůči nisinu byla popsána drive (Dodd et al, (1992) výše), jak bylo očekáváno, oba FI7847 (nisA-(fs)) a FI7990 (^AnisA) vykazovaly redukovanou odolnost vůči nisinu (Tabulka 1). nisA deletovaíiý kmen FI7990 byl sensitlvní na nisin v koncentracích mezi 250 a 500 U/ml ve srovnání s rodičovským kmenem, který pokračovqal v růstu za přítomnosti nisinu více než 1000 U/ml. Zajímavé je, že FI7847, kódující zkrácený nisA gen, vykazoval střední hladinu odolnosti vůči nisinu (horní hranice mezi 500 a 750 U/ml s pokračováním slabého růstu do 1000 U/ml, Tabulka 1).

Možným vysvětlením pro rozdíl těchto dvou Nis^- kmenů v sensitivitě na nisin vychází ze studií genových nahrazení vyžadujících vektor pFI740 (Obr. 2d). Kmen FI8003, generovaný substitucí defektního nisA genu intaktním plasmidem pFI740 kódovaným nisA, měl Nis^- fenotyp. Tento výsledek kontrastuje s výsledkem ekvivalentního experimentu náhrady genu, využívajícího pFI90 (Obr. 2b), ve kterém byl získán Nis⁺ fenotyp (viz výše). Jediným rozdílem mezi dvěma využitými sekvencemi je to, že pFI740 má další BamHI místi inkorporované 80 bp upstream ATG start kodonu nisA, a Bglll místo hned downstream kódujícího regionu (Obr.4). Výzkum těchto sekvencí ukázal, že BamHI místo přesahuje navržený -35 region promotoru identifikovaného Kuipers et al., (1993)

Eur. J. Biochem. 216, 281 - 291. Jedna měna párů bází zavedená v důsledku BamHI místa způsobila konvertování -35 sekvence z CTGATT na CCGATT (Obr.4).

Tyto výsledky naznačují, že u pFI740 byl přirozený nisA promotor narušen a proto tyto kmeny, jako FI8003, které genovou náhradou inkorporovaly BamHI místo také získaly defektní promotor. Zvýšená sensitivita na nisin u těchto kmenů (přibližně 50% divokého typu), navzdory intaktnímu nisA genu, napovídá, že tyto potenciální promotorové aktivní sekvence hrají roli v odolnosti vůči nisinu.

Preferovaný protokol využívá odolnosti vůči nisinu j ako prostředek přímé selekce Nis⁺ kmenů, u kterých proběhlo nahrazení genů a spočívá na faktu, že inaktivace nisA promotoru u FI7990 vede k dostatečně vysoké senzitivitě na nisin, takže rodičovské kmeny nemohou růst na selektivních plotnách. Nis“ kmeny , které si zachovali upstream promotorové sekvence (apř. FI7847) byly nevhodné pro tento postup, protože rostly při hladinách nisinu, které byly shedány optimálními pro selekci znovu nabytých Nis⁺, t.j.

500 U/ml (Tabulka 1).

Genová náhrada - identifikace variantní nisA kódujících kmenů

Z předcházejících experimentů genové náhray provedených v konstrukci a testování Nis“ kmenů FI7847 a FI7990 bylo známo, že substituce chromosomálních sekvencí pro ekvivalentní homologní region provedená pG+host6 derivátem se vyskytovala v nízké frekvenci. U následného obnovení intaktniho nisA genu u těchto hostitelů, genovou náhradou, se očekávalo, že povede ke znovuzískáni nisinové aktivity. Žádný Nis⁺ kmen v populaci by potom neměl selektivní výhodu před Nis^- rodiči. Nicméně, počáteční pokusy o obnovení

- 37 aktivace nisA genu vedly u většiny vyšetřovaných kolonií k zachování defektní nisA rodičovské sekvence.

Obnoveni Nis⁺ fenotypu je nezbytné pro funkční mechanismy odolnosti vůči nisinu a vyžaduje expresi nisA genu. Protokol genové náhrady, využitý pro konstrukci FI7847 a FI7990 byl modifikován pro usnadnění identifikace derivátů, které získaly nisA nebo variantní nisA geny, které vedly k produkci nisinu. Získání Nis⁺ kolonií závisí na naší interpretaci, že tyto buňky musi také nezbytně být odolné vůči nisinu v hladině, ve které produkují tento antimikrobiální peptid. V modifikovaném protokolu genové náhrady zahrnoval konečný krok přidání nisinu na GM17 agarové plotny, v hladině 500 U/ml. Kolonie odolné vůči nisinu, které rostly v tomto mediu, byly vyšetřovány na Em^r a testovány na produkci nisinu. PCR analýza byla také použita pro určení organisace genomových sekvencí. Obrázek 5 ukazuje fragmenty generované PCR (za použití primerů P39 a P40, Obr. 2a) ze šesti kolonií, které prošly procedurou genové náhrady. U všech bylo zjištěno, že získaly funkční kopii nisA genu (v tomto případě nisA/S5A) jak je ukázáno 300 bp zvětšením velikosti PCR fragmentu. Tento postup byl shledán jako velmi spolehlivý prostředek pro identifikaci Nis⁺ derivátů FI7990, jelikož tento hostitelský kmen byl sám sensitivní na hladinu nisinu využitou v selekčních plotnách. U většiny kolonií (přibližně 90%) vyšetřovaných tímto způsobem bylo jištěno, že podlehly genové náhradě a že exprivují funkční nisA gen nebo variantu na místě chromosomální léze ^nisA. Tato strategie byla úspěšně použita pro selekci několika derivátů FI7990, které jsou nyní exklusivně exprivující pracované nisiny místo nisinu A.

Jak bylo popsáno výše vyžaduje protokol integraci termosensitivního plasmidu, p+Ghost6 do chromosomu, po čemž následuje excize. Za předpokladu, že se křížení vyskytuje se stejnou frekvencí mezi homologními sekvencemi na každé straně mutace, lze předpokládat, že počet buněk nesoucích nyní mutaci bude stejný jako počet buněk identických s rodičovským kmenem. Nebylo prokázáno, že je to pravda a většina vyšetřovaných kolonií si uchovala genetickou organizaci rodičovského kmene FI7990. Důvod pro toto není jasný, ale je předpokládáno, že okamžitý účinek integrace funkčního nisA genu je škodlivý pro hostitelskou buňku. Bylo popsáno, že exprese nisA genu předchází expresi sousedního nisB genu o 30 minut (Engelke et al., (1994) výše) a transkripce dalších determinant v seskupení genů pro nisin může být obdobně oddálena, s ohledem na produkci prenisinu. Tyto kmeny, které získaly nisA gen genovou náhradou nemusí být plně odolné vůči antimikrobiálním účinkům molekuly nisinu. Takové kmeny nebudou životaschopné. Nicméně, byli jsme schopni obnovit Nis⁺ fenotyp genovou náhradou, ve kterém byla produkce nisinu oddálena, což dovolovalo vznik plné odolnosti vůči nisinu.

Konverze Dha na Ala zbytky

Dehydroalaninová (Dha) zbytky v polohách 5 a 33 (Obr. 1) byla nejprve zaměřena pro zapracování změn v nisinové molekule. Cílem bylo substituovat serinové zbytky, ze kterých jsou Dha odvozena, za alaniny, které neobsahují potenciálně nestabilní nenasycené vedlejší řetězce. Mutace v nisA, S5A byla generována PCR za použití primerů P26 a P17 (Tabulka 2). Amplifikace vedla k 40 bp HincII/SacI fragmentu obsahujícímu aminoterminálni konec nisA a obsahující substituci Ser kodonu (koordinát 173, Obr. 4) za CGT, který určuje alanin. 90 bp SacI/BglII fragment obsahující COOH terminální konec nisA byl generován PCR za použití primerů P10 a P32 (Tabulka 2) a obsahoval krok sestřižení přesahujících prodloužení s primery 18 a 19 (Tabulka 2). Tento další pár komplementárních primerů obsahoval alaninový kodon, CGT, na místě serinového kodonu v koordinátu 257 (Obr. 4). Subklonování těchto PCR generovaných fragmentů, buď separátně, nebo společně, do vhodného vektoru pro genovou náhradu vedlo k nepřerušovanému kódujícímu regionu určujícímu buď nisA/S5A, nisA/S33A nebo nisA/S5A, S33A genu. Transformace FI7990 plasmidovou DNA následovaná procedurou genové náhrady vytvořila množství kolonií, kde většina z nich byla Em^s a Nis⁺. Relevantní region chromosomu byl zkoumán PCR za použití kombinace primerů P39 a P40 a v kažém případě 300 bp fragment, srovnaný s FI7990 (viz Obr.5) indikoval, že proběhla genová náhrada. Analýza nukleotidové sekvence PCR generovaných fragmentů potvrdila, že, v každém případě, tři varianty nisA genu byly inkorporovány do chromosomu na místě ^nisA lése. Reprezentanti každého kmenu s náhradou genu, FI8070 (nisA/S5A), FI8198 (nisA/S33A) a FI8199 (isA/S5A, S33A) byly charakterizovány dále.

Exprese všech tří mutovaných nisA genů vedla k produkci aktivní molekuly jak bylo určeno přímo překrytím kolonii.

Difusní biotest na plotně na buněčný extrakt ukázal, že hladiny antimikrobiální aktivity proti Lactobacillus helveticus byly srovnatelné s hladinami rodičovského kmene FI5876 (Obr.6). FI8070, kódující nisA/S5A, generoval zónu inhibice stejné velikosti, jako byla zóna inhibice rodičovského kmene FI5876. Toto naznačuje, že mutace ve variantním nisinu (nisin A/Dha5A) neovlivňuje signifikantně jeho antimikrobiální vlastnosti vůči tomuto indikátorovému organismu. U buněčného extraktu z FI8198 (produkující variantní nisin A/Dha33A) bylo v souladu s tím zjištěno, že produkuje zónu inhibice větší než rodičovský kmen (Obr.6). Toto odpovídá asi 50% zvýšení hladin nisinu A, za podmínek zde použitých (Tabulka 1). Vyšší hladina produkce nebyla nalezena u extraktu z FI8199, produkujícího dvojitě mutantní nisin A/Dha5A,Dha33A. Inhibiční účinek této nisinové varianty byl shodný účinku nisinu A obsahujícímu jednu mutaci a také divokému typu molekuly (Tabulka 1). Ve všech příadech byl výnos jednotlivých variant nisinu vyšší, když bylo použito strategie genové náhrady, než když byl využit shodný plasmidem kódovaný gen v plasmidovém komplementačním systému (Tabulka 3, Dodd et al., (1992) (1993) výše).

Tabulka 3 Srovnání nisinové aktivity z Lactoccocových expresních systémů varianta nisinu nisinová aktivita^a(% divokého typu)

komplementace^	genová náhrada' 100 100
nisin A(divoký typ)	50 25
nisin A	(Dha5A)
nisin	A	(Dha33A)	10	150
nisin	A	(Dha5A,Dha33A)	<ld	100

^a určeno z difuzního biotestu na plotně b antimikrobiální aktivita dosažená plasmidem kódovanými nisA geny komplementujícími nisA deficienci v hostitelském kmenu F17 3 3 2 ^c antimikrobiální aktivita dosažená genovou náhradou. Funkční nisA gen inkorporovaný v chromosomu v FI7990 v místě nisA delece ^d aktivita byla pod úrovní detekce v biotestu

Systém zde vyvinutý produkuje variantní nisiny s výnosem ekvivalentním výnosu nisinA produkujících rodičovských kmenů FI5876 (Tabulka 1). V případě divokého typu nisA genu je výnos o asi 50% vyšší, než dříve dosažené hladiny nisinu za použití analogických přístupů plasmidové komplementace (Dodd et al., (1992)(1993) výše). Další srovnání těchto dvou systémů ukazuje, že rozdíl mezi úrovní produkce je překvapivě více zřetelný pro nisinové varianty (Tabulka 3).

Přístup genové náhrady zvyšuje výnos nisinu A/Dha5A přibližně 4-krát a nisinu A/Dha33A více než desetkrát. Zvýšená účinnost produkce dvojitě mutantního nisinu A/Dha5A, Dha33A překvapivá (Tabulka 3). Pokud je gen, který specifikuje tento variantní nisin kodován plasmidem a použit ke komplementaci nisA deficience hostitelských kmenů, je antimikrobiální aktivita delegována pouze ve více sensitivním testu převrstvení kolonií. Buněčné extrakty z tohoto kmenu nevykazují jakoukoliv aktivitu v difuzních biotestech na plotně (Tabulka 3). Nicméně, pokud je gen inkorporován do chromosomu za použití strategie genové náhrady, je hladina aktivity ekvivalentní hladině nisin A representující zvýšení produkce o více než 100%. Toto neočekávané zjištění je ve vztahu s následujícími chemickými a biochemickými analýzami zpracovaných molekul. Značné množství purifikovaných peptidů je vyžadováno pro plnou charakterizaci nových nisinů a pro produkci vhodného množství pro uspokojení trhu potravinových ochraných prostředků a u zde popsaného systému se zdá, že je relativně vysokého množství dosaženo.

Produkovali j sme množství kmenů produkuj icích variantní nisin za použiti metodologie popsané v tomto příkladě. Tyto jsou popsány v Tabulce 4. Vhodné oligonukleotidové primery pro provedení specifických mutací byly projektovány ze sekvence dané na Obrázku 4 a jak ukazuje Obrázek 11.

Vhodné oligonukleotidové priery pro provedení specifických mutací byly projektovány ze sekvence dané na Obrázku 4 a jak ukazuje Obrázek 11.

Tabulka 4. Kmeny produkující nisin generované genovou náhradou

Kmen číslo	nisA mutace	Aktivitaa (% wt)	MICHb (pg ml
MG1614	-	-	-
FI5876	wt	100	0,13
FI7990	^nisA	-	-
FI8070	S5A	100	0,25
FI8198	S33A	150	0,25
FI8199	S5A.S33A	100	1,00
FI8167	H27V	<1	ndc
FI8122	S5A,H27V	10	nd
FI8307	II27K	100	0,13
FI8328	H31K	25	nd
FI8330	H27K,H31K	10	nd
FI8256	K12L	10	0,13
FI8290	ΛΜ21	<1	nd
FI8289	I30V	<1	0,16

^a Antimikrobiální aktivita v supernatantech kultury určená v difuzním biotestu na plotně ^b Minimální inhibiční koncentrace (MIC) byly určeny vzhledem k senzitivnímu L.lactis kmeni MG1614, nd, není určeno.

Za některých okolností je požadováno přidat nisA nisin jako induktor. Tabulka 5 ukazuje výsledky použití různých indukuj ících agens.

Tabulka 5:

Kmen	Indukuj ící agens (varianta nisinu)	Indukce 100 ng ml_F	MIC 1 mg ml“^mg ml-·^
MG1614		2	4
FI5876	-	94	100	-
FI7847	-	3	3	-
FI7847	A(divoký typ)	104	104	0,13
FI7847	Dha5A	114	107	0,25
FI7847	Dha33A	17	101	0,25
FI7847	Dha5,33A	34	106	1,00
FI7847	H27K	86	nt	0,13
FI7847	K12L	81	nt	0,13
FI7847	I30V	41	nt	0,16

Příklad 2: Purifikace variantního nisinu

Kmen FI8070 (nisA/S5A) je kultivován a variantní nisin (ve kterém je Dha5 nahrazen alaninem) je secernován do kultivačního media.

Variantní nisin je purifikován na základě metod popsaných Mulders et al., (1991) Eur.J.Biochem. 201, 581 - 584. 1 litr kultury byl inkubován při 30 po 16 hodin. pH kultur bylo redukováno na 2-3 HCl před centrifugaci při 10000 rpm po 10 minut. Buněk prosté supernananty byly odebrány a pH bylo zvýšeno na 5-6 lOmM NaOH. Ke každým 10 ml supernatantu bylo přidáno 0.99 g (NH^^SÍ^. Tento roztok byl potom filtrován (Millipore, 0,45 gm) před během na Fractogel TSK

Butyl koloně, objem lůžka 5 x 20 cm, nejprve ekvilibrovaná 0,8 M (NH₄)₂SO₄. Kolona byla promyta asi 1 litrem 0.8 M (NH₄)₂SO₄ dokud se absorbance při 220 nesnížila pod 0,5. Navázaný nisin byl eluován 5 mM HC1 a 10 ml frakce byly testovány na nisinovou aktivitu. Aktivní frakce byly shromážděny a sušeny vymrážením. Reversní fáze HPLC byla provedena na resuspendovaných vzorcích za použití gBondapak C^g kolony 3,9 x 300 mm při pokojové teplotě, použitými rozpoušědly byly 0.06% (objem/objem) kyseliny trifluoroctové a 0.06% (objem/objem) kyseliny trifluoroctové v 90% (objem/objem) vodném acetonitrilu. Absorbance byla měřena při 220 nm.

Příklad 3: Přidání variantního nisinu do sýru

Variantní nisin produkovaný kmenem FI8070 (ve kterém je Dha5 nahrazen alaninem) je přidán v koncentraci 12,5 mg na kg k poazánce z měkkého sýru, aby zabránil růstu jídlo kazících nebo patogenních bakterií.

3ffi? ® W&W A WWMl 8

Claims (26)

1. Způsob pro výrobu buněk, které neobsahuj i přirozený nisA gen, ale exprivuji nisin, vyznačující se tím, že obsahuje krok poskytnutí buněk s variantním nisA genem a geny pro modifikaci nisinu, sekreci a odolnost vůči nisinu, kde variantní nisA gen má stejné vztahy jako přirozený nisA gen k seskupeni genů obsahujícímu přirozený nisA gen a geny pro modifikaci nisinu, sekreci a odolnost vůči nisinu.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že variantní nisA gen kóduje variantní nisin.

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačuj ící se t i m, že variantní nisA gen obsahuje regulační region jiný než regulační region přirozeného nisA genu a nisin kódující region.

4. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že obsahuje substituci variantního nisA genu za přirozený, chromosomální nisA gen v chromosomálním místě uvedeného přirozeného nisA genu.

5. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že poskytuje seskupení genů obsahující variantní nisA gen a geny pro modifikaci nisinu a odolnost vůči nisinu na autonomně se replikujícím

DNA elementu.

6. Způsob podle jakéhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že buňkou je Lactococcus.

7. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že obsahuje kroky 1) substituce značkovacího selektovatelného nisA genu za přirozený, chromosomální nisA gen v chromosomálním místě uvedeného přirozeného nisA genu a 2) substituce variantního nisA genu za značkovací selektovantelný nisA gen v chromosomálním místě uvedeného přirozeného nisA genu.

8. Způsob podle jakéhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že obsahuje následný krok selekce buněk, které jsou odolné vůči nisinu.

9. Způsob podle nároku 7 nebo 8, vyznačující se t í m, že značkovací selektovatelný nisA gen obsahuje gen pro rezistenci na antibiotika.

10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že dále obsahuje krok selekce buněk, které jsou sensitivní na uvedená antibiotika.

11. Způsob podle jakéhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že variantní nisA gen obsahuje modifikaci k transkripční nebo translační kontrolní sekvenci přirozeného nisA genu a, v důsledku tohoto buňka exprivuje zvýšené hladiny svého přirozeného nisA nisinu ve srovnání s přirozenou hladinou.

12. Buňka připravitelná způsobem podle jakéhokoliv z předcházej ících nároků.

13. Buňka, která neobsahuje přirozený nisA gen, ale exprivuje nisin, kde tato buňka obsahuje varintní nisA gen, kde variantní nisA gen má stejné vztahy jako přirozený nisA gen k seskupení genů, obsahujícímu přirozený nisA gen a geny pro modifikaci nisinu, sekreci a odolnost vůči nisinu.

14. Buňka podle nároku 13, kde variantní nisA gen kóduje variantní nisin.

15. Buňka podle nároku 13 nebo 14, kde variantní nisA gen obsahuje regulační region jiný než regulační region přirozeného nisA genu a nisin kódující region.

16. Buňka podle jakéhokoli nároku 13 až 15, kde je přirozený chromosomální nisA gen nebo jeho část nepřítomen a buňka obsahuje variantní nisA gen v chromosomovém umístění uvedeného přirozeného nisA genu.

17. Buňka podle jakéhokoli nároku 13 až 15, obsahující autonomně se replikující DNA element nesoucí variantní nisA gen a geny pro modifikaci nisinu, sekreci a odolnost vůči nisinu.

18. Buňka podle jakéhokoli nároku 13 až 17, kterou je Lactococcus.

19. Buňka podle jakéhokoli nároku 13 až 18, která je odolná vůči nisinu.

20. Buňka podle jakéhokoli nároku 13 až 19, kde variantní nisA gen obsahuje modifikaci k transkripční nebo translační kontrolní sekvenci přirozeného nisA genu a, v důsledku tohoto buňka exprivuje zvýšené hladiny svého přirozeného nisA nisinu ve srovnání s přirozenou hladinou.

21. Způsob pro produkci nisinu zahrnuj ící kultivaci buněk podle jakéhokoliv z nároků 12 až 20 a získání nisinu takto produkovaného.

22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že nisin je variantní nisin.

23 .Způsob podle nároku 21 nebo 22, vyznačující se ΐ í m, že buňka je kultivována za přítomnosti nisA nisinu nebo variantního nisinu, který může indukovat expresi nisinu.

24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že množství nisA nisinu je minimální množství, které poskytuje maximální indukci produkce nisinu.

25. Nisin produkovaný podle jakéhokoliv z nároků 21 až 24.

26. Použití nisinu podle jakéhokoliv z nároků 21 až 24 jako antimikrobiálního agens.