CZ154098A3

CZ154098A3 - Použití neimunosupresivního cyklosporinu pro výrobu léčiva pro ovlivňování neurologické aktivity u zvířete

Info

Publication number: CZ154098A3
Application number: CZ981540A
Authority: CZ
Inventors: Joseph P. Steiner; Gregory S. Hamilton; Solomon H. Snyder
Original assignee: Guilford Pharmaceuticals Inc.; Johns Hopkins University School Of Medicine
Priority date: 1995-11-20
Filing date: 1996-11-15
Publication date: 1998-12-16
Also published as: AU7721096A; CN1207043A; JP3089350B2; JPH09143198A; US20030013645A1; EP0880358B1; WO1997018828A1; PL327994A1; DE69629392D1; EP0880358A4; DE69629392T2; AU714482B2; US6444643B1; CN1123360C; LV12125B; ES2206608T3; LV12125A; NO982264D0; ATE246510T1; NO982264L

Description

Použití neimunosupresivního cyklosporinu pro výrobu léčiva pro ovlivňování neurologické aktivity u zvířete

Oblast techniky

Předložený vynález se týká použití neimunosupresivního cyklosporinu pro výrobu léčiva pro ovlivňování neurologické aktivity u zvířete.

Dosavadní stav techniky

Název imunofilin přináleží velkému počtu proteinů, které se uplatňují jako receptory základních imunosupresivních látek, a sice cyklosporinu A (CsA), FK506 a rapamycinu. Známými skupinami imunofilinů jsou cyklofiliny a FK506 vázající proteiny jako je FKBP. Zatímco cyklosporin A se váže na cyklofilin, FK506 a rapamycin se váží na FKBP. Tyto komplexy imunofilin-imunosupresivní látka jsou odpovědny za řadu signálních, intracelulárních systémových odezev, zvláště v imunitním systému a nervové soustavě.

Imunofiliny jsou známy svou enzymovou aktivitou ve smyslu peptidylprolyl izomerázy a rotamázy. Bylo zjištěno, že rotamázová aktivita se katalyticky podílí na vnitřní konverzi cis- a trans-izomeru imunofilinových proteinů.

Původně byly imunofiliny objeveny a studovány ve tkáni imunitního systému. Odborníci se původně domnívaly, že inhibice rotamázové aktivity imunofilinů vede k inhibici proliferace T-buněk, která je příčinou imunosupresivního účinku imunosupresivních léčiv jako je cyklosporin A, FK506 a rapamycin. Další studia ukázala, že inhibice rotamázové aktivity sama o sobě nedostačuje k dosažení imunosupresivní účinnosti. Zdá se, že imunosupresivní účinek vyvěrá ze složení a konfigurace komplexu imunosupresivních látek a imunofilinů. Ukázalo se, že cílovým působištěm komplexů imunofilin-imunosupresivní léčivo jsou ternární proteiny. V případě FKBP-FK506 a FKBP-CsA se tyto komplexy imunosupresivní látka-imunofilin váží na enzym kalcineurin za inhibice signálního receptoru T-buněk, který je ···· zodpovědný za jejich proliferaci. Podobně komplex rapamycinu a FKBP interaguje s proteinem RAFT1/FRAP za inhibice signálního receptorů buněk IL-2.

Imunofiliny byly nalezeny ve vysokých koncentracích v centrální nervové soustavě. Jejich koncentrace je zde desetkrát až padesátkrát větší, než v imunitním systému. Zdá se, že v nervové tkáni imunofiliny ovlivňují syntézu oxidu dusného, uvolňování neurotransmiteru a proces šíření neuronu.

S překvapením bylo nyní zjištěno, že pikomolámí koncentrace takových imunosupresivnfch látek jako je cyklosporin A stimuluje zmnožování neuritu u buněk PC 12 a u senzorických neuronů, jmenovitě u dorsálních kořenových ganglionů. Konkrétněji uvedeno, jistilo se, že látky s vysokou afinitou k cyklofilinu jsou potenciálními inhibitory rotamázové aktivity a vykazují vynikající neurotropní účinky. (Snyder et al. Imunofiliny v nervovém systému, Nátuře Medicíno, Vol.l, No. 1 Leden 1995,32 - 37). Tato zjištění naznačují použití inhibitorů rotamázové aktivity cyklofilinu pro ovlivňování různých periferních neuropatií a pro podporu neuronální obnovy v centrální nervové soustavě. Studia ukázala, že neurodegenerativní onemocnění jako je Alzheimerova nemoc nebo Parkinsonova nemoc se vyvíjejí jako důsledek ztráty nebo snížené dostupnosti neurotropních látek, specifických pro konkrétní populaci neuronů, napadených nemocí.

Dosud bylo v centrální nervové soustavě nalezeno a identifikováno několik neurotropních faktorů, účinných pro specifické skupiny neuronů. Například se předpokládalo, že Alzheimerova nemoc je výsledkem snížení hladiny nebo ztráty nervového růstového faktoru. Předpokládalo se proto, že exogenm podávání nervového růstového faktoru nebo dalších neurotropních proteinů jako je růstový faktor mozkového původu, růstový faktor gliálního původu, ciliámí růstový faktor a neurotropin-3 u pacientů s touto nemocí prodlouží dobu přežívání degenerovaných skupin neuronů.

Klinické využití těchto proteinů v řadě neurologických onemocnění je omezeno špatnou biologickou přístupností velkých molekul proteinů a jejich obtížnému cílenému dodávání do příslušné nervové tkáně. Naopak, imunosupresivní látky' s neurotropní aktivitou mají relativně malé molekuly a vykazují vynikající biologickou přístupnost a specifitu. Přesto, jsou li imunosupresanty podávány po dlouhou dobu, projevují se řadou potenciálně vážných vedlejších účinků včetně nefrotoxicity, jako je narušení glomerulámí ·· ···· filtrace ledvin a ireversibilní interstinální fibróza (Kopp et al., 1991, J. Am. Soc. Nephrol. 1:162), včetně neurologických deficiencí jako neovladatelný třes, nespecifická cerebrální angína, např. nelokalizovaná bolest hlavy (De Groen et al., 1987, N. Engl. J. Med. 317:861) a vaskulámí hypertenze včetně z ní vycházejících komplikací (Kahan et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:1725).

Tento vynález se zabývá jak imunosupresivními, tak neimunosupresivními sloučeninami s vlastnostmi inhibitorů cyklofilinu, obsahujícími malé molekuly inhibitorů rotamázové aktivity cyklofilinu, které jsou mimořádně účinné při zmnožování a rozšiřování ncuritů, při stimulaci růstu neuronů a při regeneraci různých neuropatologických situací, ve kterých lze obnovu neuronů uskutečnit Takovou situací může být zmnožování a rozšiřování neuritů, stimulace růstu neuronů a neuronální regenerace při: poškození nervu následkem fyzického zranění nebo chorobného stavu jako je diabetes s narušením periferních nervů, poškození motorických neuronů, poškození centrální nervové soustavy (míchy a mozku) včetně poškození spinálních neuronů a neuronů mozkových, poškození mozku jako následek mrtvice a dále léčení neurologických poruch, spojených s ncurodcgcncrací včetně Parkinsonovy nemoci a Alzheimerovy nemoci.

Podstata vynálezu

Tento vynález se týká způsobu použití neurotropních inhibitorů cyklofilinu, majících afinitu k imunofilinům typu cyklofilinu, jako inhibitorů enzymové aktivity spojené s imunofilinovými proteiny, obzvláště potom inhibitory pcptidyl-prolyl izomerázove nebo rotamázové aktivity enzymů.

Výhodným provedením vynálezu je způsob ovlivňování neurologické aktivity u zvířete, zahrnující:

podávání zvířeti účinného množství imunosupresivního cyklosporinu s obecným vzorcem I a jeho farmaceuticky přijatelných solí, ve kterém:

je MeBmt nebo (3-desoxyMeBmt) nebo je charakterizován vzorcem Til, přičemž v tomto vzorci polohy 2,3 a 4 mají vzájemnou konfiguraci S.RaR. kde -X-Y- jsou spojeny dvojnou vazbou nebo jednoduchou vazbou, ve kterém:

• · ····

R2 je nezávisle vybrané ze skupiny, zahrnující Abu, Ala, Thr, Val a norVal, je Sar, R.4 je MeLeu, R^ je Val, R^ je MeLeu, R^ je Ala, r8 jeD-Ala, R^ je MeLeu, R10 je MeLeu a R^ je Val nebo (D-MeVal).

ovlivňování neurologické aktivity u zvířete, zahrnující:

podávání zvířeti účinného množství neimunosupresivního cyklosporinu obecného vzorce IV, ve kterém:

R1 jeMeBmt nebo dihydro MeBmtnebo je charakterizován vzorcem ΙΠ, přičemž v tomto vzorci polohy 2,3 a 4 mají vzájemnou konfiguraci S, R a R, ve kterém -X-Y- jsou spojeny dvojnou vazbou nebo jednoduchou vazbou, ve kterém r2 je Abu nebo jeho fluorovaný analog, R^ je Sar, D-MeAla nebo jeho fluorovaný analog, je N-methylovaný zbytek aminové kyseliny s (Cj - C9) přímou nebo rozvětvenou alkylovou nebo alkenylovou skupinou, tyto přímé nebo rozvětvené alkylové nebo alkenylové skupiny mohou být substituovány cykloalkylcm (C3 - Cg), R1 může být také (C3 -Cg) cykloalkyl nebo (C5 - C7) cykloalkenyl, přičemž výše uvedené alkylové, alkenylové, cykloalkylové nebo cykloalkenylové skupiny mohou být substituovány (Cj - C4) alkylem nebo (Cj - C4) alkenylem nebo hydroxyskupinou, obzvláště tam. kde je MeLeu, MeVal, Mehomo-Ala nebo (Me-(a-methyl)Thr), R^ je Val nebo jeho fluorovaný analog, R^ je MeAla, MeAbu nebo jeho fluorovaný analog, R? je Ala nebo jeho fluorovaný analog, R& je (a) D-Ala nebo jeho fluorovaný analog nebo (b) O-acyl-D-Ser nebo O-acyl-D-Thr, ve ktrem je acylová skupina definována jako R12 -CO-, přičemž RÍ2 znamená vodík, Cj_ 5 alkyl, fenyl nebo substituovaný fenyl vzorce V, ve kterém a jsou nezávisle na sobě (a) Cj _ 6 alkyl, (b) Cj _ galkoxy, (f) -NH₂, (g) -NO₂, (h)-COOH, (i)-COOCj _ ₆ alkyl nebo (j) -H, R^a Rl° jsou vzájemně nezávisle MeLeu nebo jeho fluorované analogy a R^ je MeVal nebo jeho fluorované analogy.

Dalším výhodným provedením vynálezu je způsob léčení neurologické poruchy u zvířete, zahrnující:

podávání zvířeti účinného množství inhibitoru cyklofilinu, majícího afinitu k imunofilinům typu cyklofilinu pro stimulaci růstu růstu poškozených ·· 9 •9 ···· periferních nervů a pro zesíleníregenerace neuronů, přičemž imunofilin typu cyldofilinu vykazuje rotamázovou aktivitu a derivát cyklosporinu tuto rotamázovou aktivitu imunofilinu inhibuje.

Dalším výhodným provedením vynálezu je způsob léčení neurologické poruchy u zvířete, zahrnujíc:

podávání zvířeti účinného množství inhibitoru cyklofilinu, majícího afinitu k imunofilinům typu cyklofilinu v kombinaci s účinným množstvím neurotropního faktoru vybraného ze skupiny, zahrnující neurotropní růstový faktor, růstový faktor mozkového původu, růstový faktor gliálního původu, ciliámí neurotropní faktor a neurotropin-3 pro stimulaci růstu poškozených periferních nervů nebo k zesílení regenerace neuronů, přičemž imunofilin typu cyklofilinu vykazuje rotamázovou aktivitu a derivát cyklosporinu tuto rotamázovou aktivitu imunofilinu inhibuje.

Dalším výhodným provedením vynálezuje způsob stimulace růstu poškozených periferních nervů, zahrnující:

dodávání do poškozených periferních nervů účinného množství inhibitoru cyklofilinu, majícího afinitu k imunofilinům typu cyklofilinu pro stimulaci nebo zesílení růstu poškozených periferních nervů, přičemž imunofiliny typu cyklofilinu vykazují rotamázovou aktivitu a derivát cyklosporinu tuto rotamázovou aktivitu imunofilinu inhibuje.

stimulace růstu poškozených periferních nervů, zahrnující:

dodávání do poškozených periferních nervů účinného množství inhibitoru FKBP, majícího afinitu k imunofilinům typu cyklofilinu pro stimulaci růstupoškozených periferních nervů, přičemž imunofilin typu cyklofilinu vykazuje rotamázovou aktivitu a derivát cyklosporinu tuto rotamázovou aktivitu imunofilinu inhibuje.

Dalším výhodným provedením podle tohoto vynálezu je způsob zesílení neuronální regenerace a růstu neuronů u zvířat, zahrnující:

·· ···· • · · · · ♦ · w ♦· • ··*· ♦ ♦· • · ·· • ·· · · ··

podávání zvířeti účinného množství inhibitoru cyklofilinu, majícího afinitu k imunofilinům typu cyklofilinu pro zesílení neuronální regenerace, přičemž imunofíliny typu cyklofilinu vykazují rotamázovou aktivitu a derivát cyklosporinu tuto rotamázovou aktivitu imunofilinu inhibujc.

Dalším výhodným provedením podle tohoto vynálezu jc způsob prevence neurodegenerace u zvířete, zahrnující:

podávání zvířeti účinného množství inhibitoru cyklofilinu, majícího afinitu k imunofilinům typu cyklofilinu k prevenci neurodegenerace, přičemž imunofíliny typu cyklofilinu vykazují rotamázovou aktivitu a derivát cyklosporinu tuto rotamázovou aktivitu imunofilinu inhibujc.

Popis obrázků na výkresech

Obrázek 1 křivka závislosti odezvy na dávce pro cyklosporin A. Ukazuje typickou dávku pro cyklosporin A (ED50), pomocí které je dosaženo 50 % maximální odezvy. Tato dávka odpovídá 50 nM.

Nové neurotropní inhibitory podle tohoto vynálezu mají afinitu k proteinu, vázajícímu cyklosporin, tedy k cyklofilinu. Bylo zjištěno, že jsou-li neurotropní sloučeniny podle vynálezu vázány na cyldofilin, inhibují prolyl-peptidyl cis-trans izomerázovou aktivitu nebo rotamázovou aktivitu navázaného proteinu a přitom neočekávaně stimulují růst neuritů.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být používány ve formě solí, odvozených od anorganických nebo organických kyselin nebo zásad. Takovými solemi, odvozenými od kyselin jsou: acetát, adipát, alginát, aspartát, benzoát, benzensulfonát, bisulfátobutyrát, citrát, kamphorát, kamphorsulfonát, cyklopentanpropionát, diglukonát, dodecylsulfát, ethansulfonát, fumarát, glukoheptanoát, glycerofosfát, hemisulfátoheptanoát, hexanoát, hydrogenchlorid, hydrogenbromid, hydrogeniodid, 2hydroxyethansulfonát, laktát, maleinát, methansulfonát, 2-naftalensulfonát, nikotinát, oxalát, palmitát, pektinát, propionát, sukcinát, tartarát, thiokyanát, tosylát a undckanoát. Solemi, odvozenými od zásad jsou: amonné soli, soli alkalických kovů jako jsou soli sodné a draselné, soli kovů alkalických zemin, ···« • · · ·· • · · 99 • ·♦·· · é· ♦ · · · ···· 999

9999 *! · •♦ · ♦ • · 9 · • · např. soli vápenaté a hořečnaté, soli s organickými zásadami, např. soli dicyklohexylaminu,N-methyl-D-glukaminu a soli s takovými aminokyselinami, jako je arginin, lysin a tak dále. Mimoto zásadité, dusík obsahující skupiny mohou být kvartcmizovány takovými činidly, jako jc nižší alkyíhalogenid, např. methyl-, ethyl-, propyl- a butylchlorid, dále bromidy a iodidy, dialkylsulfátyjakodimethylsulfát, diethylsulfát, dibutylsulfát a diamylsulfát, alkylhalidy s dlouhým řetězcem jako decylchlorid, laurylchlorid, myristylchlorid, stearylchlorid a stejné bromidy a iodidy, dále aralkylhalogenidy jako benzyl a fenethylbromid a další. Získají se tak ve vodě nebo v oleji rozpustné nebo dispergovatelné produkty.

Neurotropní sloučeniny podle vynálezu mohou být periodicity podávány pacientům, kteří se podrobují léčbě neurologické poruchy nebo z jiných důvodů, kdy je žádoucí stimulovat neuronální regeneraci a růst neuronů, například v případech různých periferních neuropatií a neurologických poruch, spojených s neurodegenerací. Sloučeniny podle vynálezu mohou být také podávány jiným savcům než je člověk za účelem léčby některých savčích neurologických poruch.

Nové sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou účinnými inhibitory rotamázové aktivity a vykazují vynikající úroveň neurologické aktivity. Tato aktivita je využitelná pro stimulaci poškozených neuronů, pro zesílení neuronální regenerace, pro prevenci neurodegenerace, pro stimulaci růstu poškozených periferních narvu, pro stimulaci a růst poškozených neuronů v míše a pro stimulaci růstu motorických nervů. Tato aktivita je také využitelná při léčbě některých neurologických poruch o nichž je známo, že jsou spojeny s neuronální degenerací a periferními neuropatiemi. Mezi neurologické poruchy, které mohou být takto léčeny patří napříkladtrigeminální neuralgie, glossofaryngeální neuralgie, Bell - Palsyho těžká myastenie, muskulámí dystrofie, progresivní muskulámí atrofie, progresivní dědičná bulbámí svalová atrofie, výhřez, syndromy zablokované nebo uvolněné meziobratlové plotcnky, ccrvikální spondylóza, poruchy pletení, syndromy destrukce torakálního výstupu, periferní neuropatie například způsobené intoxikací olovem, dapsonem, infekcí přenášenou klíšťaty, porfyrií nebo syndrom Gullain-Barré, Alzheimerova nemoc a Parkinsonova nemoc.

Pro tyto účely mohou být látky podle vynálezu podávány orálně, parenterálnč, s využitím inhalačního sprayc, topicky, rektálně, nasálnč, bukálně, vaginálně nebo pomocí implantovaného rezervoáru s využitím

konvenčních netoxických farmaceuticky přijatelných nosičů, adjuvans a vehikul. Pojem parenterálně zde zahrnuje podání pomocí subkutánní, intravenózní, intramuskulámí, intraperitoneální, intrathekální, intravcntrikulámí, intrastcnální a intrakraniální injekce neboinfuzní techniky.

Vzhledem ktomu, že cílovým působištěm komplexu imunofilin-léčivo je centrální nervová soustava, měl by komplex pro dostatečný terapeutický účinek, je-li podán periferní cestou, snadno procházet rozhraním krev - mozek Sloučeniny podle vynálezu, které nemohou prostupovat rozhraním krev mozek mohou být účinně podávány cestou intraventrikulámí.

Farmaceutické kompozice mohou být ve formě sterilních přípravků pro injekční podávání, například jako sterilní injekční, vodné nebo olejové suspenze. Taková suspenze může mít složení, odpovídající postupům podle dosavadního stavu technik}' za použití vhodných disperzních nebo zvlhčujících činidel nebo suspendačních činidel. Sterilním injekčním přípravkem může být také sterilní injekční roztok nebo suspenze v netoxickém parenterálně přijatelném zředovadle nebo rozpouštědle, například jako roztok v 1,3-butandiolu. Dalšími vehikuly a rozpouštědly, která mohou být využita jsou voda, Ringerův roztok a izotonický roztok chloridu sodného. Jako rozpouštědla a suspendační media mohou být dále běžně používány sterilní stálé oleje. Každý stálý, nedráždivý olej může být pro tento účel použit, a to včetně syntetických mono- a diglyceridů. Použití zde nacházejí takové mastné kyseliny jako kyseliny olejová a její glyceridy, dále pak olivový olej a ricinový olej a to především v podobě jejích polyoxyethylderivátů. Tyto olejové roztoky nebo suspenze mohou také jako zředbvadlo nebo dispergační činidlo obsahovat alkohol s dlouhým řetězcem.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být podávány orálně ve formě tobolek nebo tablet, nebo například jako vodná suspenze či roztok Tablety pro orální použití mohou jako nosič používat známý a běžně používaný obilný škrob nebo laktózu. Obyčejně se také přidávají lubrikační činidla jako stearát horečnatý. Pro orální podávání ve formě tobolek zahrnují používaná zřeďovadla laktózu a sušený obilný škrob. Je-li pro orální použití vyžadována vodná suspenze, jsou aktivní složky podávači formy kombinovány s emulgačními a suspendačními činidly. Je-li to žádoucí, mohou se přidávat také sladidla a/nebo ochucovadla a/nebo barviva.

• · ♦

Sloučeniny podle vynálezu mohou být také upraveny do podoby čípku pro rektální podávání léčiv. Takové kompozice mohou být připraveny směšováním léčiva s vhodným nedráždivým excipientem který je pevný při pokojové tcplotč ale kapalný při teplotě tělesné, takže při aplikaci taje za uvolňování léčiva. Takovým excipientem může být kakaové máslo, včelí vosk a polyethylenglykoly.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být podávány také topicky, obzvláště když konkrétní okolnosti léčení zahrnují plochy nebo orgány snadno přístupné topickou aplikací. Jde například o léčení neurologických poruch oka, kůže nebo dolní části intestinálního traktu. Vhodná topická podávači složení jsou pro každou z těchto aplikací zřejmá.

Pro oftalmická použití mohou být sloučeniny podle vynálezu upravena do podoby mikrosuspenzí v izotonickém sterilním solném roztoku s nastavenou hodnotou pH. Přednostně do podoby roztoku v izotonickém sterilním solném roztoku s nastavenou hodnotou pH a to bez nebo s konzervační přísadou jako je benzylalkoniumchlorid. Alternativně mohou být sloučeniny podle vynálezu pro oftalmické použití být vpraveny do masti jako je petrolatum.

Pro topické použití na kůži mohou být sloučeniny vpraveny do vhodné masti, obsahující tyto sloučeniny buď suspendované nebo rozpuštěné. Základem masti může být směs nebo jedna látka z následujících: minerální olej, kapalné petrolatum, bílé petrolatum, propylenglykol, deriváty polyoxyethylenu a polyoxypropylenu, emulgovateíný vosk a voda. Sloučeniny podle vynálezu také mohou být upraveny do podoby pleťové vody nebo krému, ve kterém jsou aktivní sloučeniny suspendovány nebo rozpuštěny v jedné z následujících látek nebo v jejich směsi: minerální olej, monostearát kyseliny sorbové, polysorbát 60, cetylesterový vosk, cetearylalkohol, 2-oktyldodekanol, benzylalkohol a voda.

Topická aplikace k ovlivnění dolní části intestinálního traktu může být realizována formou rektálního čípku (viz výše) nebo pomocí vhodné injekční formy intestinální cestou.

Použitelné dávky aktivní sloučeniny leží při léčení za výše uvedených podmínek v intervalu mezi asi 0,1 mg až asi 10 000 mg, přičemž výhodné dávky se pohybují mezi asi 0,1 mg dio 1000 mg. Velikost dávky aktivní složky, která může být kombinována s nosičovými materiály za účelem vytvoření

• φ φ

jednoduché dávkové formy se bude měnit v závislosti na ošetřovaném subjektu a zvláštních podmínkách podávání.

Je však samozřejmé, že specifická výše dávky pro konkrétního pacienta bude záviset na řadě faktorů včetně věku pacienta, jeho tělesné hmotnosti a jeho celkovém zdravotním stavu, dále na pohlaví, stravovacích zvyklostech, době podávání, vylučovacím poměru, kombinaci podávaných léčiv, závažnosti léčeného onemocnění, formě podávám a na aktivitě aplikované sloučeniny.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být podávány společně s dalšími látkami s neurotroní aktivitou jako je například neurotropní růstový faktor, růstový faktor mozkového původu, ciliámí neurotropní faktor a neurotropin-3. Úroveň dávky těchto dalších neurotropních látek bude záviset na již uvedených faktorech a na neurotropní účinnosti konkrétní kombinace látek.

Metody a stanovení

Prodlužování nervu kuřecího dorsálního kořenového ganglionu, vyvolané cyklofilinovými ligandy

V této studii jsme za účelem demonstrování silného neurotropního účinku cyklofilin vázajících sloučenin sledovali explantovaná kuřecí dorsální kořenová ganglia. Maximální vzrůst co do počtu, délky a rozvětvování je při nejúčinnějších koncentracích (100 ng/ml) velmi podobný jak pro cyklofilinové ligandy, tak pro nervový růstový faktor. S rychle rostoucími koncentracemi látek je možno pozorovat větší počet, mohutnější rozvětvování a větší délku narůstajících nervů.

U jednotlivých látek jsme vyhodnotili schopnost vázat sek cyklofilinu A prozkoumáním jejich schopnosti inhibovat peptidyl-prolyl izomerázovou aktivitu (tabulka 1). Zjistili jsme překvapující paralelu mezi schopností látek stimulovat narůstání neuritů a schopností inhibovat rotamázovou aktivitu.

Z velmi úzké korelace mezi schopností látek vázat se na imunofiliny za inhibice jejich rotamázové aktivity a mezi jejich schopností stimulovat narůstání neuritů vyplývá, že inhibice rotamázové aktivity jc odpovědná za neurotropní účinky těchto látek Z mimořádně vysoké schopnosti látek

stimulovat narůstání neuritů a ze schopnosti vázat se na cyklofiliny vyplývá, že je nanejvýše nepravděpodobné, aby se na neurotropních účincích těchto látek podílel ještě další mechanismus.

Na základě mimořádné účinnosti a úzké korelace mezi inhibící rotamázové aktivity a neurotropní aktivitou těchto látek jsme došli k závěru, že inhibice rotamázové aktivity cyklofílinu je pravděpodobně jedním z projevů neurotropních účinků.

Neurotropní aktivita zde sledovaných látek se projevuje při mimořádně nízkých koncentracích, což naznačuje účinnost srovnatelnou s účinností takových neurotropních proteinů jako je růstový faktor mozkového původu, neurotropin-3 a neurotropní růstový faktor.

Následující příklady provedení ilustrují výhodná provedení vynálezu a nejsou zde uvedeny proto, aby vynález omezovaly. Všechny molekulové hmotnosti polymerů představují průměrnou molekulovou hmotnost Všechny procentní údaje uvádějí procenta hmotnostní, vztažené ke hmotnosti finálního podávacího systému nebo podávači formy, pokud není uvedeno jinak, přičemž součet všech složek odpovídá 100 % hmotnostním.

Ilustrativními inhibitory cyklofílinu, které mohou být využity pro účely tohoto vynálezu, aniž by se však na ně vynález omezoval, obsahují následující.

Cyldosporiny obecného vzorce I, zahrnující cyklické peptidy které obsahují 11 aminokyselin:

R³ ;,8_ _R7---R⁶— _R5_r4 vzorec I

Přesněji přirozeně se vyskytující cyklosporiny, jejichž obecná struktura je vyjádřena vzorcem II a je včleněna do tohoto vynálezu.

·· «···

11 1

MeLeu —— MeVal MeC

MeLeu

• ·	•	·· «··«	* «	♦ ·
Φ ·	•	• · ·	• · ·	9
•	• ·	• · ·	• ·	• ·
•	····	• · · ·	« ··· Φ	9
•	•	• · ·	• ·	9
••2	•	·· ♦ 3	··	99

— A-- Sar (DJAJa---Ala

MeLeu--Val — MeLeu 4

Θ 7 vzorec II ve kterém MeCy představuje takzvaný Cp-aminokyselinový zbytek vzorce II (také známý jako MeBmt = (4R)U-((E)-2-butenyl)U-methyl-L-threonHi):

ve kterém polohy 2,3 a 4 mají vzájemnou konfiguraci S, R a R, -X-Yje-CH-CH-(trans):

ve kterém

Me = methyl

Abu = a-kyselina aminomáselná

Val - valin norVal - norvalin

Ala = alanin

MeLeu = N-methyl-leucin

MeVal » N-methyl-valin ·· ····

Sar = sarkosin (3-desoxyMeBmt) - MeBmt, kde v poloze 3 není obsažen atom kyslíku.

Pokud není uvedeno jinak, má aminokyselina konfiguraci L:

a Aje pro cyklosporin A, -Abupro cyklosporin B, -Alapro cyklosporin C, -Thrpro cyklosporin D, -Val- a pro cyklosporin G, -norVal-, přičemž všechny jsou zde uvedeny s odkazem na předcházející reference. Další známé přirozeně se vyskytující cyklosporiny jsou odvozeny od výše uvedeného cyklosporinu A náhradou jedné aminokyseliny, a to pro cyklosporin E je v poloze 11 Val, pro cyklosporin F je v poloze 1 (3-desoxyMeBmt) a pro cyklosporin H je v poloze 11 (D-MeVal), přičemž všechny jsou zde uvedeny s odkazem na předcházející reference.

V následující diskusi všechna uváděná čísla poloh ve strukturním vzorci cyklofilinu náleží ke vzorci 11. Jak je v oboru běžné, mohou být specifické analogy cyklosporinu pojmenovány za použití systému číslování poloh s krátkou poznámkou, která identifikuje, jak se cyklosporinový analog odlišuje od cyklosporinu A. Tedy (MeVal)^-CsA znamená cyklosporin, vc ktcrcm McLcu u cyklosporinu A (vzorce II) byl nahrazen MeVal, a tak dále.

V případě dihydrogencyklosporinů znamená -X-Y- ve vzorci ΙΠ - CH2 - CH2 -. To znamená, že dihydrogencyklosporin A, dihydrogencyklosporin C a všechny ostatní dihydrogenanalogy přirozeně se vyskytujících, stejně jako semisyntctických a syntetických cyklosporinu jsou součástí vynálezecké myšlenky a spadají do rozsahu tohoto vynálezu.

Vedle těchto známých cyklosporinů a jejich dihydrogenderivátů bylo připraveno mnoho přirozeně se nevyskytujících cyklosporinů, které byly «» · • · · • · · * ··♦· • · ···< · ··· · •· • ·· ♦ ♦ ·· • ·· ♦ · ♦ ·· ·· • · ·* • · ·· • ····· • *· ·· ·♦ připraveny synteticky, a to buď totální syntézou nebo syntetickým modifikováním přirozeně se vyskytujících materiálů, nebo pomocí technik modifikační kultivace. Tyto syntetické a semisyntetické analogy či deriváty cyldosporinu jsou velice silnými inhibitory rotamázovc aktivity cyklofilinů a proto jsou pokládány za specifické ztělesnění vynálezecké myšlenky, spadající do rozsahu tohoto vynálezu. Takovými modifikovanými cyklosporiny jsou, avšak bez jakéhokoliv omezení, následující látky.

Cyklosporiny s modifikovanými Cg aminokyselinami. Takové modifikované cyklosporiny jsou známé z patentů US 4 885 276 a US 4 798 823 (Witzel), na které se odkazujeme.

Cyklosporiny s modifikovanými zbytky v poloze 8 jako např. (dehydro-Ala) 8-CsA a cyklosporiny, které mají v poloze 8 síru obsahující aminokyselinu. Takové cyklosporiny jsou známé z patentů US 5 122 511 a US 5 214 130 (Patchctt a kol.), na které se odkazujeme.

Cyklosporiny, ve kterých je aminokyselinou v poloze 8 (D)-acyloxy-aaminokyselinový zbytek, jak jsou známy z patentu US 4 764 503 (Wenger), na který se odkazujeme.

Cyklosporiny, mající v poloze 8 a-hydroxykarboxylovou kyselinu, jak jsou popsány Dreyfussem v patentu US 5 116 816, na který se odkazujeme.

Cyklosporiny obsahující jednu nebo více fluorovaných aminokyselin, jak jsou například popsány Durettem a kol. v patentu US 5 227 467, na který se odkazujeme.

Cyklosporiny, které v poloze 3 obsahují opticky aktivní, Nmethylovaný a-aminokyselinový zbytek v konfiguraci (D), jak jsou známy z patentu US 4 703 033 (Seebach), na který se odkazujeme.

Cyklosporiny, které v poloze 2 obsahují zbytek allyl-Gly a/nebo v poloze 8 zbytek -(D)-Ser, jak jsou známy z patentu US 4 384 996 (Bollinger a kol.), na který se odkazujeme.

Vedle výše uvedených cyklosporinů a cyklosporinových analogů, které vykazují vlastnosti inhibitorů cyklofilinů a imunosupresivní aktivitu, je záměrem tohoto vynálezu poskytnout způsob použití neimunosupresivních cyklosporinových analogů jako neurotropních činidel. Takové neimunosupresivní cyklosporinové analogy se váží na cyklofilin, inhibují jeho ·· ··· · rotamázovou aktivitu bez vyvolání imunosupresivního účinku, a jsou silnými neurotropními činidly.

Následující strukturní vzorec IV ilustruje takové látky, není však jeho smyslem jakýmkoliv způsobem omezovat rozsah ochrany vynálezu.

vzorec TV ve kterém řU je MeBmt nebo dihydrogenMeBmt, je Abu nebo její fluorovaný analog,

R~ jeSar, D-MeAla nebo jejich fluorovaný analog, je N-methylovaný aminokyselinový zbytek s alkylovou nebo alkenylovou (Cj- C9) skupinou s přímým nebo rozvětveným řetězcem, přičemž tyto přímé nebo rozvětvené alkylové nebo alkenylové skupiny mohou být dále substituovány (C3-C8) cykloalkylem, může být také (C^-Cg) cykloalkyl nebo (C5 - C7) cykloalkenyl a výše uvedené skupiny alkylové, alkenylové, cykloalkylovc nebo cykloalkcnylovó mohou být dále substituovány (Cj - C4) alkylem nebo (Cj - C4) alkenylem nebo hydroxyskupinou.

a jsou nezávisle na sobě MeLeu nebo jeho fluorovaný analog, r5 je Val nebo jeho fluorovaný analog ,

RÓ jeMeAla, MeAbu nebo jejich fluorovaný analog ,

R? je Ala nebo jeho fluorovaný analog , r8 je (a) D-Ala nebo jeho fluorovaný analog nebo • Φ φφφφ (b) O-acyl-D-Ser nebo O-acyl-D-Thr, přičemž acylová skupina je definována jako R¹²-CO-, kde R¹² znamená vodík, alkyl, fenyl nebo substituovaný fenyl vzorce V:

-a:

v ve kterém χΐ a X² jsou nezávisle (a) Ci_6 alkyl (b) Ci_5 alkanoyl (c)CH (d) halogen (e) Ci_palkoxy φ -nh₂ (g)-NC^ (h)-COOH (i) -COOCj-6 alkyl nebo

Φ -H

Zvláště výhodné jsou takové cyklosporinové analogy, ve kterých

R1 je MeBmt nebo dihydrogenMeBmt

R² jeAbu jeSarnebo D-MeAla

R^ jeMeLeu, MeVal, Mehomo-Ala nebo (Me-(a-methyl)Thr) a RlO jsou vzájemně nezávisle MeLeu nebo jeho fluorovaný analog

R^ jc Val nebo jeho fluorovaný analog

RČ jeMeAla, MeAbu nebo jejich fluorovaný analog

R^ je Ala • · · • ··

r8 je D-Ala a rH je MeVal nebo jeho fluorovaný analog.

Fluorované analogy představují aminokyselinové zbytky, ve kterých jedna nebo více vazeb C-H v postranním řetězci je nahrazena vazbou C-F. Například fluorovaný analog Abu znamená

X4. Č X3

X5 přičemž Xj až X5 jsou nezávisle na sobě vodík nebo fluor s tou podmínkou, žc alespoň jeden z Χμ X2> X3, X4 a X5 je fluor.

Známými deriváty a analogy cyklosporinů o kterých je známo, že jsou silnými inhibitory rotamázové aktivity cyklofilinů, aniž by vykazovaly imunosupresivní účinky jsou analogy, modifikované v poloze 6, popsané Dumontem a kol. v patentu US 4 914 188 a Durettem v patentu US 5 236 899, na které se odkazujeme. Jinými známými neimunosupresivními analogy cyklosporinů jsou N-alkylované (Val)^ deriváty jako je (MeVal)^ - CsA, popsané Flirim a kol. v publikaci Annal. N. Y. Acad. Sci 696,47,1993, na kterou se odkazujeme. Dalšími deriváty s pozměněným postranním řetězcem u zbytku v poloze 4 jsou popsány Pápageorgiou a kol. v publikaci JBioMed. Chem. Lett. 1994,2, 267-272, na kterou se odvoláváme.

Provedení testu Kj

Inhibici peptidyl-prolyl izomerázové (rotamázové) aktivity cyklofilinů sloučeninami podle vynálezu je možno vyhodnocovat pomocí metod, popsaných v literatuře (Harrison a Stein, Biochemistry, 1990, 29, 3813-3816). Takto získané hodnoty představují zdánlivé K4 a pro některé z příkladů 1-30 jsou uvedeny v tabulce I. Průběh cis-trans izomerizace vazby alanin-prolin v modelovém substrátu, kterým je N-sukcinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilid byl sledován spektrofotometricky s využitím chymotrypsinové metody, při které chymotrypsin uvolňuje para-nitroanilid v substrátu pouze z transizomeru. Byla stanovována mha inhibice této reakce v závislosti na koncentraci přidávaného • 4 ···· • · ··

4· • ·· ··· ··

44 • 4·· inhibitoru a získaná data byla analyzována ve smyslu konstanty reakce prvního řádu a to jako funkce koncentrace inhibitoru, čímž byly získány hodnoty zdánlivé konstanty Kj. Na spektrofotometru byla sledována změna absorbance při vlnové dclcc 390 nm proti času po dobu 90 sekund a ze získané závislosti absorbance - čas byly získány hodnoty konstant.

Údaje z těchto experimentů jsou uvedeny v tabulce I.

Tabulka I

příklad inhibice	cyklosporin	Kf cyklofilin
1	CsA	20 nM
0	dihydrogen-CsA	100 nM
3	(dehydrogen-Ala)^ -CsA	75 nM
4	(MeVal)⁴ -CsA	10 nM
5	(Me-homoAla)⁴ -CsA	24 nM
6	(Me-(a-methyl)Thr)⁴ CsA	18 nM

Kultury kuřecího dorsálního kořenového ganglionu a narůstání neuritů

Dorsální kořenová ganglia byla disektována z kuřecích embryí v desátém dni gestace. Celé explantáty ganglionu byly kultivovány na tenkovrstvých, matrigelem pokrytých deskách o dvanácti jamkách s Liebovitzovým mediem L15 s vysokým obsahem glukózy, doplněným 2mM glutaminu a 10% fetálním telecím sérem, obsahujícím také 10 μΜ cytosin 0-D-arabinofuranosidu (Ara C) při teplotě 37 °C a v prostředí, obsahujícím 5 % oxidu uhličitého. Po čtyřiadvaceti hodinách byly explantáty ošetřeny různými koncentracemi cyklosporinových látech. Po dalších osmačtyřiceti hodinách byla ganglia vizualizována metodou fázového kontrastu nebo metodou Hoffmanova modulačního kontrastu pomocí invertního mikroskopu Zeiss Axiovert Byly vyhotoveny fotomikrografie explantátú a růst neuritů byl kvantifikován. Do celkového počtu byly zahrnuty pouze neurity, delší než průměr dorsálního kořenového ganglionu, přičemž kvantifikace byla ·· · • · · • · · • ···· • · ···· ♦ ··· ·· · • · · • · · • · · · • · · ·· ·»

··	··
•	•	•
•	•	··
···	•
• ··	• ··

provedena pro všechny experimentální podmínky jednotlivě. V každé jamce byly kultivovány tři až čtyři dorsálm kořenové gangliony a každý experiment byl proveden duplicitně.

Výsledky těchto experimentů jsou uvedeny v tabulce Π. S přihlédnutím k obrázku 1 odpovídá dávka ED50 pro cyklosporin A dávce, při které je dosaženo poloviny maximální odezvy. Tato hodnota byla získána z křivky závislostí odezvy na dávce (typickým příkladem je právě obrázek 1) a odpovídá hodnotě 50 nM. Relativní neurotropní účinnost ostatních sloučenin v tabulce H jc vztažena k cyklosporinu A, přičemž počet kladných znamének označuje relativní účinnost.

Tabulka Π příklad neurotropní účinnost +++ +

+ +++ +++ +++

Z výše uvedených údajů vyplývá, že sloučeniny které jsou inhibitory rotamázové aktivity cyklofilinů, a to bez ohledu na skutečnost zda jsou nebo nejsou imunosupresivní, podporují a zesilují narůstání neuritů v kulturách neuronu a vykazují maximální účinky, srovnatelné se samotným nervovým růstovým faktorem.

Z vynálezu jak je zde popsán vyplývá, že řešení může být mnoha způsoby obměňováno. Takové obměny však nevybočují z vynálezecké myšlenky vynálezu, neboť leží v rozsahu tohoto vynálezu, jak je uvedeno v následujících patentových nárocích.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použiti neimunosupresivního cyklosporinů pro výrobu léčiva pro ovlivňování neurologické aktivity u zvířete, kdy neimunosupresivní cyklosporin má vzorec IV

R10 --- R11---R1---R2--R3

R9

R8--- R7---R6 ---R5 R4

IV ve kterém R1 je MeBmt nebo dihydro MeBmt nebo je představován vzorcem III

CHj

I X ^-CHi

HO CH

--N--CH--CO-CHj ve kterém polohy 2, 3 a 4 mají vzájemnou konfiguraci S, R a R, přičemž -X-Yjsou spojeny dvojnou vazbou nebo jednoduchou vazbou a .1c

R² je Abu nebo její fluorovaný analog,

R² je Sar, D-MeAla nebo jejich fluorovaný analog,

R4 je N-methylovaný zbytek aminokyseliny s alkylovou nebo alkenylovou skupinou s přímým nebo rozvětveným řetězcem (Cj - C9), přičemž tyto přímé nebo rozvětvené alky lově nebo alkenylové skupiny mohou být substituovány cykloalkylem (C3 - Cg), R¹ může být také (C3 - Cg) cykloalkyl nebo (C5 - C7) cykloalkenyl a výše uvedené alkylové, alkenylové, cykloalkylové nebo cykloalkenylové skupiny mohou být substituovány (Cj - C4) alkylem nebo (Ci - C4) alkenylem nebo hydroxyskupinou,

R5 je Val nebo jeho fluorovaný analog,

R6 je MeAla, MeAbu nebo jejich fluorovaný analog,

R7 je Ala nebo jeho fluorovaný derivát,

R8 je (a) D-Ala nebo jeho fluorovaný analog nebo (b) O-acyl-DSer nebo O-acyl-D-Thr, kde acylová skupina je definována jako Rl² -CO- ve kterém Rl² představuje vodík, Cj_5 alkyl, fenyl nebo substituovaný fenyl obecného vzorce V ,___, ve kterém χΐ a X² jsou vzájemně nezávisle (a) Ci_6 alkyl, (b) Ci alkanoyl, (o) CH₂O, (d) halogen, (e) Ci _6 alkoxy, (f) -nh₂, (g) -NO₂, (h) -COOH, ♦4 <* ·· • * (i) -COOCi-6 alkyl nebo

0) Ή

R⁹ a R10 jsou vzájemně nezávisle MeLeu nebo jeho fluorovaný analog a

Rll je MeVal nebo jeho fluorovaný analog.
2. Použití podle nároku 1, ve kterém R^ je MeLeu, MeVal, Me homoAla nebo (Me-(a-methyl)Thr).
3. Použití podle nároku 1, ve kterém neurologickou aktivitou je stimulace poškozených neuronů.
4. Použití podle nároku 1, ve kterém neurologickou aktivitou je stimulace růstu poškozených periferních nervů.
5. Použití podle nároku 1, ve kterém neurologickou aktivitou je stimulace růstu poškozených neuronů v míše.
6. Použití podle nároku 1, ve kterém neurologickou aktivitou je stimulace růstu motorických neuronů.
7. Použití podle nároku 1, ve kterém neurologickou aktivitou je zesílení neuronální regenerace.
8. Použití podle nároku 1, ve kterém neurologickou aktivitou je prevence neuronální degenerace.
9. Použití podle nároku 1, ve kterém neurologickou aktivitou je léčba neurologických poruch.
10. Použití podle nároku 1, ve kterém neurologickou poruchou jsou periferní neuropathie způsobené fyzickým zraněním nebo chorobným stavem.
11. Použití podle nároku 1, ve kterém neurologickou poruchou je fyzické poškození mozku.
12. Použití podle nároku 1, ve kterém neurologickou poruchou je fyzické poškození míchy.
13. Použití podle nároku 1, ve kterém neurologickou poruchou je poškození mozku jako následek mrtvice.
14. Použití podle nároku 1, ve kterém neurologická porucha je důsledkem neuronální degenerace.
15. Použití podle nároku 1, ve kterém neurologickou poruchou je Alzheimerova nemoc.
16. Použití podle nároku 1, ve kterém neurologickou poruchou je Parkinsonova nemoc.
17. Použití podle nároku 1, zahrnující dále neurotropní faktor v množství, dostačujícím pro ovlivňování neurologické aktivity
18. Použití podle nároku 17, ve kterém neurotropní faktor je vybrán ze skupiny, zahrnující nervový růstový faktor, růstový faktor gliálního původu, růstový faktor mozkového původu, ciliární neurotropní faktor a neurotropin-3.
19. Použití podle nároku 1, ve kterém cyklosporinem je cyklosporin A.
20. Použití podle nároku 19, ve kterém R.4 je vybrán ze skupiny MeVal, Me(homo-Ala) a Me-(a-methyl)Thr.

·· • ·· ···· ·· ·· • · • • · · • · • • • • · - - · · · • · ·· • ···· • · · · • ··· • • • • ♦ · · • • • • ••r • • e · ·· ··